高效液相色譜法測(cè)定煙草及煙草制品中的三種水溶性糖

黃 菲，黃翼飛

（廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，廣州 510145）

煙草中的水溶性糖與煙草的口感、香味特征和焦油生成量關(guān)系密切。葡萄糖、果糖和蔗糖是煙草中主要的水溶性糖，是煙草中具有代表性的糖類。

早期主要采用紙色譜法、薄層色譜法及柱層析法等經(jīng)典方法進(jìn)行混合糖的分析，這些方法分辨率低、分析時(shí)間長(zhǎng)、定量測(cè)定困難，難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作。

氣相色譜法也可用于對(duì)糖類物質(zhì)的分離測(cè)定。氣相色譜法具有選擇性好，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。但葡萄糖、果糖和蔗糖等糖的沸點(diǎn)高、揮發(fā)性低、難氣化，在進(jìn)行氣相色譜分析時(shí)，需要將這些糖類物質(zhì)先衍生為可氣化的揮發(fā)性成分。但衍生操作步驟繁瑣，耗時(shí)耗力，而且對(duì)衍生化合物的穩(wěn)定性難以進(jìn)行直觀的評(píng)判，這些因素都會(huì)影響對(duì)糖類物質(zhì)的準(zhǔn)確測(cè)定?；谶@些不足，現(xiàn)在測(cè)定單糖和二糖已較少采用氣相色譜法。

對(duì)葡萄糖、果糖和蔗糖等糖類的直接測(cè)定，高效液相色譜法（HPLC）、離子色譜法（IC）和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS）都有報(bào)道，這3種方法分析糖類物質(zhì)都無需進(jìn)行柱前衍生化操作。電噴霧離子化技術(shù)在高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)糖類物質(zhì)進(jìn)行定量時(shí)得到廣泛的應(yīng)用。HPLC-MS分析糖靈敏度很高，分析速度較快，非常適合對(duì)痕量糖類的定性定量分析。由于煙草和煙草制品中的葡萄糖、果糖和蔗糖含量較高，通常無需使用高靈敏度的HPLC-MS法。離子色譜法也較多的應(yīng)用在對(duì)糖的測(cè)定中，離子色譜法測(cè)糖也可以達(dá)到較低的檢測(cè)限，適合用于對(duì)微量糖類物質(zhì)的測(cè)定。離子色譜法的檢測(cè)靈敏度也遠(yuǎn)高于對(duì)煙草和煙草制品中的葡萄糖、果糖和蔗糖含量的檢測(cè)要求，因此進(jìn)樣前需要對(duì)樣品進(jìn)行較大倍數(shù)的稀釋（如稀釋 100倍），且離子色譜法包括柱平衡在內(nèi)的分析時(shí)間較長(zhǎng)，平均測(cè)試一個(gè)樣品需要1.33 h或以上。高效液相色譜法是目前測(cè)糖使用最多的方法[1-6]。高效液相色譜法測(cè)糖較離子色譜法簡(jiǎn)便，測(cè)糖穩(wěn)定性和重復(fù)性好，儀器維護(hù)簡(jiǎn)單，儀器普及率更高，檢測(cè)靈敏度完全滿足日常分析的應(yīng)用要求。

筆者采用以高度交聯(lián)的鉛型磺化苯乙烯-二乙烯苯（SDVB）樹脂為填料的陽離子交換色譜柱建立了測(cè)定煙草及煙草制品中葡萄糖、果糖和蔗糖的高效液相色譜方法。該方法準(zhǔn)確、重復(fù)性和再現(xiàn)性好、適用性強(qiáng)。該方法還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是僅使用無任何污染的超純水作為流動(dòng)相即可達(dá)到理想的分離效果和得到良好的色譜峰形，無需使用乙腈等有毒有害試劑，達(dá)到經(jīng)濟(jì)、安全和清潔環(huán)保的要求。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

蔗糖、D-(-)-果糖、D-(+)-無水葡萄糖（純度≥99.5%，Sigma-Aldrich公司）；乙腈（純度≥99.9%，MERCK公司）；超純水。

1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），配備G1378B脫氣機(jī)、G1311A四元泵、G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱和G1362A示差折光檢測(cè)器（RID）；Varian Metacarb Pb PLUS色譜柱（300 mm × 7.8 mm）和 Varian Metacarb 87P 預(yù)柱柱芯（美國Varian公司）；Milli-Q Element A10 純水機(jī)（美國Millipore公司）；HY-5回旋振蕩器（金壇市富華電器有限公司）；CP 224S電子天平(德國Sartorius公司)。

1.2 樣品處理與分析

試驗(yàn)于 2009年 3月—2010年 9月進(jìn)行，取1.0000 g煙末，置于100 mL磨口錐形瓶中，準(zhǔn)確加入50 mL 0.01 mol/L NaOH萃取溶液，具塞振蕩萃取60 min，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，濾液進(jìn)行HPLC分析。分析條件為：Varian Metacarb Pb PLUS色譜柱和Varian Metacarb 87P 預(yù)柱柱芯；柱溫箱溫度：80℃；流動(dòng)相：水，等梯度洗脫；進(jìn)樣量：20 μL；流速：0.4 mL/min。

2 結(jié) 果

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 色譜柱的選擇 示差折光檢測(cè)器較多配合使用氨基丙基硅烷為鍵合相的硅膠柱（以下簡(jiǎn)稱氨基柱）和陽離子交換色譜柱以及相應(yīng)的流動(dòng)相進(jìn)行水溶性糖類的測(cè)定。由于某些煙草和煙草制品樣品的葡萄糖、果糖和蔗糖含量較低，因此，能達(dá)到較低的檢測(cè)限是色譜柱和流動(dòng)相選擇的一個(gè)重要前提。實(shí)驗(yàn)選用Waters公司的氨基柱（高效碳水化合物卡套色譜柱，4.6 mm × 250 mm，4 μm）和Varian公司的Varian Metacarb Pb Plus陽離子交換色譜柱對(duì)比了分析葡萄糖、果糖和蔗糖的檢測(cè)靈敏度，結(jié)果見表1。其中使用Waters公司氨基柱的優(yōu)化分析色譜條件[7]為：Sentry高效碳水化合物保護(hù)柱和Sentry整合保護(hù)柱套（美國Waters公司）；柱溫箱溫度：35 ℃；RID光學(xué)元件溫度：35 ℃；流動(dòng)相：72%（體積分?jǐn)?shù)）乙腈/28%水預(yù)混合溶液，等梯度洗脫；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1 mL/min。

由表1可見，使用Varian Metacarb Pb Plus陽離子交換色譜柱和水流動(dòng)相可以達(dá)到很低的檢測(cè)限，比使用高效碳水化合物卡套色譜柱和乙腈-水流動(dòng)相的檢測(cè)限低 27倍以上。由于氨基柱在使用的過程中會(huì)逐漸流失一些鍵合在硅膠上的氨基堿性基團(tuán)，這些持續(xù)而不穩(wěn)定的柱流失造成了較大的基線波動(dòng)，一般基線波動(dòng)在120 nRIU范圍內(nèi)（nRIU為示差折光單位的十億分之一）。這些因素造成了使用高效碳水化合物卡套色譜柱測(cè)葡萄糖、果糖和蔗糖的靈敏度較低。且由于氨基柱的持續(xù)性柱流失，對(duì)糖的分離性能下降較快。隨著色譜柱的分離性能下降，對(duì)葡萄糖、果糖和蔗糖的保留逐漸減弱，3種糖的色譜峰保留時(shí)間會(huì)逐漸減少，以至于果糖和葡萄糖無法達(dá)到較好的分離。而Varian Metacarb Pb Plus陽離子交換色譜柱的柱流失極小，所使用的流動(dòng)相水揮發(fā)性遠(yuǎn)弱于乙腈，檢測(cè)基線波動(dòng)可穩(wěn)定在5 nRIU范圍內(nèi)，有利于提高示差折光檢測(cè)器的檢測(cè)靈敏度。同時(shí)，對(duì)葡萄糖、果糖和蔗糖可以實(shí)現(xiàn)完全的基線分離，而且各糖色譜峰的保留時(shí)間很穩(wěn)定。Varian Metacarb Pb PLUS色譜柱通常使用去離子水作為流動(dòng)相，經(jīng)濟(jì)、安全、清潔環(huán)保，而且方便流動(dòng)相的隨時(shí)更換，無需特別配制。因此，實(shí)驗(yàn)選用Varian Metacarb Pb Plus陽離子交換色譜柱。

表1 高效碳水化合物卡套色譜柱和Varian Metacarb Pb Plus色譜柱測(cè)葡萄糖、果糖和蔗糖的檢測(cè)限比較Table 1 The comparison of detection limits of glucose,fructose and sucrose on the Carbohydrate High Performance cartridge column and Varian Metacarb Pb Plus column

2.1.2 流速的選擇 流速對(duì)色譜柱的分離產(chǎn)生一定影響。高流速可以縮短分析時(shí)間，但另一方面也會(huì)使柱壓大大升高，而且可能降低目標(biāo)色譜峰與雜質(zhì)峰的分離度。Varian Metacarb Pb PLUS色譜柱的最高耐壓為1025 psi，因此實(shí)驗(yàn)選用較低的流速，實(shí)驗(yàn)使用同一標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)比了 0.1、0.3、0.4、0.6 mL/min 4種流速。流速為0.1 mL/min時(shí)，果糖出峰時(shí)間在101 min，出峰時(shí)間過長(zhǎng)，且果糖峰高僅為流速為0.4 mL/min時(shí)的71%。流速為0.3 mL/min和0.4 mL/min時(shí)，3種糖的色譜峰形和分離效果差別不大，與鄰近的雜峰分離干凈，流速為0.4 mL/min的分離時(shí)間較短，在27 min內(nèi)3種糖出峰完畢（圖1）。當(dāng)流速為0.6 mL/min時(shí)，不利于某些樣品的雜峰與目標(biāo)色譜峰的分離。方法選用流速為 0.4 mL/min。

圖1 果糖、葡萄糖和蔗糖標(biāo)準(zhǔn)色譜圖（A）和煙草樣品色譜圖（B）Fig.1 The chromatograms of fructose, glucose and sucrose of a standard solution and a tobacco sample

2.2 前處理?xiàng)l件的選擇

2.2.1 萃取溶液選擇 0.01 mol/L氫氧化鈉和水是提取煙草中葡萄糖、果糖和蔗糖的常用萃取溶液，兩者對(duì)3種糖的提取效率相當(dāng)。煙草中含有多種酸，煙草樣品的水提取液也呈偏酸性，其中的檸檬酸、酒石酸等酸性物質(zhì)可催化蔗糖分解[8]，不利于樣品提取液的長(zhǎng)時(shí)間放置，尤其對(duì)于蔗糖含量較高的樣品，蔗糖的分解更為明顯。當(dāng)使用0.01 mol/L氫氧化鈉進(jìn)行試樣提取時(shí)，稀的氫氧化鈉會(huì)中和樣品提取溶液中的酸，使樣品提取溶液呈堿性，可在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)有效的抑制蔗糖的分解，確保測(cè)試結(jié)果的真實(shí)性。

由表2可見，用水作為提取溶液時(shí)，隨著樣品提取溶液在室溫下放置時(shí)間的延長(zhǎng)，蔗糖含量逐漸減少，放置9.0 h后，蔗糖的測(cè)試含量為初始測(cè)試含量的65%，放置19.5 h后，蔗糖的測(cè)試含量?jī)H為初始測(cè)試含量的41%；而葡萄糖和果糖的含量則隨試樣提取溶液放置時(shí)間的延長(zhǎng)逐步增加。但是3種糖的總量保持一致，平均含量為 27.44%。用 0.01 mol/L氫氧化鈉提取的試樣溶液的3種糖的含量則較穩(wěn)定，在20 h內(nèi)3種糖的測(cè)試含量保持一致，這樣有利于編制儀器進(jìn)樣序列對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行連續(xù)分析。因此，試驗(yàn)選取0.01 mol/L氫氧化鈉作為提取溶液。

表2 水和0.01 mol/L氫氧化鈉的煙草提取溶液葡萄糖、果糖和蔗糖含量隨放置時(shí)間的變化Table 2 The variations of the contents of glucose, fructose and sucrose of tobacco solutions extracted by H2O and 0.01 mol/L NaOH with standing time

2.2.2 提取時(shí)間的選擇 選取試樣 A為樣品，按1.2進(jìn)行樣品處理，把提取時(shí)間分別設(shè)置為15、30、45、60、90、120 min，結(jié)果見圖2。蔗糖在15 min的時(shí)候基本提取完全，葡萄糖在30 min時(shí)提取量比在15 min時(shí)的略有增加，在30 min后則趨于穩(wěn)定，果糖在60 min時(shí)已經(jīng)基本提取完全。兼顧3種糖在不同提取時(shí)間的提取情況，為了保證各糖的完全提取，試驗(yàn)把提取時(shí)間設(shè)置為1 h。

圖2 樣品中果糖、葡萄糖和蔗糖在不同提取時(shí)間的提取量Fig.2 The extracted contents of fructose, glucose and sucrose of a sample in different extraction time

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

分別稱取0.25 g葡萄糖、0.25 g果糖、0.20 g蔗糖，精確至0.0001 g，用0.01 mol/L氫氧化鈉溶液溶解后轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用0.01 mol/L氫氧化鈉溶液定容至刻度。得葡萄糖、果糖和蔗糖濃度分別為 2500 μg/mL、2500 μg/mL 和 2000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。再逐級(jí)用0.01 mol/L氫氧化鈉溶液稀釋至所需要的濃度。表3為合適的工作標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度系列。分別對(duì)工作溶液進(jìn)行HPLC測(cè)定，并以各糖色譜峰峰面積（y）對(duì)其濃度（x）進(jìn)行線性回歸分析，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程（表4）。由表4看出，方程的線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于 0.999。檢出限較低為0.002%～0.006%。

表3 工作標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度系列 μg/mLTable 3 A series of concentrations of working standard solutions

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限Table 4 The linear equations, correlation coefficients and limits of detections

2.4 方法的重復(fù)性

按1.2處理方法對(duì)試樣B進(jìn)行5次平行測(cè)定，得方法精密度，以RSD%表示，結(jié)果見表5。果糖、葡萄糖和蔗糖的精密度小于 1%，方法的重復(fù)性良好。

表5 方法重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 5 The test results of the repeatability of the method

2.5 方法的回收率

取樣品B，以其5次平行測(cè)定的平均值作為計(jì)算其果糖、葡萄糖和蔗糖原始含量的依據(jù)（蔗糖、葡萄糖和果糖 5次平行測(cè)定的含量平均值分別為1.29%、3.96%和 5.75%），添加高、中、低 3個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行回收試驗(yàn)。由表6可見，果糖、葡萄糖和蔗糖的回收率為98.9%～101.8%，結(jié)果理想。

2.6 與離子色譜方法的比對(duì)

本方法和煙草行業(yè)推薦標(biāo)準(zhǔn)[9]進(jìn)行了檢測(cè)數(shù)據(jù)比對(duì)，結(jié)果見表7。兩種方法的測(cè)試數(shù)值的相對(duì)平均偏差均小于5%，一致性較好。

表6 回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 6 The test results of recovery

表7 本方法（LC）和離子色譜方法（IC）的測(cè)試數(shù)據(jù)比較Table 7 The comparison of the test data acquired with the constructed method and the ion chromatography method

2.7 煙草和煙草制品樣品的測(cè)定

應(yīng)用本方法對(duì)37個(gè)不同地區(qū)的煙草樣品和36個(gè)國內(nèi)外不同牌號(hào)的煙草制品樣品進(jìn)行分析測(cè)定。煙草樣品中烤煙的蔗糖、葡萄糖和果糖的含量范圍分別為0.07%～5.82%、2.78%～13.65%和4.99%～13.36%，白肋煙的蔗糖、葡萄糖和果糖含量極低，3種糖的總含量一般不高于0.2%。煙草制品樣品的蔗糖、葡萄糖和果糖的含量范圍分別為 0.26%～2.33%、1.13%～9.61%和 2.94%～11.00%。大多數(shù)煙草和煙草制品以果糖和葡萄糖含量最高，蔗糖含量相對(duì)較低。

3 小 結(jié)

本方法前處理簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，準(zhǔn)確性高，可操作性強(qiáng)，易于推廣。方法只用超純水作為流動(dòng)相，無需使用乙腈等有毒有害的有機(jī)溶劑，清潔環(huán)保。

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