雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎和免疫功能的影響

李宜川，劉國(guó)玲，沈永杰，張玉霞，胡靈衛(wèi)

(商丘醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河南商丘476100)

雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎和免疫功能的影響

李宜川，劉國(guó)玲，沈永杰，張玉霞，胡靈衛(wèi)

(商丘醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河南商丘476100)

目的研究雷公藤內(nèi)酯醇(TP)對(duì)膠原性關(guān)節(jié)炎(CIA)的治療作用。方法制備雞Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的CIA大鼠模型，im給予地塞米松2.0 mg·kg－1或TP 0.1，0.2和0.4 mg·kg－1，每3天1次，連續(xù)35 d，正常對(duì)照和模型對(duì)照組im給予等體積生理鹽水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察CIA大鼠的一般情況、足爪腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)的變化。給藥結(jié)束后第2天，3%巴比妥鈉麻醉處死大鼠，取足爪組織制備組織切片觀察病理變化;無(wú)菌取脾制備脾細(xì)胞懸液，用MTT法檢測(cè)脾T細(xì)胞和B細(xì)胞增殖反應(yīng);制備10%脾組織勻漿，用ELISA法檢測(cè)脾組織白介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和IL-6;心臟取血，制備血清用ELISA法測(cè)定血清中抗CⅡ抗體水平。結(jié)果與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)紅腫，表面皮膚發(fā)亮充血，關(guān)節(jié)炎指數(shù)上升，脾T細(xì)胞和B細(xì)胞增殖反應(yīng)、血清中抗CⅡ抗體水平和脾組織中IL-1β，TNF-α和IL-6水平明顯升高(P＜0.01)，大鼠足爪皮下組織細(xì)胞排列紊亂且有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及血管增生。im給予TP 0.2和0.4 mg·kg－1可改善CIA大鼠一般狀況，明顯抑制CIA大鼠足爪腫脹(P＜0.01);降低關(guān)節(jié)炎指數(shù)，在第22，26，30和35天由模型對(duì)照組的7.3±0.7，6.3±0.8，4.7±0.7和4.3±0.2分別降低到5.6±0.6，4.9±0.7，3.9±0.5，2.8±0.7和5.1±0.8，4.1±0.4，3.3±0.6，2.7±0.6;抑制脾T和B細(xì)胞增殖反應(yīng);血清中抗CⅡ抗體水平顯著降低，A490nm由模型對(duì)照組的0.765±0.018降低到0.583±0.024和0.575±0.034(P＜0.01);脾組織中IL-1β由(159±23)ng·L－1降低到90±15和(79±15)ng·L－1(P＜0.01)，TNF-α由(125±23)ng·L－1降低到94±16和(83±17)ng·L－1(P＜0.01)，IL-6由(250±16)ng·L－1降低到193±18和(180±18)ng·L－1(P＜0.01);能明顯改善大鼠足爪組織病理改變，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及血管明顯減輕(P＜0.05)。TP 0.1 mg·kg－1對(duì)上述指標(biāo)無(wú)明顯影響。結(jié)論TP對(duì)Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的CIA具有一定的治療作用。

雷公藤內(nèi)酯醇;膠原Ⅱ型;關(guān)節(jié)炎，類(lèi)風(fēng)濕;病理學(xué);免疫細(xì)胞

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性、系統(tǒng)性和破壞性的自身免疫性疾病，其主要病理特點(diǎn)是滑膜細(xì)胞增生，襯里層增厚，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管翳形成，繼而引起軟骨和骨組織的破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能障礙。常見(jiàn)的臨床癥狀有關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、僵硬、畸形和功能?chē)?yán)重受損等。因該疾病早期診斷具有一定的難度而往往耽誤了最佳治療時(shí)機(jī)。雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide，TP)具有抗炎、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用［1］，是現(xiàn)代中西醫(yī)治療RA的常用藥，但其作用機(jī)制尚不十分明確，為進(jìn)一步研究其治療RA的作用機(jī)制，本研究在成功地制備大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型的基礎(chǔ)上，觀察TP對(duì)CIA大鼠足爪組織的病理學(xué)變化和免疫功能的影響，研究其治療RA作用的可能機(jī)制，為臨床使用TP治療RA提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物、藥物、主要試劑和儀器

Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，雄性，體質(zhì)量160～180 g，由商丘醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):2011A02。TP購(gòu)自南京蘇朗生物科技公司，純度＞90%，實(shí)驗(yàn)前將TP用丙二醇50 mol·L－1配制成注射液，其中含TP 100 g·L－1;地塞米松鹽酸注射液(5 g·L－1)購(gòu)自河南確山龍淵藥業(yè)有限公司。弗氏完全佐劑和雞Ⅱ型膠原(chicken typeⅡcollagen，CⅡ)上海本草生物醫(yī)學(xué)工程所提供;多聚賴氨酸、刀豆蛋白A(concanavalin A，Con A)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、MTT和DMSO均購(gòu)自Sigma公司;胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自Invitrogen公司;IgG抗體測(cè)定試劑盒購(gòu)于PharMingen公司;RPMI 1640培養(yǎng)基Gibco公司產(chǎn)品;小牛血清由杭州四季青生物材料研究所提供;白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-6和抗CⅡ抗體檢測(cè)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。YJ-1450型醫(yī)學(xué)凈化工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備公司;Napco-6100型二氧化碳培養(yǎng)箱由美國(guó)杜邦公司提供;EL30型酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Tek公司。

1.2 動(dòng)物分組、模型制備和給藥

大鼠60只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組10只和CIA模型制備組50只。將CⅡ15 mg溶于7.5 ml預(yù)先配制好的0.1 mol·L－1的醋酸中，CⅡ濃度為2 g·L－1，共7.5 ml，于4℃過(guò)夜充分溶解。次日，于冰浴中與弗氏完全佐劑等體積混合并使之充分乳化，制成穩(wěn)定的乳化劑15 ml(含CⅡ1 g·L－1，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。在大鼠的左后肢足跖皮內(nèi)sc給予0.1 ml致炎，第7天在大鼠尾、背多點(diǎn)sc給予0.1 ml該膠原乳劑作為激發(fā)注射。正常對(duì)照組在同一部位同樣方法注射0.1 ml生理鹽水。造模后發(fā)現(xiàn)45只大鼠左足紅腫明顯，體積增大，表明造模成功，成功率為90%。將造模成功的45只大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、地塞米松治療組及TP 0.1，0.2和0.4 mg·kg－1治療組，每組9只。TP組大鼠于造模后第7～35天后腿im給予TP 0.1，0.2和0.4 mg·kg－1，每3 d用藥1次;地塞米松治療組im給予2 mg·kg－1，每天1次;正常對(duì)照組和模型對(duì)照組后腿im給予0.4 ml·kg－1生理鹽水。末次給藥后第2天處死大鼠，測(cè)定相應(yīng)指標(biāo)。

1.3 一般情況觀察、足腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)測(cè)定

觀察各組大鼠飲食、活動(dòng)狀況、皮毛光澤、踝趾關(guān)節(jié)及體質(zhì)量變化，用足容積測(cè)定儀分別于給藥前及給藥后不同時(shí)間測(cè)量各鼠左后足爪體積，給藥后不同時(shí)間點(diǎn)左后足爪體積與給藥前差值表示足爪腫脹度。從致炎后第7天起，每隔4 d采用關(guān)節(jié)炎評(píng)分法(0～4級(jí))，得出關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index，AI)，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下:0分，無(wú)紅腫;1分，趾關(guān)節(jié)紅腫;2分，趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹;3分，踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹;4分，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹;每肢AI最高分?jǐn)?shù)為4分，四肢AI之和代表每只大鼠的AI，最高值為16分。

1.4 MTT法測(cè)定脾T和B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)［2］

給藥結(jié)束后第2天，無(wú)菌常規(guī)制備脾淋巴細(xì)胞懸液，錐蟲(chóng)藍(lán)染液進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)算大于95%，調(diào)整細(xì)胞濃度至終濃度為1×109L－1;用含體積分?jǐn)?shù)為10%的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，按每孔100 μl接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，給予100 μl Con A(5 mg·L－1)或LPS(5 mg·L－1)分別刺激T和B淋巴細(xì)胞，另設(shè)不給予Con A和LPS刺激的自身空白對(duì)照孔，每個(gè)樣品每實(shí)驗(yàn)點(diǎn)設(shè)3復(fù)孔。37℃5%CO2培養(yǎng)44 h;每孔加入20 μl MTT(5 g·L－1)，繼續(xù)培養(yǎng)至48h，終止培養(yǎng)，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入200 μl DMSO終止反應(yīng)，振蕩搖勻。用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm吸光度(A)。

1.5 血清抗Ⅱ型膠原抗體測(cè)定［3］

給藥結(jié)束后第2天，心臟取血，室溫放置后2236×g離心5 min取血清，進(jìn)行抗CⅡ特異性抗體檢測(cè)。用PBS將CⅡ稀釋至100 mg·L－1，96孔酶標(biāo)板每孔加入100 μl稀釋后的抗原，密封酶標(biāo)板。4℃冰箱孵育過(guò)夜。洗3遍后，每孔加入200 μl封閉液，室溫下封閉1～2 h。清洗后，每孔加入100 μl樣品(封閉液稀釋)。密封平板，37℃，孵育1 h。用HRP-羊抗大鼠IgG抗體檢測(cè)血清中抗CⅡ抗體，在室溫放置1 h。TMB顯色0.5 h后，加入終止液(H2SO41 mol·L－1)。用酶標(biāo)儀測(cè)定A490nm，結(jié)果以每組的均值表示。

1.6 脾組織中IL-1β，TNF-α和IL-6含量測(cè)定

取300 mg部分脾臟加入冷生理鹽水0.9 ml和無(wú)水乙醇0.1 ml，制備10%勻漿，4℃，1097×g離心15 min，取上清液，按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)細(xì)胞因子IL-1β，TNF-α和IL-6含量。

1.7 足爪組織病理形態(tài)檢測(cè)

給藥結(jié)束后第2天，3%巴比妥鈉麻醉處死大鼠，取足跖部位組織，用4%甲醛及時(shí)固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡觀察足爪組織病理形態(tài)學(xué)改變。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)CIA大鼠一般情況和足爪腫脹的影響

如表1結(jié)果所示，病變過(guò)程中，CIA模型大鼠進(jìn)食量減少，體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，甚至下降，皮毛失去光澤，并伴有輕微脫毛。大鼠致炎數(shù)小時(shí)后，可見(jiàn)部分大鼠出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫;第7天激發(fā)注射后，踝趾關(guān)節(jié)炎癥狀逐漸加重，關(guān)節(jié)紅腫且表面皮膚發(fā)亮充血，足墊增厚;到第35天部分大鼠活動(dòng)量減少，出現(xiàn)負(fù)重困難。與模型對(duì)照組相比，地塞米松2 mg·kg－1和TP各劑量組至造模后第14天足爪腫脹無(wú)明顯改善，從第18天開(kāi)始至第35天TP 0.2和0.4 mg·kg－1及地塞米松2 mg·kg－1組可見(jiàn)關(guān)節(jié)紅腫逐漸減輕，發(fā)亮充血皮膚出現(xiàn)輕微皺縮，趾尖出血點(diǎn)顏色變淺變淡，足爪腫脹度明顯減輕(P＜0.01)，表明TP可明顯抑制CIA大鼠足爪腫脹。

Tab.1 Effect of triptolide(TP)on paw swelling degree of chicken typeⅡcollagen(CⅡ)-induced arthritis(CIA)model rats

2.2 雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)CIA大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎的影響

如表2所示，與正常對(duì)照組相比，致炎后第l4天開(kāi)始模型對(duì)照組大鼠AI明顯升高(P＜0.01);TP 0.2和0.4 mg·kg－1組及地塞米松2 mg·kg－1組22 d后，大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀明顯減輕，足腫脹明顯減退，大鼠行動(dòng)靈活，與模型對(duì)照組比較AI降低(P＜0.01)。TP 0.1 mg·kg－1組無(wú)明顯變化。

2.3 雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)CIA大鼠脾T和B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)及血清抗CⅡ抗體水平的影響

如表3所示，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠Con A誘導(dǎo)的脾T淋巴細(xì)胞增殖活性和LPS誘導(dǎo)的脾B淋巴細(xì)胞增殖活性均明顯升高(P＜0.01)，血清中抗CⅡ抗體水平顯著增高(P＜0.01);與模型組比較，TP 0.2和0.4 mg·kg－1組可抑制Con A誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)(P＜0.01)，血清抗CⅡ抗體水平降低(P＜0.01);TP 0.1 mg·kg－1對(duì)上述指標(biāo)無(wú)明顯影響。

Tab.2 Effect of TP on arthritis index(AI)of CⅡ-induced arthritis model rats

Tab.3 Effect of triptolide on spleen T and B lymphocyte proliferation and serum anti-CⅡantibody of CⅡ-induced arthritis model rats

2.4 雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)CIA大鼠脾細(xì)胞因子IL-1β，TNF-α和IL-6含量的影響

如表4所示，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠脾細(xì)胞因子IL-1β，TNF-α和IL-6含量顯著升高(P＜0.01);與模型對(duì)照組相比，TP 0.2和0.4 mg·kg－1組與地塞米松2 mg·kg－1組各項(xiàng)指標(biāo)均顯著下降(P＜0.01)，TP 0.1 mg·kg－1組無(wú)明顯變化(P＞0.05)。

Tab.4 Effect of triptolide on levels of interleukin-1β(IL-1β)，tumor necrosis factor-α(TNF-α)and IL-6 in spleen tissue of CⅡ-induced arthritis model rats

2.5 TP 對(duì)CIA鼠足爪組織病理改變的影響

病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果(圖1)顯示，正常大鼠皮下組織細(xì)胞排列規(guī)則、緊密，無(wú)血管新生及炎性細(xì)胞浸潤(rùn);模型組大鼠皮下組織細(xì)胞排列不規(guī)則，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重，有明顯的血管增生現(xiàn)象。TP 0.2和0.4 mg·kg－1與地塞米松能明顯改變CIA大鼠關(guān)節(jié)炎皮下組織細(xì)胞排列、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及血管增生現(xiàn)象，TP 0.1 mg·kg－1對(duì)改善CIA大鼠足部皮膚的病理狀況無(wú)明顯作用。

3 討論

雷公藤為衛(wèi)矛科植物，始載于《本草綱目拾遺》，藥用部分為去皮的根及根莖，中醫(yī)認(rèn)為其味辛苦性涼，歸肝腎經(jīng)，有祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)、消腫止痛和清熱解毒等功效［4］。雷公藤內(nèi)酯醇是雷公藤主要成分之一，具有明顯的抗炎、抗風(fēng)濕和免疫抑制作用［5］。

Fig.1 Effect of triptolide on paw skin pathological changes of CⅡ-induced arthritis model rats(HE×400).See Tab.1 for rat treatments.The rats were sacrificed at the 35th day，and the pathological changes of the rat paw were observed by light microscopy.A:normal;B:model，the subcutaneous tissue cells arranged derangement，inflammatory cells infiltrated and vascular proliferated;C:dexamethasone 2.0 mg·kg－1，dexamethasone could significantly improve the foot skin pathological changing;D:TP 0.1 mg·kg－1，no significant improvement in foot skin pathological changing;E and F:TP 0.2 and 0.4 mg·kg－1，the foot skin pathological changing was significantly improved.

CIA大鼠模型與佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA)模型相比，CIA模型的免疫功能變化不僅表現(xiàn)在細(xì)胞免疫，而且表現(xiàn)在體液免疫，由于這些特征更接近于臨床RA，因此CIA模型是篩選和研究治療RA藥物的理想模型［6］。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型對(duì)照組比較，TP 0.2和0.4 mg·kg－1可明顯改善CIA大鼠一般情況，降低AI，使關(guān)節(jié)炎癥狀明顯減輕，有效緩解體質(zhì)量下降，可見(jiàn)TP對(duì)CIA關(guān)節(jié)炎大鼠具有明顯的治療作用。

關(guān)于RA的病因和病理機(jī)制目前還不十分明確，但越來(lái)越多的研究表明，RA是一種典型的多因素誘發(fā)的自身免疫反應(yīng)性疾病，活化的T淋巴細(xì)胞在發(fā)病中起重要作用［7－8］。據(jù)報(bào)道，CIA大鼠淋巴細(xì)胞免疫功能紊亂，Th1/Th2比例失調(diào)，在抗原特異性T細(xì)胞的輔助下，刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體［9］。B淋巴細(xì)胞的主要功能是接受外來(lái)抗原刺激、增殖、發(fā)育為分泌抗體的漿細(xì)胞，并繼而產(chǎn)生抗體，是體液免疫的基礎(chǔ)。本研究結(jié)果表明，TP 0.2和0.4 mg·kg－1除可抑制CIA大鼠Con A誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖活性，還可降低LPS誘導(dǎo)的CIA大鼠B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，提示T細(xì)胞和B細(xì)胞共同參與了CIA的發(fā)病過(guò)程。另外，TP 0.2和0.4 mg·kg－1還能降低CIA大鼠血清抗CⅡ抗體水平，與文獻(xiàn)［8］報(bào)道相似，TP不僅可以通過(guò)抑制細(xì)胞免疫而且也可通過(guò)抑制體液免疫發(fā)揮其對(duì)CIA的治療作用。

IL-1β，TNF-α和IL-6是主要炎性細(xì)胞因子，在RA或?qū)嶒?yàn)性關(guān)節(jié)炎滑膜病變中起著重要的致病作用。TNF-α為居中心地位的促炎性細(xì)胞因子，它不僅具有誘導(dǎo)炎癥、酶的釋放、纖維細(xì)胞增生及組織損傷［9］，而且還是破骨細(xì)胞的活化因子，能引起骨和軟骨的吸收破壞，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生［11］。IL-6的作用主要在于誘導(dǎo)免疫球蛋白的產(chǎn)生及急性期蛋白的形成，除了對(duì)B細(xì)胞的效應(yīng)外，IL-6還參與T淋巴細(xì)胞的分化和活化，誘導(dǎo)T效應(yīng)細(xì)胞引起組織損傷;另外IL-6還能增強(qiáng)IL-1和TNF-α的效應(yīng)。IL-1β可誘導(dǎo)RA關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增殖，刺激滑膜細(xì)胞產(chǎn)生蛋白激酶，增強(qiáng)TNF-α和IL-6的效應(yīng)。IL-1β，TNF-α和IL-6的高水平分泌在免疫和炎癥反應(yīng)中有復(fù)雜的放大效應(yīng)，可導(dǎo)致細(xì)胞毒作用，介導(dǎo)免疫損傷。據(jù)報(bào)道，TP可降低CIA大鼠外周血清和關(guān)節(jié)腔中細(xì)胞因子水平，從而發(fā)揮對(duì)關(guān)節(jié)炎的治療作用［12］。本研究結(jié)果表明，TP 0.2和0.4 mg·kg－1能明顯抑制脾臟中IL-1β，TNF-α和IL-6等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，提示TP對(duì)CIA的治療還與其改善異常的細(xì)胞免疫功能有關(guān)。

綜上所述，抗體與免疫細(xì)胞分泌的大量細(xì)胞因子共同參與了CIA大鼠的發(fā)病過(guò)程，是引起關(guān)節(jié)慢性炎癥和其他癥狀的重要因素。TP可明顯改變大鼠關(guān)節(jié)組織病理變化，降低AI，緩解相關(guān)癥狀，其機(jī)制可能與其抑制增高的T和B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、調(diào)節(jié)CIA大鼠的免疫功能、使體內(nèi)炎性細(xì)胞因子分泌下降、從而對(duì)CIA大鼠產(chǎn)生特異性的免疫治療作用有關(guān)。

［1］Shi LP，Yang DQ，Zhou XG，Liu ZH.Effect of Tripterygium wilforldi Hook.on activity of proliferation and secretion of IL-6 and TNF-α in peripheral blood mononuclear cells in patients with rheumatoid arthritis［J］.Pract Prev Med(實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué))，2008，15(3):677-678.

［2］Chen Q，Wei W.Effects and mechanisms of glucosides of Chaenomeles speciosa on collagen-induced arthritis in rats［J］.Int Immunopharmacol，2003，3(4):593-608.

［3］Jin Y，Li J，Zhang YF，Li CY，Xu SY.The therapeutic action of actarit in typeⅡcollagen-induced arthritis mice and its mechanism［J］.Chin Pharm J(中國(guó)藥學(xué)雜志)，2001，36(12):814-817.

［4］Zhang QD，Shi YB，Tab WF，Wang F.Effect of triptolide on the changes of VEGF and MMP-9 levels in the rheumatoid arthritisfibroblast-likesynoviocyteline，MH7A［J］.Acta Univ Med Nanjing(Nat Sci)〔南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)〕，2008，28(7):902-905.

［5］Mao XD，Sun SJ，Pei ZY，Zhang LH.Inhibitory effect of triptolide on interleukin-18 and its receptor in rheumatoid arthritis synovial fibroblosts［J］.Chin J Cell Mol Immunol，2009，25(7):606-611.

［6］Zhu L，Wei W.Effects of total glucosides of paeony on immune functions in rats with collagen-induced arthritis［J］.Chin Pharm J(中國(guó)藥學(xué)雜志)，2007，42(20):1547-1551.

［7］Yocum DE.Tcells:pathogenic cells and therapeutic targets in rheumatoid arthritis［J］.Semin Arthritis Rheum，1999，29(1):27-35.

［8］Liu CF，Lin N，Jia HW，Xiao C，Zhang LS.Effect of triptolide on immunological function of mice with collagenⅡ-induced arthritis［J］.Chin J Inf TCM(中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志)，2004，11(7):602-604.

［9］Chen Y，Wei W，Wu H，Tang LQ，Wang XY，Yang YQ.Down-regulation effect of glucosides of Cheanomeles speciosa on the levels of serum antibodies in rats with adjuvant arthritis［J］.Chin Pharmacol Bull(中國(guó)藥理學(xué)通報(bào))，2007，23(7):941-944.

［10］Dayer JM，Beutler B，Cerami A.Cachectin/tumor necrosis factor stimulates collagenase and prostaglandin E2production by human synovial cells and dermal fibroblasts［J］.J Exp Med，1985，162(6):2163-2168.

［11］Peacock DJ，Banquerigo ML，Brahn E.Angiogenesis inhibition suppresses collagen arthritis［J］.J Exp Med，1992，175(4):1135-1138.

［12］Tu SH，Sheng DY，Hu YH，Zeng KQ.Interventional effects of triptolide on the levels of cytokines in peripheral serum and articular cavity of rats with collagen induced arthritis［J］.Chin J Clin Rehabilit(中國(guó)臨床康復(fù))，2006，10(39):183-185.

Effect of triptolide on collagen-induced arthritis and immune function in rats

LI Yi-chuan，LIU Guo-ling，SHEN Yong-jie，ZHANG Yu-xia，HU Ling-wei
(Department of Biochemistry and Molecular Biology，Shangqiu Medical College，Shangqiu476100，China)

OBJECTIVETo investigate the effect of triptolide(TP)on collagen-induced arthritis(CIA).METHODSChicken typeⅡcollagen(CⅡ)was used to induce the CIA model.Dexamethasone 2.0 mg·kg－1or TP 0.1，0.2 and 0.4 mg·kg－1was im given to rats，once for 3 d，until 35 d.The change of the rats，the paw swelling degree and the articular index(AI)were observed.On the 3 5th day，the rats were sacrificed and the histopathological changes in paw tissues were observed by HE staining.The proliferation of spleen T and B lymphocytes was detected by MTT assay.The level of interleukin-1β(IL-1β)，TNF-α and IL-6 in spleen tissue homogenate and anti-CⅡIgG antibody in serum was examined by ELISA.RESULTSCompared with normal control group，the joint of rats in model group showed swelling，the surface of skin shined and congested，and AI rose.The proliferation of spleen T and B lymphocytes，the level of anti-CⅡIgG antibody in serum and the content of IL-1β，TNF-α and IL-6 in the spleen all significantly increased(P＜0.01).The subcutaneous tissue cells of the rat paw became deranged，inflammatory cells infiltrated and blood vessels proliferated.TP 0.2 and 0.4 mg·kg－1was able to improve the general situation of CIA rats，significantly inhibit the paw swelling degree and reduce AI.AI on the 22nd，26th，30th and 35th day was reduced from 7.3±0.7，6.3±0.8，4.7±0.7 and 4.3±0.2 in model group to 5.6±0.6，4.9±0.7，3.9±0.5 and 2.8±0.7 for TP 0.2 mg·kg－1，and 5.1±0.8，4.1±0.4，3.3±0.6 and 2.7±0.6 for TP 0.4 mg·kg－1(P＜0.01).The proliferation of spleen T and B lymphocytes was also suppressed.In TP 0.2 and 0.4 mg·kg－1groups，the level of anti-CⅡIgG antibody in serum(A490nm)was reduced from 0.765±0.018 in model group to 0.583±0.024 and 0.575±0.034(P＜0.01)，IL-1β content in spleen tissue was reduced from(159±23)ng·L－1to 90±15 and(79±15)ng·L－1，TNF-α from(125±23)ng·L－1to 94±16 and(83±17)ng·L－1，and IL-6 from(250±16)ng·L－1to 193±18 and(180±18)ng·L－1(P＜0.01).TP 0.2 and 0.4 mg·kg－1could reduce the inflammatory cell infiltration and angiogenesis of rat paws.TP 0.1 mg·kg－1had no significant effect on the above indicators.CONCLUSIONTP can improve the immune function of CIA model rats.TP has therapeutic effect on CIA.

triptolide;collagen typeⅡ;arthritis，rheumatoid;pathology;immunocyte

The project supported by Science and Tehnology Development Project of Shangqiu City of Henan Province in 2011(20115004)

LI Yi-chuan，Tel:(0370)3263366，E-mail:yichuan_Li@126.com

R285.5

A

1000-3002(2012)04-0540-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.04.013

河南省商丘市2011年科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20115004)

李宜川(1960－)，女，副教授，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。

李宜川，E-mail:yichuan_Li@126.com，Tel:(0370)3263366

2012-03-23接受日期:2012-06-12)

(本文編輯:齊春會(huì))