甲型H1N1流感疫苗注射對小鼠CD4+CD25Foxp3分子表達的影響

叢慶偉，朱 英，吳可亞

(大連醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院 感染科，遼寧 大連 116011)

CD4+CD25+調節(jié)性T細胞是一群具有免疫負調控功能的T細胞亞群，通過抑制其他免疫效應細胞的激活和增殖，可防止免疫過激或者自身免疫現象的發(fā)生。Foxp3特異性地表達于CD4+CD25+Treg細胞表面，CD4+CD25+Treg有賴于Foxp3的存在而發(fā)揮功能作用。

有研究發(fā)現甲型H1N1流感患者體內該細胞數呈一過性降低，提示甲型H1N1流感病毒參與了機體免疫病理損傷[1-4]。本研究通過觀察甲型H1N1流感病毒滅活疫苗對小鼠CD4+CD25+Foxp3分子表達的影響，分析該疫苗對小鼠免疫細胞分子的調控作用，從而揭示該病毒致病的免疫病理機制。

1 材料和方法

1.1 甲型H1N1流感病毒滅活疫苗免疫小鼠

實驗動物SPF級BALB/c 小鼠72只，雌雄各半，隨機分為高、中、低3個劑量組；以甲型H1N1流感病毒滅活疫苗免疫小鼠，同時設正常對照組，皮下注射生理鹽水。每組18只。初次免疫時，高、中、低3個劑量組疫苗注射劑量分別為0.3 mL、0.2 mL和0.1 mL，腹腔/皮下接種小鼠；14 d后進第2次免疫，免疫劑量減半。二次免疫10 d后，再以第1次劑量加強免疫。初次免疫后第4、8、12、19、26、34 天分別處死各組小鼠3只，取脾臟檢測。

1.2 FACS分析 CD4+CD25+Treg細胞表型

摘取小鼠脾臟，制備單細胞懸液，加入Percoll液(Sigma公司)，提純脾淋巴細胞。用三色直接免疫熒光化學染色進行FACS分析。純化的脾淋巴細胞用飽和濃度的熒光素標記的大鼠抗小鼠單抗隆抗體進行染色，所用抗體為CD4+FITC、CD25+APC、Foxp3-PE (均購自Biolegend公司)， FITC、PE、APC標記的大鼠抗小鼠IgG作為同型對照(均購自BD公司) 。采用FACS Calibur和 CELLQuest軟件(BD公司)進行分析，每次計數10000個細胞，根據細胞大小、分子質量進行篩選，排除死亡的細胞團。設Foxp3細胞門(R1門)、CD4+CD25+細胞(R2門)、CD4+CD25+Foxp3 細胞(R3門)。在 3次分選樣本中至少用每種抗體檢測3次。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結 果

隨著造模時間延長，Foxp3表達平均值第4、8、12、19、26、34天均無明顯差別，但0.1 mL實驗組平均值比對照組明顯減少，0.3 mL組比對照組顯著升高，兩者差異均有顯著性意義(P<0.01)(表1)。CD4+CD25+實驗組表達平均值第34天比第4天有所下降，差異有顯著性意義(P<0.05)，第8、12、19、26天與第4天相比均無明顯差別；0.1 mL實驗組平均值與對照組相比顯著下降，0.3 mL組與對照組相比顯著升高，兩者差異均有顯著性意義(P<0.01)(表2)。CD4+CD25+Foxp3實驗組表達平均值于注射第19、26天比第4天有所升高，差異有顯著性意義(P<0.05)，0.1 mL實驗組平均值與對照組相比明顯升高，差異有顯著性意義(P<0.01)，其余時間點間無明顯變化(表3)。

3 討 論

20世紀70年代早期Gershon首次正式提出抑制性T細胞，Sakaguchi等[5]于1995年首次報道CD4+CD25+T細胞，T細胞具有獨特的免疫調節(jié)作用，以“主動 ”的方式在維持外周免疫耐受中起關鍵作用。Sakaguchi等發(fā)現在正常人和小鼠的外周血及脾臟組織的CD4+T細胞中有一亞群細胞持續(xù)高表達CD25+分子(L-2受體a鏈)，這種CD4+CD25+T細胞如缺乏可引起自身免疫性疾病。CD4+CD25+T細胞在人與小鼠中的分布是不同的，小鼠中占外周 CD4+T細胞 5%～10%，人占30%左右，其中 CD25high占1%～3%，為抑制性T細胞。根據CD4+CD25+Treg來源及作用機制等差異可將其分為天然 CD4+CD25+Treg和獲得性CD4+CD25+Treg。天然CD4+CD25+Treg是由胸腺T細胞自然分化發(fā)育成熟后進人外周淋巴細胞組織的Treg，在預防病理性自身免疫反應方面起作用。天然CD4+CD25+Treg在胸腺內發(fā)育不僅依賴于低濃度、中等親和力的 MHC2Ⅱ/肽復合物或外周自身抗原在胸腺內皮細胞內提呈，而且也作為CD4+T細胞自然選擇的一部分以陰性選擇的方式存活下來。隨后Sakaguchi和Shevach的研究小組在1998年分別獨立建立了該細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)，從而使其他學者能在體外研究該細胞的抑制活性[6-9]，直到2001年由Mason和Powry從人的血液中分離到了CD4+CD25+T細胞，并證實其對其他T細胞的增殖作用[10]。

表1 Foxp3表達變化Tab 1 Expression change of Foxp3

1) 與對照組比較，P<0.01

表2 CD4+CD25+表達變化Tab 2 Expression change of CD4+CD25+

1)與第4天比較，P<0.05；2)與對照組比較，P<0.01

表3 CD4+CD25+Foxp3表達變化Tab 3 Expression change of CD4+CD25+Foxp3

1)與第4天比較，P<0.05；2)與對照組比較，P<0.01

Foxp3是foxhead家族成員，2001年由Bennett CL等[11]首次報道，特異性表達于小鼠CD4+CD25+T細胞。Foxp3蛋白在CD4+CD25+T細胞分化發(fā)育中發(fā)揮關鍵作用。研究表明通過紅或綠色熒光蛋白與Foxp3基因結合，能從單個細胞水平上研究CD4+CD25+T細胞，該方法證實只有CD4+CD25+Foxp3T細胞而非CD4+CD25+TregT細胞具有免疫調節(jié)功能，可見 CD4+CD25+Treg功能的維持有賴于Foxp3的存在。Foxp3缺失或突變會造成CD4+CD25+T細胞生成障礙，機體免疫反應變強，產生自身免疫病。

2009年流行的甲型H1N1流感[12-16]，主要導致青壯年人群患病，造成部分患者病情加重而死亡。有研究發(fā)現，感染該病毒患者的CD4+T淋巴細胞呈現一過性的減少，提示甲型H1N1病毒的免疫損傷特性。

本研究中，應用甲型H1N1流感病毒滅活疫苗免疫小鼠后，注射疫苗劑量在3個分組中對分子表達影響不同：在Foxp3和CD4+CD25+組中，0.1 mL組平均值比對照組降低、0.3 mL組比對照組升高，表明隨著注射疫苗劑量逐漸增加，對Foxp3和CD4+CD25+免疫分子表達有所影響；而在CD4+CD25+Foxp3組中，0.1 mL實驗組平均值與對照組相比明顯升高，其余時間點間無明顯變化，表明低劑量注射流感疫苗就可引起CD4+CD25+Foxp3分子表達增強，因此該實驗結果揭示CD4+CD25+Foxp3分子在機體免疫反應中發(fā)揮重要作用。

隨著造模時間的延長，各時間點免疫分子表達平均值也不相同：Foxp3實驗組第4、8、12、19、26、34天均無明顯差別；CD4+CD25+實驗組第34天比第4天有所下降，第8、12、19、26天與第4天相比均無明顯差別；CD4+CD25+Foxp3實驗組于注射第19、26天比第4天有明顯升高。上述實驗結果表明，只有CD4+CD25+Foxp3免疫分子對甲流病毒具有有效的免疫清除作用。

該研究發(fā)現，甲流疫苗免疫小鼠后出現機體免疫功能變化，使CD4+CD25+Foxp3 T細胞免疫功能增強，從而起到對抗甲流病毒對機體的免疫損傷的作用。因此本研究可以推斷，甲型H1N1流感病毒感染的一個重要機制是引起CD4+CD25+調節(jié)性T細胞減少，打破機體免疫耐受狀態(tài)，使機體免疫處于相對過激或亢進狀態(tài)，而過度免疫可導致機體損傷。該研究結果與2009年甲流流行期間危重癥患者的發(fā)病特點相吻合，臨床報道通過檢測危重癥甲流患者外周血CD4+CD25+調節(jié)性T細胞，發(fā)現該細胞含量明顯降低。因此該研究得出結論，CD4+CD25+調節(jié)性T細胞減少是甲型H1N1流感病毒感染機體的一個重要免疫病理基礎。

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