金黃色葡萄球菌rep-PCR指紋圖譜分型技術(shù)反應(yīng)條件的優(yōu)化

林 琳，王 晶

(大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 遼寧 大連 116011)

金黃色葡萄球菌分型方法可分為表型分型和基因分型，隨著分子生物學(xué)理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷完善，基因分型技術(shù)在判斷院內(nèi)感染爆發(fā)流行，了解菌株間的相關(guān)性，確定傳染源與流行趨勢(shì)方面具有重要的意義并被廣泛使用[1]。rep-PCR即重復(fù)序列引物聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)是根據(jù)基因組中的重復(fù)序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增重復(fù)序列間的片段，通過電泳產(chǎn)生的特異性指紋圖譜鑒別細(xì)菌基因組間的差異[2]。主要的重復(fù)片段主要分為基因外回文序列(rep)和腸桿菌科基因間重復(fù)序列(ERIC)兩種。這種新方法相對(duì)于“金標(biāo)準(zhǔn)”的脈沖場(chǎng)電泳，操作簡(jiǎn)單易行，在實(shí)驗(yàn)室可廣泛應(yīng)用。但其結(jié)果的重復(fù)性和指紋圖譜的清晰程度與實(shí)驗(yàn)條件密切相關(guān)。本研究針對(duì)兩種不同的實(shí)驗(yàn)引物，以及引物濃度和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，以期得到最佳的指紋圖譜。

1 材料和方法

1.1 材 料

金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923(本室保藏)；細(xì)菌基因組提取試劑盒、溶菌酶(北京天根生化科技有限公司)；Taq 酶、maker及PCR相關(guān)試劑(大連寶生物工程有限公司)；相關(guān)rep-PCR引物序列(引物rep：TCGCTCAAAACAACGACACC/引物ERIC-Ⅱ:AAGTAAGTGAGTGGGGTGAGCG)(均合成于大連寶生物工程有限公司)。

1.2 細(xì)菌基因組DNA的提取

接種菌株于LB培養(yǎng)基中，35 ℃搖床培養(yǎng)18～24 h，收集菌株于EP管中，加入100 U/mL溶菌酶 20 μL，37 ℃孵育破壁30 min以上，按照基因組DNA提取試劑盒操作說(shuō)明書提取，最后用100 mL TE buffer 洗脫，-20 ℃低溫保存。

1.3 rep-PCR擴(kuò)增引物的篩選

根據(jù)參考文獻(xiàn)[3-4],引物ERIC-Ⅱ及引物rep均可以用于rep-PCR的擴(kuò)增，其反應(yīng)體系均為：總反應(yīng)體系25 μL，DNA模板5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL, 25 mmol/L Mg2+2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL, 5 U/μL Taq酶 0.3 μL，100 pmol/μL引物ERIC-Ⅱ 0.2 μL，100 pmol/μL引物REP 0.25 μL，雙蒸水補(bǔ)足。

設(shè)定循環(huán)參數(shù)為95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃ 60 s，50 ℃ 60 s，72 ℃ 120 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.4 rep-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

以引物rep作為實(shí)驗(yàn)引物，在不同的引物濃度(0.8、1.0、1.2 pmol/μL)下進(jìn)行PCR檢測(cè)，其他條件一致，在不同的退火溫度下(35、40、45、50、55 ℃)進(jìn)行PCR檢測(cè)，其他條件一致。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)成像。

2 結(jié) 果

2.1 rep-PCR 引物的篩選

分別用引物ERIC-Ⅱ及引物rep對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923進(jìn)行擴(kuò)增，可見引物rep擴(kuò)增出的條帶數(shù)量和亮度均好于引物ERIC-Ⅱ，所以本實(shí)驗(yàn)選用引物rep作為擴(kuò)增金黃色葡萄球菌的引物，見圖1。

圖1 不同的引物進(jìn)行rep-PCR擴(kuò)增Fig 1 The rep-PCR products at different primer

2.2 rep-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

2.2.1 引物濃度的優(yōu)化：當(dāng)引物濃度分別為0.8 pmol/μL，1.0 pmol/μL，1.2 pmol/μL時(shí)，均可擴(kuò)增出較多的條帶，其中以濃度為1.0 pmol/μL時(shí)的條帶數(shù)量最多，亮度最強(qiáng)，終選擇引物濃度1.0 pmol/μL為最終的引物濃度。見圖2。

圖2 rep-PCR引物濃度的優(yōu)化Fig 2 The rep-PCR products at different primer concentration

2.2.2 退火溫度的優(yōu)化：當(dāng)退火溫度為35、40、45、50、55 ℃時(shí)，以退火溫度為45 ℃時(shí)條帶數(shù)量最多，亮度最強(qiáng)，終選擇以45 ℃為最終的退火溫度。見圖3。

3 討 論

有關(guān)基因分型的方法有很多種，包括染色體DNA限制性內(nèi)切酶的分析、PFGE、REPD、rep-PCR等，每種方法都有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)。rep-PCR即重復(fù)序列引物聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，是以基因組的一段重復(fù)回文序列為引物，對(duì)細(xì)菌基因組的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)得到的指紋圖譜可對(duì)細(xì)菌進(jìn)行同源性分析[5]。rep-PCR兩種主要重復(fù)序列片段是基因外回文序列(rep)和腸桿菌科基因間重復(fù)序列(ERIC)，這兩種引物分別來(lái)自肺炎支原體和大腸桿菌的重復(fù)序列片段。用引物rep和引物ERIC-Ⅱ分別對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC25923進(jìn)行擴(kuò)增，均可擴(kuò)增出指紋圖譜，只是數(shù)量和亮度上有所差異，應(yīng)用引物rep擴(kuò)增出的條帶數(shù)量和亮度上都好于引物ERIC-Ⅱ，可見引物rep和引物ERIC-Ⅱ均可以用于金黃色葡萄球菌的同源性分析，由于rep-PCR擴(kuò)增理想的指紋圖譜亮度越高越好,且數(shù)量在6～8條之間，故認(rèn)為對(duì)于金黃色葡萄球菌進(jìn)行rep-PCR指紋圖譜分析，基因外回文序列(rep)優(yōu)于腸桿菌間重復(fù)序列(ERIC)。

圖3 rep-PCR退火溫度的優(yōu)化Fig 3 The rep-PCR products at different annealing temperature1～5：退火溫度分別為35、40、45、50、55 ℃, M:Marker

rep-PCR具有分辨率好，操作簡(jiǎn)單易行等優(yōu)點(diǎn)，但也有其局限性，其中主要的原因是結(jié)果的重復(fù)性與實(shí)驗(yàn)條件密切相關(guān)，反應(yīng)條件不同，所得到的指紋圖譜不同。所以本研究以ATCC25923為模板，對(duì)引物濃度以及退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，希望得到最佳的擴(kuò)增條件。首先，在其他反應(yīng)條件固定的條件下，引物濃度設(shè)為3個(gè)梯度進(jìn)行擴(kuò)增，分別為0.8、1.0、1.2 pmol/μL，當(dāng)引物濃度為1.0 pmol/μL時(shí)，擴(kuò)增出的效果最佳；另外退火溫度的高低對(duì)擴(kuò)增的結(jié)果也有較大的影響，在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，可以保證引物的目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異擴(kuò)增[6]，故本研究在其他反應(yīng)條件固定的情況下，將退火溫度設(shè)為35、40、45、50、55 ℃ 5個(gè)梯度，當(dāng)退火溫度為45 ℃時(shí)，擴(kuò)增的條帶數(shù)和亮度均好于其他，高于相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[7]。綜上所述，本研究為金黃色葡萄球菌的rep-PCR分型找出了最佳的反應(yīng)條件，為金黃色葡萄球菌的同源性分析提供了依據(jù)。

[1] 王鳳玲.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因及致病毒素基因的研究進(jìn)展[J].中國(guó)感染與化療雜志,2010,10(1):72-75.

[2] 孫桂珍,于艷華.50株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌PVL基因檢測(cè)及同源性分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2009,19(12):1471-1474.

[3] Okada T, Takada K, Fujita K, et al. Differentiation of banding patterns between Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus isolates in rep-PCR using ERIC primer [J]. J Oral Microbiol, 2011, 3:7190-7194.

[4] Duan H, Chai T, Liu J, et al. Source identification of airborne Escherichia coli of swine house surroundings using ERIC-PCR and REP-PCR[J].Environ Res,2009, 109:511-517.

[5] 劉霞,劉社蘭,解奕瑞，等.基于16S rRNA基因和細(xì)菌基因組間重復(fù)序列的DNA指紋圖譜技術(shù)對(duì)肝硬化大鼠肝移植后腸道菌群多樣性的研究[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2010,22(3):193-198.

[6] 黃培堂.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].第3版.北京:科學(xué)出版社,2002.393-396.

[7] 汪川,余倩,康睿,等.金黃色葡萄球菌REP-PCR指紋圖譜分型方法優(yōu)化[J].中國(guó)公共衛(wèi)生,2009,25(11):1354-1356.