補骨脂素和異補骨脂素對體外細胞色素P450酶活性的抑制和誘導作用

鐘玉環(huán)，沈國林，原梅，劉萬卉，李樺

(1.煙臺大學藥學院，山東煙臺265300;2.軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所，北京100850)

補骨脂素和異補骨脂素對體外細胞色素P450酶活性的抑制和誘導作用

鐘玉環(huán)1，2，沈國林2，原梅2，劉萬卉1，李樺2

(1.煙臺大學藥學院，山東煙臺265300;2.軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所，北京100850)

目的探討補骨脂素(PSO)和異補骨脂素(IPSO)對細胞色素P450(CYP)活性的抑制和誘導作用。方法將人肝微粒體或鼠肝微粒體與PSO或IPSO以及CYP特異性探針底物共孵育30 min，分別以非那西丁O-脫乙基、甲苯磺丁脲4-羥基化、美芬妥因-4-羥基化、右美沙芬O-脫甲基化和咪達唑侖1'-羥基化為同工酶CYP1A2，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6(大鼠2D2)和CYP3A4(大鼠3A1/2)代謝活性的標志，用HPLC-MS/MS法檢測相應代謝產物的生成量并計算相應的IC50值，評價PSO和IPSO對5種CYP同工酶的潛在抑制作用。將PSO和IPSO或陽性誘導劑與“三明治”培養(yǎng)大鼠肝原代細胞共孵育72 h后，再加入CYP探針底物孵育1 h，檢測相應代謝產物的生成量，與陽性誘導劑組比較，評價二者對CYP1A和CYP3A的誘導作用。結果PSO和IPSO對人肝微粒體和鼠肝微粒體的CYP1A2均有較強的抑制作用，在人肝微粒體中的IC50值分別為0.17和0.13 μmol·L－1;在鼠肝微粒體中的IC50值分別為0.47和0.36 μmol·L－1。二者對人肝微粒體的CYP2D6也有中等強度的抑制作用，IC50值分別為3.59和9.51 μmol·L－1。PSO和IPSO 100 μmol·L－1可分別將大鼠肝細胞的CYP3A活性提高1.18和0.96倍，有一定的誘導作用。結論PSO和IPSO能顯著抑制CYP1A2酶活性，對CYP3A有一定的誘導作用。

補骨脂素類;異補骨脂素;細胞色素類;藥物相互作用;微粒體，肝

補骨脂素(psoralen，PSO)和異補骨脂素(isopsoralen，IPSO)屬于呋喃香豆素類化合物，主要存在于補骨脂、無花果、獨活和北沙參等中藥中，具有抗腫瘤、抗白血病、擬雌激素、補骨及治療白癜風等皮膚頑疾等藥理作用［1－3］，在臨床上廣泛應用，是補骨脂酊、白癜風片、仙靈骨葆膠囊和益腎補血膠囊等多個中藥復方和制劑中的主要成分。血清動力學研究表明，PSO和IPSO是服用補骨脂水煎劑大鼠血清中的主要活性成分［4］。呋喃香豆素類化合物與CYP450酶的相互作用非常復雜，它們通常由CYP酶介導代謝，也可以抑制CYP酶的活性［5］。有報道，雄性小鼠連續(xù)28 d服用PSO和IPSO后，肝臟CYP3A11的活性和蛋白水平顯著增高，CYP2E1的活性和蛋白水平則減低［6］。但PSO和IPSO對CYP同工酶抑制和誘導作用的系統(tǒng)研究尚未見報道。

CYP酶是最重要的藥物代謝酶，參與約75%臨床藥物的體內代謝，其中CYP1A2，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6和CYP3A4是介導臨床藥物代謝的5個主要的CYP同工酶，對CYP酶的誘導和抑制是藥物臨床產生代謝性相互作用的主要原因［7－8］。近年來，服用中草藥制劑引起的不良反應受到較大的關注。文獻報道，在同時服用化學藥品和中草藥制劑或天然補劑的人群中，約有40%的患者可能因中草藥-化學藥品的相互作用導致不良反應［8］。中草藥制劑中的各種有效成分對CYP酶產生誘導或抑制作用可以引起合用藥物藥代動力學行為的改變，從而產生代謝性相互作用。因此，了解中藥有效成分對CYP酶的誘導和抑制潛能，對于降低臨床藥-藥相互作用的風險、提高用藥安全性具有重要意義。本研究在體外系統(tǒng)中以非那西丁O-脫乙基、甲苯磺丁脲4-羥基化、美芬妥因-4-羥基化、右美沙芬O-脫甲基化和咪達唑侖1'-羥基化為5種同工酶代謝活性的標志，評價PSO和IPSO對5個主要人CYP同工酶的抑制作用以及對大鼠肝細胞CYP1A和3A酶的誘導作用，并比較其對大鼠CYP1A2的抑制活性，為兩藥的臨床合理應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

PSO、IPSO、咪達唑侖和鹽酸普萘洛爾購自中國藥品和生物制品檢定所;非那西丁、甲苯磺丁脲、S-美芬妥因和右美沙芬購自美國Sigma公司;對乙酰氨基酚(撲熱息痛)、4-羥基甲苯磺丁脲、4-羥基美芬妥因、右啡烷和1'-羥基咪達唑侖均購自美國BD Gentest公司;CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4陽性抑制劑α-萘黃酮、磺胺苯吡唑、反苯環(huán)丙胺、奎尼丁和酮康唑，以及CYP1A和CYP3A的陽性誘導劑3-甲基膽蒽和苯巴比妥鈉購自Sigma公司。甲醇和乙腈為色譜純，購自美國Fisher公司，其他試劑為分析純。

50人混合肝微粒體(蛋白含量20 g·L－1，批號:34689)購自美國BD Gentest公司。20只雄性SD大鼠混合肝微粒體為實驗室自制，蛋白含量10 g·L－1。NADPH購自瑞士Roche公司。Agilent 6410B液質聯用儀和ZORBAX SB-C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，3.5 μm)為美國Agilent公司產品。

1.2 動物

雄性SD大鼠，體質量200～240 g，由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK-(軍)2007-004。

1.3 大鼠肝原代細胞的分離和培養(yǎng)

按照文獻［9］采用兩步灌流法分離獲得大鼠肝原代細胞，以“三明治”夾心培養(yǎng)法［10］培養(yǎng)分離獲得的肝原代細胞。

1.4 LC-MS/MS定量檢測CYP探針底物的代謝產物

色譜條件:流動相A為含有0.1%甲酸和甲酸銨5 mmol·L－1溶液，B為含有0.1%甲酸的乙腈。洗脫梯度程序為30%B(0 min)，95%B(0.5～1.5 min)，30%B(1.8～2.5 min)，運行時間2.5 min，流速0.3 ml·min－1。內標為鹽酸普萘洛爾100 μg·L－1。

質譜條件:以ESI源正離子MRM方式檢測，毛細管溫度300℃，毛細管電壓+4000 V，碰撞能為120 V，各代謝產物的選擇性檢測離子對如表1所示。

1.5 PSO和IPSO在人和大鼠肝微粒中IC50的測定

孵育體系為200 μl的K2HPO4/KH2PO4緩沖液0.05 mol·L－1(pH 7.4)，含有人肝微粒體(human live microsomes，HLM)或大鼠肝微粒體(rat liver microsomes，RLM)(終濃度0.2 g·L－1)，NADPH 1 mmol·L－1，受試藥物或陽性抑制劑，CYP1A2，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6和CYP3A4的探針底物非那西丁50 μmol·L－1，甲苯磺丁脲120 μmol·L－1，S-美芬妥因40 μmol·L－1，右美沙芬5 μmol·L－1和咪達唑侖5 μmol·L－1，在Km值上下選擇各探針底物實驗濃度。

Tab.1 LC-MS/MS MRM transition and CYP probe metabolites

實驗設置空白對照組、陽性抑制劑對照組以及PSO和IPSO組。PSO和IPSO分別為0，0.0015，0.005，0.015，0.05，0.15，0.5，1.5，5，15，50和100 μmol·L－1;陽性抑制劑α-萘黃酮(CYP1A2)、奎尼丁(CYP2D6)和酮康唑(CYP3A)分別為0，0.003，0.015，0.06，0.3，1.5和6 μmol·L－1;磺胺苯吡唑(CYP2C9)分別為0，0.03，0.15，0.6，3，15和60 μmol·L－1;反苯環(huán)丙胺(CYP2C19)濃度為0，0.3，1.5，6，30，150和600 μmol·L－1;每個濃度重復3次。

孵育實驗開始前先將配制在K2HPO4/KH2PO4緩沖液中的肝微粒體與各CYP酶的探針底物和不同濃度的藥物或陽性抑制劑混合，37℃水浴預孵育5 min后加入同樣已預孵育5 min的NADPH啟動反應，37℃孵育30 min，在孵育終點用200 μl含有鹽酸普萘洛爾100 μg·L－1的甲醇∶乙腈(1∶1)溶液終止反應，13 000×g，4℃下離心10 min，取上清液進樣定量分析各底物的代謝產物生成量，測得酶活性。將肝微粒體陽性抑制劑組的IC50值與文獻比較，驗證體外實驗體系的可靠性。

1.6 PSO和IPSO對大鼠肝原代細胞CYP酶的誘導性測定

將藥物母液以0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌后用細胞培養(yǎng)液配制含藥培養(yǎng)液:苯巴比妥鈉2 mmol·L－1、3-甲基膽蒽5 μmol·L－1;PSO和IPSO 1，10和100 μmol·L－1(最高濃度根據MTT測定結果確定);CYP探針底物咪達唑侖10 μmol·L－1，非那西丁50 μmol·L－1。

實驗平行設置空白對照組、陽性誘導劑對照組以及PSO和IPSO組。用陽性誘導劑或受試藥的含藥細胞培養(yǎng)液誘導“三明治”培養(yǎng)肝原代細胞，連續(xù)3 d，每個濃度重復3次。3 d誘導期結束后，吸去含藥培養(yǎng)液，換用等體積含CYP1A或CYP3A探針底物的細胞培養(yǎng)液孵育1 h。在孵育終點取孵育液200 μl，用200 μl含內標的甲醇∶乙腈(1∶1)終止反應，13 000×g，4℃離心10 min，取上清液進樣定量分析各底物代謝產物的生成量，測得酶活性。將陽性對照組的酶活性與空白對照組進行比較，酶活性提高2倍以上表明誘導模型建模成功。

1.7 PSO和IPSO對CYP酶抑制或誘導作用的數據處理

CYP酶抑制作用的評價以IC50值為指標，IC50值計算如下:通過測定探針底物代謝產物的生成量確定CYP酶的相對活性，由公式1計算不同濃度藥物作用下的相對酶活性Er:

式中，ci(n)為不同濃度藥物組測得的代謝產物量;ci(0)為空白對照組的代謝產物量。用Graph Pad Prism 5軟件將相對酶活性Er對藥物濃度的對數值作圖，并計算IC50值。

CYP酶誘導評價:參照美國FDA 2006年9月發(fā)布的《藥物相互作用研究指導原則草案》［11］，以藥物組酶活性相對于陽性誘導劑組酶活性的百分比評價受試藥物對CYP1A和CYP3A酶活性的誘導作用，藥物組的酶活性改變≥空白對照組的40%可判定受試藥具有酶誘導作用。由公式②計算相對于陽性對照組的百分比。

式中，Er代表受試藥的相對誘導百分比，c藥物，c對照和c陽性對照分別代表藥物組、空白對照組和陽性對照組探針底物代謝產物生成量。

2 結果

2.1 CYP酶探針底物代謝產物的HPLC-MS/MS檢測方法確證

肝微粒體和肝細胞培養(yǎng)液中的物質均不干擾各代謝產物的檢測，各代謝產物的線性范圍為1～1000 μg·L－1，r2值均大于0.99;通過測定高中低3個濃度質控樣品的批內和批間相對標準差(RSD)和相對誤差(RE)評價方法的精密度和準確度，各代謝產物的批內RSD＜8.4%，批間RSD＜12.8%;批內RE在－2.68%～7.37%，批間RE－6.47%～9.58%;回收率均＞81.6%。所建檢測方法符合定量要求。

2.2 PSO和IPSO對CYP酶抑制活性評價

CYP特異性抑制劑均能顯著地抑制CYP1A2，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6和CYP3A4的活性，得到的抑制曲線呈現典型的倒S形特征，經計算所得的IC50值符合參考文獻范圍［12］，表明所用的實驗體系可以滿足CYP酶抑制活性評價的要求。

由PSO和IPSO 100 μmol·L－1對HLM中5種CYP同工酶活性的抑制率(表2)可見，PSO和IPSO 100 μmol·L－1對CYP1A2的抑制都達到100%，對CYP2C19和CYP2D6的抑制率大于80%;而對CYP2C9和CYP3A4的抑制率約50%，抑制作用較弱，預測其IC50值將在100 μmol·L－1或更高。

將剩余酶活性對對數抑制濃度作圖，得到PSO和IPSO對CYP同工酶的抑制曲線，以CYP1A2為代表的抑制曲線見圖1(A，B)。由抑制曲線計算得到的IC50值(表3)。按照通用的CYP酶抑制劑強度分級規(guī)則［13］，IC50＜1 μmol·L－1為強抑制劑，1＜IC50＜10 μmol·L－1為中等強度抑制劑，IC50＞10 μmol·L－1為弱抑制劑。因此，在HLM中，PSO和IPSO均為CYP1A2的強抑制劑，IC50值分別為0.17和0.13 μmol·L－1;同時PSO和IPSO是CYP2D6的中等程度抑制劑，IC50值分別為3.59和9.51 μmol·L－1;PSO和IPSO對CYP3A4和CYP2C9的IC50值均大于100 μmol·L－1，在臨床上產生顯著酶抑制作用的可能性較小。對于CYP2C19，雖然PSO和IPSO 100 μmol·L－1酶抑制率大于90%，但不同濃度的抑制實驗未能獲得規(guī)律性的結果，因此無法計算IC50值。

Tab.2 Inhibitory effect of psoralen(PSO)and isopsoralen(IPSO)on human liver microsomes(HLM)CYP isoenzymes

Tab.3 IC50of PSO and IPSO on HLM CYP isoenzymes

本研究在RLM孵育體系中以上述的同工酶特異性反應，評價了PSO和IPSO對RLM CYP1A2，2D2和3A1/2酶的抑制作用。平行設置的陽性抑制劑組的結果顯示，RLM中這幾個CYP同工酶的活性正常。PSO和IPSO 100 μmol·L－1對大鼠CYP同工酶活性的抑制率如表4所示。PSO和IPSO對RLM CYP1A2的抑制也達到100%，對CYP3A1/2酶沒有顯著的抑制作用。在RLM孵育體系中，PSO和IPSO對CYP2D2的抑制率僅分別為36.4%和60.6%。

由PSO和IPSO對大鼠CYP1A2的抑制曲線圖1C和D計算得到IC50值。在RLM中，PSO和IPSO也表現為CYP1A2的強抑制劑，IC50值分別為0.47和0.36 μmol·L－1。PSO和IPSO對CYP3A1/2和CYP2D2的IC50值均＞100 μmol·L－1，產生顯著酶抑制的可能性較小。

Tab.4 Inhibitory effect of PSO and IPSO on rat liver microsomes(RLM)CYP isoenzymes

2.3 PSO和IPSO對CYP酶誘導活性評價

CYP1A和CYP3A的陽性誘導劑3-甲基膽蒽和苯巴比妥鈉與“三明治”夾心培養(yǎng)大鼠肝原代細胞孵育3 d后均能顯著誘導兩個同工酶的活性，誘導倍數分別為4.01和3.24，驗證了本研究所用大鼠肝細胞誘導模型的可行性。PSO和IPSO 1～100 μmol·L－1顯示出對大鼠肝原代細胞CYP1A活性的抑制作用。底物非那西丁100 μmol·L－1代謝產物的生成濃度低于LC-MS/MS檢測的定量限，與肝微粒體抑制實驗的結果相符。

Fig.1 Inhibitory effect of PSO and IPSO on CYP1A2 of HLM(A and B)and RLM(C and D).See Tab.2 for the incubation system and procedure.

如表5所示，PSO和IPSO 100 μmol·L－1與肝細胞孵育3 d后能將CYP3A的活性分別提高1.18和0.96倍，PSO和IPSO引起的酶活性改變均超過陽性對照組的40%。而PSO和IPSO 1～10 μmol·L－1未能引起酶活性的顯著改變。由此可知，PSO和IPSO在較高濃度對CYP3A有一定的誘導作用。

Tab.5 Induction effect of PSO and IPSO on CYP3A in RLM

3 討論

本研究評價了PSO和IPSO對5個主要CYP酶的抑制活性，這5個CYP酶介導了約90%臨床藥物的代謝轉化，是藥物相互作用評價的重點［7］。在體外孵育體系中PSO和IPSO對人和大鼠肝微粒體的CYP1A2均表現出強烈的抑制作用，IC50值均小于1 μmol·L－1。人類CYP1A2主要在肝表達，其含量約占肝總CYP氧化酶含量的13%，僅次于CYP3A和CYP2C家族。在人體內CYP1A2參與了華法林、咖啡因、安替比林、對乙酰氨基酚、茶堿、維拉帕米、硝苯地平和丙米嗪等20多種藥物的代謝轉化［14］。本研究結果提示，當PSO和IPSO與這些藥物合用時，存在CYP1A2酶抑制的藥-藥相互作用風險。此外，兩藥對CYP2D6和CYP2C19也表現出一定的抑制作用。

由于CYP3A和2C家族酶誘導是PXR受體活化導致的，CYP1A的誘導則由AhR受體介導［8］，而CYP2D通常不被誘導，因此本研究首選CYP1A和3A作為酶活性誘導評價的對象。在大鼠肝細胞上高濃度的PSO和IPSO能誘導CYP3A1/2酶，這與小鼠連續(xù)服用兩藥后能誘導肝臟CYP3A11酶活性的報道相符［6］。美國FDA指導原則草案建議［11］，如果誘導評價結果顯示受試藥對CYP3A有誘導作用，則應進一步在體內研究中考察對CYP2C和CYP2B的誘導作用。因此，有必要在進一步的研究中評價PSO和IPSO對CYP2C同工酶的誘導作用。

本研究應用酶活性測定作為評價終點，這是美國FDA指南草案推薦的酶抑制活性評價方法，以及酶誘導評價的方法之一［11］。這一方法的優(yōu)點在于其評價酶功能的改變，直接反映了藥物抑制或誘導CYP酶對活性的影響，可以用于評估抑制或誘導的臨床意義，因為只有酶活性的改變才能在臨床上表現出對自身或其他合用藥物清除率的影響。但在酶誘導評價中這一方法存在不足，當受試藥對CYP酶有較強的抑制作用時，有可能掩蓋其對酶的誘導潛能［15］。在本研究大鼠肝細胞實驗中，當PSO和IPSO連續(xù)誘導肝細胞3 d后，觀察到它們對CYP1A2酶活性的抑制作用。因此，PSO和IPSO對CYP1A2的誘導潛能還需要通過進一步測定mRNA水平或蛋白水平的變化來確定。

CYP酶的種屬差異已有較多的報道［16］。盡管CYP酶超級家族的所有成員具有高度保守的氨基酸殘基區(qū)域，但種屬之間在CYP酶初級氨基酸序列上存在一些小的差異，這些小的變化能引起底物特異性和酶催化活性上較大的差異。在人和大鼠之間，除了CYP1A2具有較高的同源性外，其他酶的分布、表達和活性均有較大差異，特別是CYP2C酶。在本研究的RLM孵育體系中，PSO和IPSO對大鼠CYP2D2的抑制率僅分別為36.4%和60.6%，明顯低于其對HLM CYP2D6活性的抑制作用，這可能是因為CYP2D在人和大鼠之間的種屬差異所致。因此，酶抑制和誘導的體外評價還應以人源材料為首選，人肝微粒體或人肝細胞的研究結果可以得到更為合理的體外-體內的外推。

綜上所述，本研究評價了兩個呋喃香豆素有效成分PSO和IPSO的酶抑制和誘導活性，結果顯示，PSO和IPSO是CYP1A2的強抑制劑及CYP2D6的中等抑制劑;PSO和PISO 100 μmol·L－1對大鼠CYP3A1/2有一定的誘導作用。PSO和IPSO對CYP酶抑制或誘導可能產生的相互作用及其臨床意義，還應進一步進行動物或人體研究。

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Evaluation of cytochrome P450 inhibition and induction by psoralen and isopsoralen in vitro

ZHONG Yu-huan1，2，SHEN Guo-lin2，YUAN Mei2，LIU Wan-hui1，LI Hua2
(1.School of Pharmacy，Yantai University，Yantai265300，China;2.Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing100850，China)

OBJECTIVETo evaluate inhibitory and inductory activities of psoralen(PSO)and isopsoralen(IPSO)on cytochrome P450(CYP)isoforms.METHODSPSO or IPSO was incubated with human liver microsomes(HLM)or rat liver microsomes(RLM)for 30 min in the presence of NADPH and CYP probe substrates for CYP1A2，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6 and CYP3A4.Phenacetin-O-deethylation，tolbutamide methyl hydroxylation，mephenytoin 4-hydroxylation，dextromethorphan-O-demethylation and midazolam 1'-hydroxylation were used as marked reactions to measure enzyme activities.The relative activities of CYP isoforms were determined by ana-lyzing the formation of the probe metabolites in the incubation system.IC50was calculated to assess the inhibitory potency of PSO and IPSO on these CYP isoenzymes.To evaluate CYP induction effect，PSO，IPSO or known CYP inducers were incubated with sandwich-cultured rat hepatocytes for 72 h，followed by 1 h incubation of the hepatocytes with CYP1A or 3A substrates to measure the relative activities of CYP isoforms.The enzyme activities in PSO and IPSO groups were compared with those of known inducers to assess the induction potentials.RESULTSPSO and IPSO showed a strong inhibitory activity on CYP1A2 in both HLM and RLM incubations in vitro.IC50of PSO and IPSO in HLM was 0.17 and 0.13 μmol·L－1，0.47 and 0.36 μmol·L－1in RLM，respectively.A moderate inhibitory activity of PSO and IPSO on CYP2D6 in HLM was also observed，with IC50of 3.59 and 9.51 μmol·L－1.PSO and IPSO 100 μmol·L－1demonstrated inductory activity on rat CYP3A.After incubation with rat hepatocytes for 72 h，PSO and IPSO increased CYP3A activity 1.18 and 0.96 times，respectively.CONCLUSIONPSO and IPSO are strong inhibitors of CYP1A2 but moderate inhibitors for CYP2D6.They also show induction potency on rat CYP3A.

psoralens;isopsoralen;cytochromes;drug interactions;microsomes，liver

The project supported by National Mega-project of Science Research of China(2012ZX09301003);and National Mega-project of Science Research of China(2008ZXJ09006-001)

LI Hua，E-mail:amms_hli@126.com，Tel:(010)66930664

R975

A

1000-3002(2012)04-0522-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.04.010

2012-03-07接受日期:2012-04-13)

(本文編輯:付良青)