體外培養(yǎng)不同代角膜緣干細(xì)胞特性分析△

李翠霞 洪晶 曲洪強(qiáng)

體外培養(yǎng)不同代角膜緣干細(xì)胞特性分析△

李翠霞 洪晶 曲洪強(qiáng)

［Rec Adv Ophthalmol，2012，32(7):601-605］

角膜緣干細(xì)胞;細(xì)胞移植;ABCG2;p63;CK3

目的比較不同代角膜緣干細(xì)胞的生物學(xué)特性，為角膜緣細(xì)胞移植在臨床中的應(yīng)用提供依據(jù)。方法組織塊培養(yǎng)法體外培養(yǎng)角膜緣干細(xì)胞，光鏡觀察、HE染色和免疫熒光染色分析原代、第1代和第2代角膜緣細(xì)胞形態(tài)學(xué)特性;流式細(xì)胞技術(shù)定量檢測(cè)原代、第1代和第2代角膜緣細(xì)胞ABCG2表達(dá);MTT比色法測(cè)定體外培養(yǎng)原代、第1代和第2代角膜緣干細(xì)胞的增殖活性變化。結(jié)果倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)原代細(xì)胞培養(yǎng)24 h有單個(gè)細(xì)胞從組織塊邊緣遷出，48 h細(xì)胞局部可見(jiàn)拉網(wǎng)樣生長(zhǎng)趨勢(shì)，72 h出現(xiàn)大片細(xì)胞，細(xì)胞呈現(xiàn)多邊形或多角形，96 h細(xì)胞幾乎鋪滿整個(gè)培養(yǎng)板。隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則，CK3單克隆抗體表達(dá)陽(yáng)性率逐漸增強(qiáng);p63單克隆抗體原代和第1代細(xì)胞間表達(dá)陽(yáng)性率無(wú)明顯差別，第2代細(xì)胞表達(dá)量明顯減弱。流式細(xì)胞檢測(cè)顯示原代、第1代和第2代細(xì)胞ABCG2表達(dá)陽(yáng)性率分別為13.41%、22.96%和4.43%。MTT結(jié)果顯示隨傳代次數(shù)增加細(xì)胞增殖活性逐漸下降。結(jié)論原代和第1代角膜緣干細(xì)胞可以作為制備組織工程角膜上皮細(xì)胞膜片的較理想種子細(xì)胞。

［眼科新進(jìn)展，2012，32(7):601-605］

角膜緣干細(xì)胞(limbal stem cells，LSC)是角膜上皮細(xì)胞的再生來(lái)源。Schermer等［1］首次通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，LSC是位于Vogt柵欄區(qū)(pallsades of Vogt)乳頭狀結(jié)構(gòu)中的角膜緣基底細(xì)胞，具有長(zhǎng)周期、低分化、高增生潛能及不對(duì)稱分裂等生物學(xué)特性。LSC通過(guò)不斷移行和增殖來(lái)完成對(duì)角膜上皮細(xì)胞的更新和創(chuàng)傷的修復(fù)，在維持眼表結(jié)構(gòu)完整性和保持角膜透明性方面起著至關(guān)重要的作用［2-3］。LSC缺乏疾病是一種以LSC缺乏或功能障礙為特征的疾病，在臨床中特別常見(jiàn)，其原因主要以眼部化學(xué)傷或熱燒傷、Stenven-Johnson綜合征、手術(shù)創(chuàng)傷和藥物毒性為常見(jiàn)，是致盲性非常高的眼病之一［4-6］。對(duì)此種疾病的治療，目前臨床多采用體外培養(yǎng)的自體/異體角膜緣上皮細(xì)胞移植，進(jìn)行眼表重建。此方法相對(duì)于傳統(tǒng)的LSC移植，要求取材材料小，對(duì)供體造成的損傷輕，體外擴(kuò)增允許小量材料治療大范圍的LSC缺失［7-9］。但是，目前角膜緣上皮細(xì)胞移植治療LSC疾病的效果并不穩(wěn)定，原代細(xì)胞很難獲取且不能持久維持角膜上皮細(xì)胞的更新，因此，如何提高患者移植術(shù)后的臨床效果成為目前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。Rama等［10］報(bào)道術(shù)后移植效果與LSC的質(zhì)量有很大關(guān)系，那么如何方便獲取既能保持角膜緣上皮細(xì)胞原有特性又含有較多LSC的種子細(xì)胞成為角膜緣上皮移植成功的關(guān)鍵。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)對(duì)不同代角膜緣細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞蛋白表達(dá)及LSC含量等方面進(jìn)行分析，尋找適合LSC移植的種子細(xì)胞，為角膜緣上皮細(xì)胞移植在臨床方面的應(yīng)用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康成年新西蘭大白兔30只(由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)中心提供)，雌雄不限，體質(zhì)量1.0～1.5 kg。

1.1.2 主要試劑和儀器ABCG2單克隆抗體(美國(guó)MILLIPORE公司)，細(xì)胞角蛋白(cytokeratin，CK)3單克隆抗體(美國(guó)MILLIPORE公司)，ANTI-BCRP1 FITC(美國(guó)MILLIPORE公司)，黏蛋白5AC (MUC5AC)單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)，MTT(美國(guó)SCICREST BIOTECH公司)。倒置相差顯微鏡(OLIMPUS，日本)，CO2培養(yǎng)箱(MCO-18AIC，SANYO公司，日本)，流式細(xì)胞儀(BD公司，美國(guó))，酶標(biāo)儀(SLT.SPETRAN公司，德國(guó))，共聚焦顯微鏡(Zeiss公司，美國(guó))，熒光顯微鏡(OLIMPUS公司，日本)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 LSC的原代培養(yǎng)采用組織塊培養(yǎng)法。將兔子以過(guò)量烏拉坦靜脈注射處死后，用碘伏棉球消毒眼瞼周圍3次，迅速取出眼球，在顯微鏡下去除眼球周圍肌肉組織，生理鹽水沖洗3次。在無(wú)菌條件下將處理后的眼球用含硫酸妥布霉素的生理鹽水(硫酸妥布霉素注射液∶生理鹽水=1∶20配制)浸泡2次，每次15 min;剪下角膜片，去除結(jié)膜、虹膜等組織，在體視顯微鏡下剪去角膜中央部分。無(wú)菌條件下將兔角膜緣組織剪成約1 mm×2 mm的組織塊，將3～5枚組織塊蘸取少量培養(yǎng)基后上皮細(xì)胞面向下置于培養(yǎng)皿中，放入37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 h后待其貼附良好時(shí)加入適量含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，繼續(xù)置于恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d更換1次培養(yǎng)基，每日在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況并拍照記錄。

1.2.2 LSC的傳代培養(yǎng)當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到培養(yǎng)板的80%～90%時(shí)，PBS沖洗2次后，加入適量胰蛋白酶與細(xì)胞充分接觸2～3 min，待細(xì)胞變圓、細(xì)胞連接松弛時(shí)，加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，吸管吹打使細(xì)胞脫離培養(yǎng)皿底，收集細(xì)胞懸液，1000 r·min－1離心8 min，按照1∶2的比例接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿及涂有多聚賴氨酸的細(xì)胞爬片上待測(cè)，每2 d更換1次培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合后，以同樣方式繼續(xù)傳代。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察倒置相差顯微鏡下觀察各代LSC的爬出過(guò)程及生長(zhǎng)狀態(tài)，并將不同代數(shù)LSC固定(體積比為甲醇∶丙酮=1∶1)，進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 LSC功能蛋白的表達(dá)細(xì)胞免疫熒光檢測(cè):用固定液(體積比為甲醇∶丙酮=1∶1)固定細(xì)胞爬片10 min，將固定后的LSC爬片用PBS洗3次，然后用進(jìn)口山羊血清封閉液封閉爬片30 min，分別加入CK3(1∶100)、ABCG2(1∶100)、p63(1∶50)、MUC5AC(1∶100)單克隆抗體，并以PBS代替一抗設(shè)陰性對(duì)照，4℃過(guò)夜孵育后分別加入IgG熒光二抗，室溫孵育1 h，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，封片后激光共焦顯微鏡觀察并照相，鑒定培養(yǎng)細(xì)胞CK3、p63、ABCG2及MUC5AC(1∶100)單克隆抗體的表達(dá)并拍照。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)將原代和傳代后的LSC培養(yǎng)至形成單層，PBS洗2次，胰蛋白酶消化，1000 r·min－1離心8 min后，制成細(xì)胞懸液，用牛血清孵育30 min，1000 r·min－1離心8 min后，細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后每106細(xì)胞加入ABCG2-FITC單克隆抗體10 μL進(jìn)行標(biāo)記，孵育30 min，每10 min搖勻1次，PBS洗2次，過(guò)細(xì)胞篩，流式細(xì)胞檢測(cè)儀檢測(cè)LSC ABCG2-FITC單克隆抗體在培養(yǎng)細(xì)胞中所占的比例，比較原代和傳代后LSC ABCG2-FITC單克隆抗體的含量變化。

1.2.6 MTT比色法測(cè)細(xì)胞活性將50 mg MTT溶于10 mL PBS中，用0.22 μm濾膜過(guò)濾后配制新鮮MTT液。細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，消化、離心細(xì)胞，按照每孔2000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板，分別設(shè)12 h、24 h、48 h、72 h共4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)5個(gè)復(fù)孔。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別加入5 g·L－1MTT溶液20 μL，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，脫色搖床振蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度(A)值，參考波長(zhǎng)為490 nm。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制各代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線圖，比較原代和傳代細(xì)胞的增殖活性。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察角膜緣組織塊在置于培養(yǎng)皿上2～3 h后貼附良好。倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)，24 h后有細(xì)胞從組織塊邊緣個(gè)體遷移，貼壁生長(zhǎng)，呈多邊形，體積較小，48 h后細(xì)胞局部可見(jiàn)拉網(wǎng)樣生長(zhǎng)趨勢(shì)，72 h后出現(xiàn)大片細(xì)胞，細(xì)胞呈現(xiàn)多邊形或多角形，96 h細(xì)胞幾乎鋪滿整個(gè)培養(yǎng)板(圖1)。顯微鏡下可見(jiàn)3種細(xì)胞形態(tài):(1)圓形、卵圓形，類似基底的柱狀細(xì)胞，核漿比大;(2)多邊形，類似翼狀細(xì)胞;(3)大而扁平狀，類似表層上皮細(xì)胞。細(xì)胞以卵圓形或多邊形為主，多為2～3個(gè)核仁，部分可見(jiàn)絲狀骨架結(jié)構(gòu)。

顯微鏡下可見(jiàn)，原代細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞以多邊形及卵圓形為主，可見(jiàn)雙核細(xì)胞、多核細(xì)胞及核分裂相，細(xì)胞間連接緊密;傳代后第1代細(xì)胞呈規(guī)則多邊形，可見(jiàn)雙核細(xì)胞，細(xì)胞間連接緊密，類似上皮樣細(xì)胞，可見(jiàn)少量纖維細(xì)胞;第2代細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則狀，幾乎無(wú)雙核細(xì)胞，無(wú)細(xì)胞間連接，完全失去上皮細(xì)胞的特性(圖2)。

Figure 1 Observation of LSC with P0 at different time under inverted phase contrast microscope.A:At 24 hours，a few LSC migrated out from the cultured tissue edge;B:At 48 hours，the cells grew in mesh;C:At 72 hours，the cells grew in a sheet;D:At 96 hours，the cells grew in confluence(×200)原代培養(yǎng)細(xì)胞不同時(shí)間倒置相差顯微鏡下觀察。A:原代培養(yǎng)24 h后，可見(jiàn)少量細(xì)胞從組織塊邊緣遷移出來(lái);B:原代培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞局部呈拉網(wǎng)樣生長(zhǎng);C:原代培養(yǎng)72 h后，細(xì)胞成片爬出;D:原代培養(yǎng)96 h后，細(xì)胞幾乎鋪滿整個(gè)培養(yǎng)板(×200)

Figure 2 Growth of LSC with different passages.A:LSC with P0 under inverted phase contrast microscope;B:LSC with P1 under inverted phase contrast microscope;C:LSC with P2 under inverted phase contrast microscope;D:HE staining of LSC with P0;E:HE staining of LSC with P1;F:HE staining of LSC with P2(×100)培養(yǎng)的不同代LSC生長(zhǎng)情況。A:倒置相差顯微鏡下原代LSC;B:倒置相差顯微鏡下第1代LSC;C:倒置相差顯微鏡下第2代LSC;D:原代LSC HE染色圖像;E:第1代LSC HE染色圖像;F:第2代LSC HE染色圖像(×100)

2.2 培養(yǎng)細(xì)胞免疫熒光染色和檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 細(xì)胞免疫熒光染色經(jīng)鑒定，培養(yǎng)的細(xì)胞CK3、ABCG2、p63單克隆抗體染色均呈陽(yáng)性，MUC5AC單克隆抗體染色呈陰性，證明為L(zhǎng)SC細(xì)胞(圖3)。原代LSC CK3單克隆抗體間接免疫熒光染色多數(shù)細(xì)胞不著色，少數(shù)細(xì)胞著色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色熒光，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光;第1代LSC CK3染色陽(yáng)性細(xì)胞較原代細(xì)胞增多，第2代LSC CK3染色陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)一步增多。原代LSC p63單克隆抗體表達(dá)有很高的陽(yáng)性率，圓形及卵圓形細(xì)胞的細(xì)胞核均呈紅色熒光;第1代LSC p63的表達(dá)與原代細(xì)胞無(wú)明顯差異，第2代LSC p63的表達(dá)明顯下降(圖3-4)。

Figure 3 Identification of LSC.A:Immunofluorescence staining of CK3;B:Immunofluorescence staining of ABCG2;C:Positive immunofluorescence staining of p63;D:Immunofluorescence staining of MUC5AC(×200)LSC的鑒定。A:細(xì)胞CK3免疫熒光染色;B:細(xì)胞ABCG2免疫熒光染色;C:細(xì)胞p63免疫熒光染色;D:細(xì)胞MUC5AC免疫熒光染色(×200)

Figure 4 Immunofluorescence staining of CK3 and p63 in LSC with different passages.A:Immunofluorescence staining of p63 protein in LSC with P0;B:Immunofluorescence staining of p63 protein in LSC with P1;C:Immunofluorescence staining of p63 protein in LSC with P2;D:Immunofluorescence staining of CK3 protein in LSC with P0;E:Immunofluorescence staining of CK3 protein in LSC with P1;F:Immunofluorescence staining of CK3 protein in LSC with P2(×200)不同代LSC CK3和p63的免疫熒光染色。A:原代細(xì)胞p63的免疫熒光染色;B:第1代細(xì)胞p63免疫熒光染色;C:第2代細(xì)胞p63免疫熒光染色;D:原代細(xì)胞CK3免疫熒光染色;E:第1代細(xì)胞CK3免疫熒光染色;F:第2代細(xì)胞CK3免疫熒光染色(×200)

2.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，原代、第1代和第2代LSC ABCG2單克隆抗體陽(yáng)性率分別為13.41%、22.96%和4.43%。

2.3 細(xì)胞增殖活性檢測(cè)傳代后細(xì)胞與原代細(xì)胞比較生長(zhǎng)曲線有明顯的下降，而且原代細(xì)胞有明顯的細(xì)胞增長(zhǎng)期，但第1代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期不明顯，第2代細(xì)胞幾乎無(wú)增長(zhǎng)期。各代細(xì)胞增殖活性差別顯著(圖5)。

Figure 5 Proliferative activity examination of LSCLSC增殖活性檢測(cè)

3 討論

3.1 LSC的培養(yǎng)目前，LSC的培養(yǎng)方法主要有酶消化培養(yǎng)法和組織塊培養(yǎng)法［11］，其中，組織塊培養(yǎng)法應(yīng)用最為廣泛。Short等［12］通過(guò)比較酶消化培養(yǎng)法和組織塊培養(yǎng)法表明，組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)的細(xì)胞能更好地保持細(xì)胞原有形態(tài)，具有更多的橋粒連接和更緊密的細(xì)胞連接，能更好的保持角膜上皮細(xì)胞的功能。有文獻(xiàn)報(bào)道，組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)的LSC并不是單一的細(xì)胞，而是混合細(xì)胞，細(xì)胞包含一定量的LSC、短暫擴(kuò)充細(xì)胞、分化的角膜上皮細(xì)胞及少量纖維細(xì)胞。在本實(shí)驗(yàn)中，利用組織塊培養(yǎng)法體外培養(yǎng)兔角膜緣上皮組織，培養(yǎng)4 d左右可達(dá)到80%～90%的融合狀態(tài)，說(shuō)明培養(yǎng)的角膜緣上皮細(xì)胞具有較強(qiáng)的分裂增殖能力;另外，形態(tài)學(xué)上細(xì)胞具有體積小，圓形或卵圓形，可見(jiàn)雙核細(xì)胞、多核細(xì)胞及核分裂相，細(xì)胞間連接緊密等原始細(xì)胞生物學(xué)特性，說(shuō)明組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)的LSC具備作為L(zhǎng)SC移植的種子細(xì)胞的特點(diǎn)。

3.2 LSC的鑒定現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外對(duì)LSC的基礎(chǔ)研究仍然很薄弱，尤其是在LSC的標(biāo)記物方面，迄今為止尚未找到一種LSC特異性表達(dá)分子標(biāo)記物［1，6，13-14］，因此，只能選擇幾種目前比較確切的標(biāo)記物組合如ABCG2、p63、CK3來(lái)鑒定LSC;在LSC中ABCG2、p63表達(dá)呈陽(yáng)性，而CK3表達(dá)為陰性。ABCG2蛋白在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞分布于角膜緣上皮基底層的小細(xì)胞簇，其增生能力顯著高于陰性細(xì)胞，最符合角膜上皮干細(xì)胞的特征。p63為一種核蛋白，表達(dá)于全角膜的基底層和基底細(xì)胞上層，其陽(yáng)性表達(dá)是角膜緣強(qiáng)增殖能力細(xì)胞的標(biāo)志［1，6，13-16］。CK3是一組非水溶性細(xì)胞骨架蛋白，在角膜上皮細(xì)胞特異地表達(dá)，被認(rèn)為是角膜上皮分化細(xì)胞的標(biāo)記物;然而CK3角膜基底層細(xì)胞不表達(dá)，呈現(xiàn)未分化的自然狀態(tài)，為L(zhǎng)SC鑒定的陰性標(biāo)志物。MUC5AC是結(jié)膜細(xì)胞特異性表達(dá)標(biāo)記物。本研究免疫熒光染色結(jié)果顯示，培養(yǎng)的細(xì)胞CK3、ABCG2、p63抗體均呈陽(yáng)性表達(dá)，而MUC5AC單克隆抗體為陰性表達(dá)，說(shuō)明培養(yǎng)的細(xì)胞為角膜分化上皮細(xì)胞、LSC和短暫擴(kuò)充細(xì)胞的混合細(xì)胞，且無(wú)結(jié)膜細(xì)胞的污染。本研究結(jié)果顯示，p63在大部分原代細(xì)胞中表達(dá)陽(yáng)性，第1代細(xì)胞p63表達(dá)與原代細(xì)胞比較無(wú)明顯差異，而第2代細(xì)胞p63表達(dá)明顯下降;CK3僅在少量原代細(xì)胞中表達(dá)，隨著傳代次數(shù)增加CK3表達(dá)陽(yáng)性率逐漸增加。綜合分析后表明，原代和第1代細(xì)胞能較好地保持LSC特性，可作為臨床角膜緣上皮細(xì)胞移植的種子細(xì)胞。

3.3 LSC含量的測(cè)定熒光標(biāo)記LSC表面標(biāo)記物表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞，再運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)將被標(biāo)記細(xì)胞分選出來(lái)是干細(xì)胞分選最常用的方法之一［4，14，17-18］。ABCG2蛋白被認(rèn)為是最能代表LSC生物學(xué)特性的標(biāo)記物。通過(guò)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，在原代、第1代和第2代細(xì)胞中ABCG2單克隆抗體表達(dá)陽(yáng)性率分別為13.41%、22.96%和4.43%。分析結(jié)果表明，原代和第1代LSC ABCG2的表達(dá)量均較高，且第1代表達(dá)高于原代細(xì)胞。可能的原因?yàn)榈?代細(xì)胞通過(guò)傳代去除了更多的雜細(xì)胞，細(xì)胞進(jìn)一步純化使ABCG2表達(dá)增強(qiáng)。結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果分析，體外培養(yǎng)原代和第1代LSC更好地保持了正常LSC的生物學(xué)特性，適合應(yīng)用于臨床制備LSC移植膜片。

綜上所述，組織塊培養(yǎng)法體外培養(yǎng)角膜緣上皮細(xì)胞原代和第1代細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，增殖活性高，LSC含量多，且更好的保持了正常LSC的生物學(xué)特性，因此可作為臨床制備LSC移植膜片的種子細(xì)胞，提高LSC移植后的臨床效果。

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Characteristicanalysisofcorneallimbal stem cells with different passages in vitro

LI Cui-Xia，HONG Jing，QU Hong-Qiang

corneal limbal stem cells ;cell transplantation;ABCG2;p63;CK3

ObjectiveTo compare the biological characteristics of corneal limbal stem cells(LSC)with different passages，and provide the basis for LSC application in transplanation surgery.MethodsLSC were cultured in vitro.Morphological characteristics of LSC with different passages(P0，P1 and P2)were compared by light microscopy，HE staining and immunofluorescence.The quantitative expression of ABCG2in LSC with different passages(P0，P1 and P2)was examined by flow cytometry，and the proliferative activity of LSC with different passages(P0，P1 and P2)was determined by MTT.ResultsAt 24 hours，a few LSC migrated out from the cultured tissue edge;At 48 hours，the cells grew in mesh;At 72 hours，the cells grew in a sheet;At 96 hours，the cells grew in confluence.The morphology of LSC changed irregularly after several passaged.The number of CK3 positive cells increased，and the expression of p63 had no obvious difference between P0 and P1，however，it became weaker in P2;Flow cytometry test showed that the ABCG2positive expression in cell with P0，P1 and P2 were 13.41%，22.96%and 4.43%，respectively.MTT results demonstrated that the cellular proliferative activity gradually reduced after several passaged.ConclusionThe LSC with P0 and P1 are suitable as ideal seed cells for making corneal epithelium grafts during corneal tissue engineering.

date:Mar 10，2012

date:Apr 10，2012

NationalNatural Science Foundation ofChina(No: 31140025)

Responsible author:HONG Jing，E-mail:hongjing1964@sina.com

李翠霞，女，1984年9月出生，河北人，在讀碩士研究生。聯(lián)系電話:010-82266601(O);E-mail: kuailecuixia@163.com

About LI Cui-Xia:Female，born in September，1984.Tel:+86-10-82266601(O);E-mail:kuailecuixia@ 163.com

2012-03-10

2012-04-10

本文編輯:盛麗娜

國(guó)家自然科學(xué)基金資助(編號(hào):31140025)

100191北京市，北京大學(xué)第三醫(yī)院眼科

洪晶，E-mail:hongjing 1964@sina.com

From the Department of Ophthalmology，Peking University Third Hospital，Beijing 100191，China

【文獻(xiàn)綜述】