18F-FDG對于乳腺癌模型小鼠治療作用的研究

許秦風(fēng),郭萬華,李愛梅,林夏雯,賈支俊

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009；2. 南京市鼓樓醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，江蘇 南京 210008)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近幾十年來在絕大多數(shù)國家其發(fā)病率及死亡率均呈持續(xù)上升趨勢。目前對于乳腺癌的治療手段除外科手術(shù)外主要包括藥物化學(xué)治療以及放射治療等手段，兩者均有靶向性差和細(xì)胞毒性大等副作用[1-2]。18F-FDG作為一種潛在的腫瘤靶向性治療藥物[3]，一方面作為葡萄糖類似物，不能經(jīng)己糖異構(gòu)酶催化成糖酵解的底物，不能生成ATP，堆積于細(xì)胞內(nèi)，可以起到能量阻滯劑的作用，使腫瘤細(xì)胞凋亡；另一方面，18F的衰變能發(fā)射正電子，在組織內(nèi)射程0.1～0.2 mm，通過湮沒輻射產(chǎn)生γ射線，在此過程中可以使組織中的分子電離，產(chǎn)生氧自由基，對濃聚部位的腫瘤細(xì)胞具有一定的誘導(dǎo)凋亡作用，且因為其半衰期短、射程較短，對于正常細(xì)胞影響較小[4]。本課題組主要研究適當(dāng)劑量18F-FDG誘導(dǎo)乳腺癌凋亡，并探討其凋亡作用及可能凋亡分子機制。

1 材料和方法

1.1 試 劑

人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株由本院腫瘤科贈予，胎牛血清購自杭州四季青公司，LG-DMEM、胰酶粉購自GIBCO公司，細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板購自Corning公司，18F-FDG購自南京安迪克公司，Pierce23225BCA Protein Assay Kit/BCA蛋白濃度測定試劑購自Pierce 公司，PM0671 Prestained Protein Ladder(10-170kD) 購自杭州聯(lián)科生物公司，anti BCL-2及CASPASE-3、β-actin，Sheep polyclonal Secondary Antibody to Rabbit IgG - H&L (HRP)購自ABCAM公司，PVDF膜及Immobilon Western HRP底物購自Millipore公司。

1.2 實驗動物及設(shè)備

雌性Balb/c小鼠24只，2周齡，購自南京大學(xué)實驗動物中心，并在本院動物實驗中心飼養(yǎng)。γ射線高能計數(shù)儀及micro-animal PET-CT(無錫原子能研究所)，小型垂直電泳及轉(zhuǎn)膜設(shè)備(BIO-RAD公司)，Tanon4200數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)(Tanon公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞體外18F-FDG攝取實驗：培養(yǎng)條件為10 %胎牛血清， LG-DMEM 培養(yǎng)基，于37℃，5 % CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞體外攝取實驗在對數(shù)生長期進(jìn)行，分別加入0、1.85×106、3.7×106、7.4×106Bq/mL18F-FDG，孵育1 h，分別做復(fù)管，然后使用胰酶消化，PBS沖洗3遍，洗去游離的18F-FDG，最后用γ射線高能計數(shù)儀測定細(xì)胞攝取放射劑量。

1.3.2 動物模型的建立：在4周左右健康雌性Balb/c小鼠右側(cè)腋下接種MCF-7細(xì)胞懸液，約107個細(xì)胞/只，繼續(xù)飼養(yǎng)于SPF級動物房，觀察腫瘤的生長情況。待腫瘤直徑達(dá)到0.5～0.6 cm左右時(10～12 d)，開始后續(xù)實驗。

1.3.3 分組用藥治療并制作腫瘤生長曲線：將建立好模型的24只小鼠隨機分為4組，每組6只，將其中3組小鼠分別經(jīng)尾靜脈注射3.7 MBq、11.1 MBq、37 MBq18F-FDG進(jìn)行治療，對照組小鼠注射等體積生理鹽水作為對照，每2天觀察小鼠情況并以游標(biāo)卡尺測量瘤體長、短徑(a，b)，腫瘤體積V=π/6×ab2，取其均數(shù)繪制腫瘤生長曲線，22 d后觀察各組小鼠一般狀況，進(jìn)行后續(xù)顯像。

1.3.4 分組micro-animal PET/CT顯像：持續(xù)NO2麻醉，每只裸鼠分別向其尾靜脈注射18F-FDG 約150 μci。1 h后對注射進(jìn)行荷瘤裸鼠的PET/CT(Gemini，Philips，The Netherland)顯像。顯像結(jié)束后將所有小鼠處死，取出瘤體凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 Western Blot 分析: BCA 法蛋白定量， 取總蛋白相等(50 mg)的樣品行12% SDS-PAGE 電泳，然后電轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶(TBST稀釋)封閉2 h后加入一抗(1∶500稀釋)于4℃孵育過夜， 使用TBST 緩沖液洗滌3 次、每次10 min， 加入二抗(1∶3000稀釋)于室溫下孵育2 h， 再用TBST緩沖液洗滌3 次、每次10 min， 加入發(fā)光底物(ECL)顯色， 以β-actin 作內(nèi)參照，每組實驗重復(fù)3次，最后用條帶分析軟件Quantity One進(jìn)行光密度值分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 MCF-7細(xì)胞體外攝取實驗

在一定劑量范圍內(nèi)，隨著射線劑量的增加，處于對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞攝取射線劑量逐漸增加，基本呈線性增長(圖1)。

圖1 MCF-7細(xì)胞體外攝取18F-FDG結(jié)果Fig 1 Uptake of γ-ray by MCF-7 cells in vitro

2.2 治療后乳腺癌荷瘤裸鼠腫瘤體積增長曲線

治療后，各治療組小鼠腫瘤體積增長速度明顯放緩，而較高劑量組(11.1 MBq與37 MBq)較之較低劑量組(3.7 MBq)顯示出更低的增長速度，與之相反，注射生理鹽水的對照組小鼠腫瘤體積增長明顯，呈明顯的上升態(tài)勢，見表1。

2.3 乳腺癌荷瘤裸鼠 micro-animal PET顯像

腫瘤均位于右腋下皮下，均呈不同程度的放射性濃聚，治療組濃度程度低于對照組，且隨著之前治療時注射藥物劑量的增加，放射性濃聚的程度也隨之降低(圖2)。

表1 注射18F-FDG后各組小鼠腫瘤體積變化Tab 1 Dynamic changes of xenogafts volume in different group mice

表1 注射18F-FDG后各組小鼠腫瘤體積變化Tab 1 Dynamic changes of xenogafts volume in different group mice

datecontrol18F-FDG(3．7MBq)18F-FDG(11．1MBq)18F-FDG(37MBq)00．06±0．010．07±0．010．06±0．010．08±0．0120．30±0．020．19±0．011)0．13±0．021)0．12±0．011)2)40．53±0．040．26±0．021)0．19±0．041)0．17±0．021)2)60．96±0．130．65±0．051)0．47±0．071)0．26±0．021)2)81．57±0．450．79±0．071)0．59±0．111)0．33±0．021)2)102．73±0．781．49±0．131)0．84±0．171)0．47±0．131)2)123．56±0．972．07±0．431)1．19±0．391)0．56±0．171)2)145．73±1．252．19±0．441)1．58±0．771)0．66±0．281)2)

1)與對照組比較，P<0.05；2)與3.7 MBq 18F-FDG劑量組比較，P<0.05

圖2 乳腺癌荷瘤裸鼠PET顯像Fig 2 Images of model mouse by microPET

2.4 18F-FDG對于乳腺癌荷瘤裸鼠BCL-2及cleaved CASPASE-3蛋白表達(dá)的影響

注射18F-FDG之后：各治療組的乳腺癌荷瘤裸鼠瘤體cleaved CASPASE-3表達(dá)均高于對照組(P<0.05)，BCL-2表達(dá)均低于對照組(P<0.05)；11.1 MBq劑量組與37 MBq劑量組間該兩種蛋白表達(dá)差異均無顯著性意義(P>0.05)，但11.1 MBq劑量組與37 MBq劑量組cleaved CASPASE-3表達(dá)均高于3.7 MBq劑量組，BCL-2表達(dá)均低于3.7 MBq劑量組，差異具有顯著性意義(P<0.05)。見表2、圖3。

表2 BCL-2及cleaved CASPASE-3蛋白表達(dá)條帶光密度半定量掃描結(jié)果Tab 2 BCL-2 and cleaved CASPASE-3 OD values in xenografts

1)與對照組比較，P<0.05；2)與3.7 MBq18F-FDG劑量組比較，P<0.05

圖3 18F-FDG對于乳腺癌荷瘤裸鼠瘤體BCL-2及cleaved CASPASE-3蛋白的表達(dá)Fig 3 Effects of 18F-FDG on expressions of BCL-2 and cleaved CASPASE-3 in xenografts

3 討 論

18F-FDG是2-脫氧-D-葡萄糖(2-DG)在2位上H或是葡萄糖第2位上的羥基被F替代的形式。作為一種葡萄糖類似物，F(xiàn)DG會被腦、腎臟以及腫瘤細(xì)胞等葡萄糖高利用率細(xì)胞(high-glucose-using cells)所攝取。在這些細(xì)胞內(nèi)，磷酸化過程將會阻止FDG以原有形式從細(xì)胞之中釋放出來，所以，18F-FDG 的分布情況就會很好地反映體內(nèi)細(xì)胞對葡萄糖的攝取分布情況。目前已經(jīng)廣泛用于正電子發(fā)射計算機斷層掃描(positron emission tomography，PET)成像以進(jìn)行惡性腫瘤的篩查、診斷、分期、療效檢測及預(yù)后評估[5]。研究表明，2-脫氧-D-葡萄糖在葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白進(jìn)入細(xì)胞后所生成的2-脫氧-6-磷酸葡萄糖，不能經(jīng)己糖異構(gòu)酶催化，也不能生成ATP提供能量，只能滯留于細(xì)胞內(nèi)?；谝陨显恚?-DG可能作為葡萄糖的競爭性無效能量底物發(fā)揮切斷腫瘤的能量供應(yīng)的作用，從而達(dá)到加速腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長的作用[6]，已有文獻(xiàn)證實其對于淋巴瘤細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞有促凋亡作用，而且2-DG可以增強腫瘤細(xì)胞對于如射線、抗腫瘤藥物等各種外界影響因素的敏感性[7-9]；同時18F 發(fā)出的平均能量為0.250 MeV、豐度為96%的β+射線(正電子)以及其湮沒輻射發(fā)射的高能γ射線對非常鄰近的周圍組織有輻射作用，盡管18F 半衰期較短，但由于其在腫瘤攝取后富集的靶與非靶比值非常高，其細(xì)胞電離毒殺腫瘤作用是不可忽視的，且由于作用距離較短，故而對于周圍鄰近正常組織損害相當(dāng)有限[4，10]。根據(jù)本次實驗，體外培養(yǎng)相同數(shù)量級的MCF-7細(xì)胞對18F-FDG的攝取與射線劑量在一定劑量內(nèi)呈線性相關(guān)，隨著18F-FDG劑量的增加，MCF-7細(xì)胞所攝取γ射線的計數(shù)會隨之增加，由此可知18F-FDG確會在腫瘤細(xì)胞內(nèi)濃聚，從而達(dá)到形成輻射殺傷作用以及能量競爭底物的作用。本次PET顯像顯示，在乳腺癌荷瘤裸鼠模型中，腫瘤部位形成較明顯的放射性高攝取，提示18F-FDG在腫瘤區(qū)域濃聚，而治療組小鼠腫瘤部位放射性濃聚程度低于對照組，提示腫瘤生長受到抑制，葡萄糖代謝水平減低，腫瘤細(xì)胞的活性減低。由此可見，顯像劑既可起到篩選呈陽性顯像個體的作用，亦能起到靶向殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。而對于各組實驗動物的持續(xù)觀察和腫瘤體積的記錄顯示，本次實驗中，各劑量組治療效果均優(yōu)于對照組，而11.1 MBq劑量組與37 MBq劑量組治療效果又優(yōu)于3.7 MBq劑量組。這證明18F-FDG 確實可殺傷實驗動物體內(nèi)的乳腺癌細(xì)胞，起到一定的治療作用。

細(xì)胞凋亡與壞死不同，是機體在生長、發(fā)育過程中或受到有害刺激時清除多余的、衰老的或異常的細(xì)胞，以保持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和維持正常生理活動的一種細(xì)胞主動死亡形式。其中CASPASE的級聯(lián)反應(yīng)是凋亡的基本過程，CASPASE蛋白通常以酶原(pro-CASPASE)形式存在，其分子結(jié)構(gòu)包括N端結(jié)構(gòu)域、大亞基和小亞基，水解后分離出的大小亞基可以形成四聚體而成為具有蛋白水解酶活性的CASPASE，CASPASE-3作為下游的效應(yīng)蛋白，起到凋亡過程中不可替代的作用，其陽性表達(dá)意味著細(xì)胞正在進(jìn)行著不可逆的凋亡過程。BCL-2蛋白主要位于核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體外膜上，是一種抗凋亡蛋白，其過表達(dá)可抑制許多因素誘導(dǎo)的多種細(xì)胞凋亡，從而明顯延長細(xì)胞的生存期，促進(jìn)惡變，引發(fā)腫瘤的形成；抑制腫瘤BCL-2蛋白的表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，并且可以升高腫瘤細(xì)胞對于多種抗腫瘤藥物的敏感性，原因在于BCL-2 蛋白水平下降將使線粒體膜去極化，破壞線粒體的完整性，釋放線粒體內(nèi)的促凋亡因子，最終激活CASPASE-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，同時BCL-2也是CASPASE-3的作用底物，可以被CASPASE-3水解。據(jù)文獻(xiàn)報道，18F-FDG對于癌細(xì)胞的促凋亡作用是受到BCL-2家族蛋白調(diào)控的[11-13]。本研究用Western Blot法檢測了注射18F-FDG 之后乳腺癌荷瘤裸鼠瘤體CASPASE-3蛋白及BCL-2蛋白的表達(dá)情況，顯示BCL-2蛋白表達(dá)降低，cleaved CASPASE-3表達(dá)有所增高，提示18F-FDG可能通過下調(diào)BCL-2蛋白的表達(dá)，上調(diào)CASPASE-3蛋白的表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡；18F-FDG劑量的提高(3.7 MBq～11.1 MBq、37 MBq)引起B(yǎng)CL-2蛋白表達(dá)的降低和CASPASE-3蛋白表達(dá)的提高，提示了在某一劑量范圍內(nèi)，18F-FDG可能靠劑量依賴誘導(dǎo)BCL-2蛋白表達(dá)降低從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

本次實驗中，11.1 MBq劑量組與37 MBq劑量組治療效果未見統(tǒng)計學(xué)差異，與Western Blot結(jié)果一致，推測18F-FDG對于腫瘤的治療效果并不會隨著給藥劑量的增加而呈線性增長，并且本次實驗為單次給藥，其結(jié)果亦有可能產(chǎn)生偏倚。此外，由于部分正常組織對于18F-FDG亦表現(xiàn)出高攝取，如正常心臟、腦以及腎臟組織等，雖然正常細(xì)胞具有一定修復(fù)功能，相對來說受到輻射及代謝因素的影響較小，但是受到的損傷始終是存在的，因此如果今后18F-FDG要應(yīng)用于臨床，必須要進(jìn)一步明確最佳的治療劑量以及藥物對于體內(nèi)其他正常臟器的影響，這還有待進(jìn)一步研究。

[1] Oh JL, Buchholz TA. Internal mammary node radiation: a proposed technique to spare cardiac toxicity[J]. J Clin Oncol，2009,27(31):e172-e173.

[2] Swain SM, Whaley FS, Ewer MS. Congestive heart failure in patients treated with doxorubicin: a retrospective analysis of three trials[J]. Cancer， 2003,97(11):2869-2879.

[3] Paik JY, Park JW, Jung KH,et al. Combination of nitric oxide stimulation with high-dose (18)F-FDG promotes apoptosis and enhances radiation therapy of endothelial cells[J]. Nucl Med Biol,2012,39(3):423-428.

[4] Renee M Moade, Andrew V Nguyen, Elaine Y Lin, et al. Positron emission tomography agent 2-deoxy-2-[18F]fluoro-D-glucose has a therapeutic potential in breast cancer[J]. Breast Cancer Res,2003, 5(6):199-205.

[5] Filippi V, Malamitsi J, Vlachou F, et al. The impact of FDG-PET/CT on the management of breast cancer patients with elevated tumor markers and negative or equivocal conventional imaging modalities[J]. Nucl Med Commun, 2011,32(2):85-90.

[6] Yalcin A, Telang S, Clem B, et al. Regulation of glucose metabolism by 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatases in cancer[J]. Exp Mol Pathol,2009,86(3):174-179.

[7] Ben Sahra I, Laurent K, Giuliano S, et al.Targeting cancer cell metabolism: the combination of metformin and 2-deoxyglucose induces p53-dependent apoptosis in prostate cancer cells[J]. Cancer Res, 2010,70: 2465-2475.

[8] Aykin-Burns N, Ahmad IM, Zhu Y, et al. Increased levels of superoxide and H2O2mediate the differential susceptibility of cancer cells versus normal cells to glucose deprivation[J]. Biochem J,2009,418(1):29-37.

[9] Zagorodna O, Martin SM, Rutkowski DT，et al. 2-Deoxyglucose-induced toxicity is regulated by Bcl-2 family members and is enhanced by antagonizing Bcl-2 in lymphoma cell lines[J].Oncogene,2011, 31(22):2738-2749.

[10] Renee M Moadel,l Richard H. Positherapy: Targeted Nuclear Therapy of Breast Cancer with18F-2-Deoxy-2-Fluoro-D-Glucose[J]. Cancer Res,2005, 65 (3): 698-702.

[11] Ram rez-Peinado S, Alc zar-Limones F, Lagares-Tena L, et al. 2-deoxyglucose induces Noxa-dependent apoptosis in alveolar rhabdomyosarcoma[J].Cancer Res,2011,71(21):6796-6806.

[12] El Mjiyad N, Caro-Maldonado A, Ram rez-Peinado S, et al. Sugar-free approaches to cancer cell killing[J]. Oncogene,2011,30(3):253-264.

[13] Zhao Y, Coloff JL, Ferguson EC, et al. Glucose metabolism attenuates p53 and Puma-dependent cell death upon growth factor deprivation[J]. J Biol Chem,2008,283(52):36344-36353.