大蒜素對(duì)慢性鐵中毒大鼠氧化應(yīng)激與肝細(xì)胞自噬的抑制作用

劉重斌，王瑞，董繆武，吳博，肖敏

(1.湖州師范學(xué)院醫(yī)學(xué)院生理與藥理學(xué)教研室，浙江湖州313000;2.溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，浙江溫州325035)

大蒜素對(duì)慢性鐵中毒大鼠氧化應(yīng)激與肝細(xì)胞自噬的抑制作用

劉重斌1，王瑞1，董繆武2，吳博2，肖敏2

(1.湖州師范學(xué)院醫(yī)學(xué)院生理與藥理學(xué)教研室，浙江湖州313000;2.溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，浙江溫州325035)

目的探討大蒜素(allicin)對(duì)慢性鐵中毒大鼠氧化應(yīng)激與肝細(xì)胞自噬的抑制作用及可能機(jī)制。方法36只SD大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為6組，即正常對(duì)照(飼喂基礎(chǔ)飼料)、慢性鐵中毒模型(飼喂高鐵飼料)、正常+大蒜素40 mg·kg-1、慢性鐵中毒+大蒜素30，40和60 mg·kg-1組，每組6只。持續(xù)飼喂6周后，取血及肝、結(jié)腸和腎組織用試劑盒測(cè)定鐵含量、總鐵結(jié)合力、丙二醛(MDA)含量及總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性。透射電鏡和免疫組織化學(xué)方法觀察肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、自噬以及胱天蛋白酶3凋亡蛋白、Ki-67細(xì)胞增殖抗原和LC3-B微管相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果與正常對(duì)照組比較，模型組血清鐵含量增加(P＜0.01)，總鐵結(jié)合力下降(P＜0.01)，肝和結(jié)腸組織鐵含量增加(P＜0.05)。與模型組比較，飼喂不同劑量大蒜素大鼠血清鐵含量顯著下降(P＜0.05)，總鐵結(jié)合力顯著增加(P＜0.05)，結(jié)腸組織鐵含量顯著下降(P＜0.05);飼喂大蒜素40和60 mg·kg-1肝組織鐵含量顯著下降(P＜0.05)。與正常對(duì)照組比較，模型組肝和結(jié)腸組織MDA含量顯著增加(P＜0.05)，肝組織T-SOD活性增加(P＜0.01)，結(jié)腸組織T-SOD活性下降(P＜0.01)。與模型組比較，飼喂大蒜素組肝組織MDA含量顯著下降(P＜0.05)，結(jié)腸和腎組織T-SOD活性顯著增加(P＜0.05)。與正常對(duì)照組比較，模型組肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞Ki-67增殖抗原表達(dá)顯著增加(P＜0.05)，胱天蛋白酶3凋亡蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化(P＞0.05)。觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，模型組大鼠肝細(xì)胞有大量鐵蛋白顆粒累積，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜膨脹，胞質(zhì)中形成自噬前體。模型組大鼠肝細(xì)胞LC3-B微管相關(guān)蛋白有較強(qiáng)表達(dá)，正常對(duì)照和正常+大蒜素組肝細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)LC3-B免疫陽(yáng)性染色。結(jié)論大蒜素能有效清除體內(nèi)自由基，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，降低肝中鐵誘導(dǎo)的氧化壓力、線粒體膜的改變和細(xì)胞自噬，對(duì)慢性鐵中毒肝細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。

大蒜素;鐵中毒;氧化應(yīng)激;自噬

鐵是機(jī)體最多的微量元素，在能量代謝、細(xì)胞增殖和DNA修復(fù)中起重要作用［1-3］。而機(jī)體過(guò)多的自由鐵卻通過(guò)催化Fenton反應(yīng)生成具有高度反應(yīng)活性的羥自由基，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，從而損害機(jī)體的一些基本成分，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷和凋亡［4-5］。大蒜素(allicin)是從藥用植物大蒜(Allium sativum L.)的球形鱗莖中提取的一種有機(jī)硫化合物(diallyldisulfid-S-oxide)，也存在于洋蔥和其他蔥科植物中。研究表明，大蒜素具有抗菌、消炎、抗氧化、抗血栓、降血壓、維持脂蛋白平衡和防治動(dòng)脈硬化等功效［6-8］。但目前關(guān)于大蒜素對(duì)機(jī)體鐵代謝的作用及其對(duì)慢性鐵中毒大鼠氧化應(yīng)激與細(xì)胞自噬保護(hù)作用的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道甚少。本研究通過(guò)制備慢性鐵中毒SD大鼠模型，同時(shí)飼喂不同劑量的大蒜素，探討大蒜素對(duì)慢性鐵中毒大鼠氧化應(yīng)激與細(xì)胞自噬的保護(hù)作用及可能機(jī)制，為慢性鐵中毒相關(guān)疾病的日常營(yíng)養(yǎng)和藥理研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥物、主要試劑和儀器

雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量196～220 g，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證:浙22-005234。大蒜素軟膠囊購(gòu)自美國(guó)Herbalife公司，實(shí)驗(yàn)前用色拉油配制。鼠抗人胱天蛋白酶3凋亡蛋白單克隆抗體和兔抗人LC3-B微管相關(guān)蛋白多克隆抗體:碧云天生物技術(shù)有限公司;鼠抗人Ki-67細(xì)胞增殖抗原蛋白單克隆抗體、免疫組化SP法試劑盒和免疫組化二步法試劑盒:北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;丙二醛(malondialdehyde，MDA)、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)、考馬斯亮藍(lán)蛋白、血清鐵和總鐵結(jié)合力(total iron-binding capacity，TIBC)測(cè)定試劑盒:南京建成生物工程研究所;硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O):福建莆田市高嶼貿(mào)易有限公司;其余試劑均為市售分析純。722型分光光度計(jì):上海分析儀器廠;酶標(biāo)儀:荷蘭帕納科公司;H-7500型透射電鏡:日本日立公司。

1.2 動(dòng)物分組和給藥

大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常對(duì)照(飼喂基礎(chǔ)飼料，鐵含量為50 mg·kg-1)、慢性鐵中毒模型(飼喂高鐵飼料，鐵含量為1000 mg·kg-1)、正常+大蒜素40 mg·kg-1、慢性鐵中毒+大蒜素30，40和60 mg·kg-1共6組，每組6只。ig給予含大蒜素的色拉油，每天1次［4］。飼料飼喂前按要求進(jìn)行消毒處理，鐵含量采用原子吸收光譜法進(jìn)行測(cè)定。飼料中其他金屬元素含量保持正常不變。各組大鼠分籠飼養(yǎng)，溫度24～26℃，光照明12 h/暗12 h。大鼠自由飲食和飲水，飼喂處理持續(xù)6周。

1.3 樣品制備

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉，于腹主動(dòng)脈取血，1200×g離心10 min，取上清-20℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)，迅速取肝、結(jié)腸和腎，分別稱重后-80℃保存?zhèn)溆谩y(cè)定前制備各組織勻漿，稀釋成10%勻漿液，1200×g離心10 min，取上清，根據(jù)不同指標(biāo)稀釋成最佳濃度待測(cè)。

1.4 血清鐵、總鐵結(jié)合力及氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA和T-SOD測(cè)定

血清鐵和總鐵結(jié)合力及肝、結(jié)腸和腎組織鐵含量嚴(yán)格按照各試劑盒的方法測(cè)定并計(jì)算。氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA和T-SOD的測(cè)定，嚴(yán)格按照考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)用酶標(biāo)儀在595 nm處測(cè)定各組織中蛋白含量，分別用酶標(biāo)儀于532和550 nm處測(cè)定吸光度(A)值。

1.5 免疫組織化學(xué)染色

取肝組織4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。切片復(fù)水后，經(jīng)熱抗原修復(fù)和消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶之后，分別滴加鼠抗人胱天蛋白酶3單克隆抗體(1∶50)和兔抗人LC3-B多克隆抗體(1∶200)，4℃孵育過(guò)夜后，分別按照二步法試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行二抗孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片至顯微攝影。免疫組化常規(guī)SP法檢測(cè)肝組織Ki-67細(xì)胞增殖抗原表達(dá)(抗體1∶1000稀釋)。每組中每只大鼠胱天蛋白酶3和Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞在100倍視野下計(jì)數(shù)(棕褐色染色細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞)，分別計(jì)算凋亡細(xì)胞和增殖細(xì)胞數(shù)(用每平方毫米標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)計(jì)算)。

1.6 肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

各組大鼠麻醉后，迅速取肝組織經(jīng)2.5%戊二醛和1%鋨酸固定后，脫水、包埋、固化、超薄切片和染色后在透射電鏡下觀察并拍片。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大蒜素對(duì)慢性鐵中毒大鼠血清和組織鐵含量的影響

由表1看出，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清鐵含量顯著增加(P＜0.01)，總鐵結(jié)合力顯著下降(P＜0.01)，肝和結(jié)腸組織鐵含量顯著增加(P＜0.05)，而腎組織鐵含量無(wú)明顯變化。與模型組比較，模型+大蒜素各組大鼠血清鐵含量顯著下降(P＜0.05，P＜0.01)，總鐵結(jié)合力顯著增加(P＜0.05，P＜0.01);除腎組織外，各組大鼠肝和結(jié)腸組織鐵含量也顯著下降(P＜0.05)。

Tab.1 Effect of allicin on iron status of serum and tissues in iron-overloaded rats

2.2 大蒜素對(duì)慢性鐵中毒大鼠氧化應(yīng)激的影響

由表2可見(jiàn)，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肝組織MDA含量顯著增加(P＜0.05)，結(jié)腸組織MDA含量顯著增加(P＜0.01)，而腎組織MDA含量無(wú)明顯變化(P＞0.05);正常+大蒜素組大鼠肝組織MDA含量下降(P＜0.05)。與模型組比較，模型+大蒜素各組大鼠肝組織MDA含量顯著下降(P＜0.05)，除模型+大蒜素40 mg·kg-1組大鼠結(jié)腸組織MDA含量顯著下降(P＜0.05)，其他各組結(jié)腸和腎組織MDA含量均無(wú)明顯變化。與正常對(duì)照組比較，模型組和正常+大蒜素組肝組織T-SOD活性增加顯著(P＜0.01)，腎組織T-SOD活性無(wú)明顯變化;與模型組比較，模型+大蒜素各組大鼠結(jié)腸和腎組織T-SOD活性顯著增加(P＜0.05)，肝組織T-SOD活性無(wú)明顯變化。

2.3 大蒜素對(duì)慢性鐵中毒大鼠肝細(xì)胞增殖和凋亡的影響

胱天蛋白酶3免疫陽(yáng)性反應(yīng)并統(tǒng)計(jì)結(jié)果(圖1，表3)顯示，各組大鼠肝細(xì)胞凋亡數(shù)目無(wú)明顯變化。Ki-67免疫陽(yáng)性反應(yīng)并統(tǒng)計(jì)結(jié)果(圖2，表3)顯示，模型組與正常對(duì)照組比較，慢性鐵中毒顯著增加了肝細(xì)胞和肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞增殖(P＜0.05)，而且增殖的細(xì)胞主要是肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞;與模型組相比，模型+大蒜素40 mg·kg-1組肝細(xì)胞增殖無(wú)明顯變化，肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞增殖顯著降低(P＜0.05);模型+大蒜素40 mg·kg-1組肝細(xì)胞和肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞增殖數(shù)量與正常對(duì)照組比較明顯增加。

Tab.2 Effect of allicin on malonedialdehyde(MDA)content and total superoxide dismutase(T-SOD)activity in liver，colon and kidney tissue of iron-overloaded rats

Fig.1 Effect of allicin on hepatocyte apoptosis in liver tissue of iron-overloaded rats(Immunostaining×400).See Tab.1 for rat treatments.A:normal;B:iron model;C:normal+allicin 40 mg·kg-1;D:model+allicin 40 mg·kg-1.→:caspase 3 positive cells.

Fig.2 Effect of allicin on hepatocyte proliferation in liver tissue of iron-overloaded rats(Immunostaining×400).See Tab.1 for rat treatments.Ki-67 cell proliferation antigen immune reaction positive cells were detected by SP reagent kit.A:normal;B:iron model;C:normal+allicin 40 mg·kg-1;D:iron+allicin 40 mg·kg-1.↓:hepatocytes;→:non-parenchymal cells.

Tab.3 Effect of allicin on number of apoptotic cells and proliferation cells in hepatocytes and in non-parenchymal cells of iron-overloaded rats

2.4 大蒜素對(duì)慢性鐵中毒大鼠肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

肝細(xì)胞透射電鏡結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組(圖3A)比較，正常+大蒜素40 mg·kg-1組可見(jiàn)胞質(zhì)中累積了大量的脂滴(圖3B)。模型組大鼠肝細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)了大量的電子致密顆粒，這些鐵蛋白分子顆粒大多集中在膽小管附近及細(xì)胞連接處(圖3C);同時(shí)可見(jiàn)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹，胞膜發(fā)泡并出現(xiàn)內(nèi)陷(圖3D)。模型+大蒜素40 mg·kg-1組細(xì)胞質(zhì)中未見(jiàn)大量的電子致密顆粒，線粒體和內(nèi)質(zhì)肉結(jié)構(gòu)與正常對(duì)照組相似(圖3E)。

2.5 大蒜素對(duì)慢性鐵中毒大鼠肝細(xì)胞自噬的影響

Fig.3 Effect of allicin on ultrastructural changes in liver of iron-overloaded rats.See Tab.1 for rat treatments.A:normal;B:normal+allicin 40 mg·kg-1;C and D:iron model;E:iron+allicin 40 mg·kg-1.↑:iron-rich ferritin localized in the lumen and near the bile canaliculus along with lysosome;M:mitochondria.

肝細(xì)胞透射電鏡結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組(圖4A)比較，模型組肝細(xì)胞胞質(zhì)中先形成自噬前體，多呈新月形或半環(huán)形，隨著自噬前體不斷延長(zhǎng)和增大曲度，內(nèi)腔明顯變窄(圖4B)，這些自噬前體伴隨溶酶體和富含鐵的鐵蛋白分子，最終與溶酶體融合，內(nèi)容物被溶酶體酶降解(圖4C);正常+大蒜素40 mg·kg-1組(圖4D)胞質(zhì)中雖然累積了大量的脂滴，未見(jiàn)肝細(xì)胞自噬;模型+大蒜素組(圖4E)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)與與正常對(duì)照組相似，亦未見(jiàn)肝細(xì)胞自噬。LC3-B能識(shí)別微管相關(guān)蛋白親鏈，并與自噬小體膜特異性結(jié)合。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組肝細(xì)胞有較強(qiáng)的LC3-B免疫陽(yáng)性反應(yīng)，且免疫陽(yáng)性細(xì)胞主要集中在門(mén)脈區(qū)(圖5B);而模型+大蒜素40 mg·kg-1組肝細(xì)胞中LC3-B免疫陽(yáng)性染色明顯減弱(圖5D);正常對(duì)照組(圖5A)和正常+大蒜素40 mg·kg-1組未檢測(cè)到LC3-B免疫陽(yáng)性反應(yīng)(圖5C)。

Fig.4 Effect of allicin on hepatocyte autophagy in liver of iron-overloaded rats.See Tab.1 for rat treatments.A:normal;B and C:iron model;D:normal+allicin 40 mg·kg-1;E:iron+allicin 40 mg·kg-1.→:autophagic vacuoles with different shapes and stages containing iron-rich ferritin molecules.↑:iron-rich ferritin.

Fig.5 Effect of allicin on expression of LC3-B microtubule related protein in hepatocytes of iron-overloaded rats(Immunostaining).See Tab.1 for rat treatments.A:normal;B:iron model;C:normal+allicin 40 mg·kg-1;D:model+allicin 40 mg·kg-1.

3 討論

大蒜素為百合科植物大蒜鱗莖中所含的一種生物活性成分，具有清除自由基、預(yù)防心腦血管疾病、抗衰老和抗感染等多種藥理作用，尤其是對(duì)于防治心血管損傷的相關(guān)機(jī)制已有較多報(bào)道［9-11］。元素鐵由于其獨(dú)特的化學(xué)反應(yīng)活性，在維持細(xì)胞和機(jī)體正常代謝過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。機(jī)體多種疾病如帕金森病、阿爾茨海默病、鐵源性心臟病和慢性肝纖維化等的發(fā)生與鐵負(fù)荷有關(guān)［12-14］。肝是機(jī)體鐵超載的主要累積器官，鐵以Fe3+形式存在于鐵蛋白分子中，散在于細(xì)胞胞漿中或定位在溶酶體附近［12］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織中不僅蓄積了大量的致密鐵顆粒，而且在超微結(jié)構(gòu)上出現(xiàn)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的改變和腫脹，從而改變了線粒體膜的流動(dòng)性和DNA的完整性。過(guò)量鐵還通過(guò)降低細(xì)胞色素氧化酶C的活性，減弱了線粒體的呼吸作用，引起肝細(xì)胞的損傷和死亡。正常大鼠給予大蒜素，肝組織中積累了大量的脂滴，模型+大蒜素40 mg·kg-1大鼠肝組織電子致密的鐵蛋白儲(chǔ)存減少，線粒體膜結(jié)構(gòu)完整。

模型組大鼠血清、肝和結(jié)腸組織中鐵含量顯著增加，血清中TIBC明顯下降，可能是因?yàn)檠逯需F含量超過(guò)了鐵蛋白結(jié)合力時(shí)，聚集的鐵則以非鐵蛋白結(jié)合形式存在，這樣更易活化ROS并引起細(xì)胞損傷和死亡［15］。模型組大鼠肝和結(jié)腸組織中MDA含量顯著增加，脂質(zhì)過(guò)氧化嚴(yán)重，而模型+大蒜素大鼠通過(guò)減少血清和組織中鐵含量和增加鐵蛋白結(jié)合力，從而減少鐵引起的細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果還顯示，慢性鐵中毒顯著增強(qiáng)了肝T-SOD活性，而結(jié)腸組織T-SOD活性顯著下降，這是由于機(jī)體氧化應(yīng)激作用較弱時(shí)，組織中將過(guò)量表達(dá)SOD，以提高機(jī)體抗氧化系統(tǒng)能力，清除羥基，降低過(guò)氧化壓力，減少鐵負(fù)荷引起的大量毒性的活性氧。但在結(jié)腸組織中由于鐵含量的升高，持續(xù)產(chǎn)生大量的毒性ROS，T-SOD活性反而下降。本研究結(jié)果表明，大蒜素能穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，具有抗氧化作用，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)組織細(xì)胞的損傷。這可能是因?yàn)樵谥|(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)中抗氧化劑的阻斷，不能發(fā)生自由基連鎖反應(yīng)，使生物膜磷脂中的不飽和脂肪酸未受到氧化，不能生成過(guò)氧化脂質(zhì)。

肝組織免疫組化研究結(jié)果顯示，慢性鐵中毒不會(huì)引起細(xì)胞凋亡但會(huì)引起細(xì)胞增殖，表明這兩者之間是不平衡的。其中鐵誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖主要為肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，這可能是由于鐵沉積在肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致了這些細(xì)胞明顯增殖。而模型+大蒜素40 mg·kg-1組大鼠通過(guò)降低肝臟中鐵的累積，從而降低了鐵介導(dǎo)的細(xì)胞增殖。有研究表明，肝細(xì)胞增殖與肝細(xì)胞中D1蛋白的水平有關(guān)［14］。

自噬主要的生理功能是將胞質(zhì)中的大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、RNA和過(guò)量?jī)?chǔ)存的糖原等和一些細(xì)胞內(nèi)源性底物(包括由于生理或病理原因引起的衰老、破損的細(xì)胞器)在單位膜包裹的囊泡中大量降解，實(shí)現(xiàn)再循環(huán)，以維持細(xì)胞自身的穩(wěn)定［16-17］。自噬是細(xì)胞對(duì)持續(xù)性內(nèi)外刺激的非損傷性應(yīng)答反應(yīng)，以維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、代謝和功能的平衡。Kabeya等［18］報(bào)道，LC3-Ⅱ(B)在自噬體和自噬前體的內(nèi)外膜特異表達(dá)，表明微管參與自噬前體的組裝和自噬體的運(yùn)輸。LC3為微管相關(guān)蛋白1和輕鏈3，是酵母Atg8的同源體。LC3包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ，前者是可溶性的，后者結(jié)合于自噬結(jié)構(gòu)膜上。LC3-B的表達(dá)與自噬結(jié)構(gòu)形成成正比。自噬既可以作為一種防御機(jī)制清除胞質(zhì)內(nèi)受損的細(xì)胞器和代謝產(chǎn)物，進(jìn)行亞水平上的重構(gòu)，保護(hù)受損的細(xì)胞，同時(shí)它作為一種細(xì)胞死亡程序誘導(dǎo)細(xì)胞主動(dòng)性死亡。本研究結(jié)果顯示，正常對(duì)照組、正常+大蒜素組、模型+大蒜素40 mg·kg-1組很少檢測(cè)到自噬小體的存在，而模型組肝出現(xiàn)了形態(tài)改變伴隨細(xì)胞的增殖和自噬小體的增加。溶酶體在自噬中起重要作用，溶酶體與自噬小體相融合形成自噬溶酶體，在自噬溶酶體中大量的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)被酸性水解酶所降解。本研究結(jié)果顯示，電子致密的細(xì)胞液包涵體，也就是含有鐵沉淀物的溶酶體，在自噬小體附近或被其包圍。自噬大分子包含有鐵(鐵蛋白和線粒體)。因此，溶酶體膜是否發(fā)生過(guò)氧化，取決于鐵誘導(dǎo)的氧化壓力。

自噬能提供一個(gè)早期的適應(yīng)機(jī)制從而避免細(xì)胞凋亡。大蒜素可阻止肝和結(jié)腸中鐵誘導(dǎo)的氧化壓力和鐵誘導(dǎo)的線粒體膜的改變以及肝細(xì)胞的自噬，這可能是由于其自由基清除能力和抗氧化能力，而溶酶體主要存在于膽小管附近，表明這可能是鐵移出細(xì)胞的一個(gè)過(guò)程。

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Protective effect of allicin against oxidative stress and hepatocyte autophagy in iron-overloaded rats

LIU Chong-bin1，WANG Rui1，DONG Miao-wu2，WU Bo2，XIAO Min2
(1.Department of Physiology and Pharmacology，School of Medicine，Huzhou Normal College，Huzhou313000，China;2.Center of Animals，Wenzhou Medical College，Wenzhou325035，China)

OBJECTIVETo determine the inhibitory effect of allicin on oxidative stress，and hepatocyte autophagy and defence mechanisms.METHODSThirty-six SD rats were randomly divided into normal(basal diet，F(xiàn)e 50 mg·kg-1)，iron model(high iron diet，F(xiàn)e 1000 mg·kg-1)，normal+allicin 40 mg·kg-1(basal diet，ig given allicin)，iron model+allicin 30，40 and 60 mg·kg-1(high iron diet，ig given allicin)groups.These rats were fed for 6 weeks.Serum and tissue(the liver，colon and kidneys)iron concentrations，total iron-binding capacity(TIBC)，the level of malondialdehyde(MDA)and total superoxide dismutase(T-SOD)were quantified by reagent kit method.At the same time，the morphological changes of the liver，hepatocyte autophagy and caspase 3，Ki-67 and LC3-B protein expression were evaluated through ultrastructural observation and immunohistochemistry.RESULTSCompared with normal group，the serum iron concentration，TIBC and the liver and colon iron concentrations increased significantly in the iron model group(P＜0.05，P＜0.01).Compared with the iron model group，serum and colon iron concentrations decreased(P＜0.05)and TIBC increased(P＜0.05)in iron model+allicin groups;liver iron concentrations decreased significantly(P＜0.05)in iron model+allicin 40 and 60 mg·kg-1groups.Compared with normal group，the level of MDA in liver and colon and T-SOD activities in the liver increased(P＜0.05，P＜0.01)while T-SOD activities in the colon decreased significantly(P＜0.01).Compared with iron model group，the level of MDA in the liver decreased significantly(P＜0.05)while T-SOD activities in the colon and kidneys increased significantly(P＜0.05).Compared with normal group，cell proliferation increased significantly in hepatocytes and in non-parenchymal cells induced by iron supplementation in the iron model group(P＜0.05)，but caspase 3 immunostaining had no significant difference between these groups.In addition，iron was accumulated within the hepatic lysosomes where it triggered autophagy as evidenced by the formation of autophagic vesicles in the iron model group.It also induced morphologic alterations of the mitochondrial and endocytoplasmic reticulum membranes.In addition，LC3-B was strongly expressed in the iron model group，but was not expressed or attenuated in the normal and normal+allicin groups.CONCLUSIONAllicin can scavenge free radicals efficiently，enhance antioxidant properties，depress the iron-induced oxidation pressure and morphologic alterations of the mitochondrial membranes and cell autophagy.Allicin has potent protection effect on hepatocytes in chronic iron intoxication.

allicin;iron overload;oxidative stress;autophagy

The project supported by Natural Science Foundation of Zhejiang Province(Y2110388);Technological Research Program of Zhejiang Province(2009F80004);Technological Research Program of Zhejiang Province(2011C37091);and Technological Research Program of Wenzhou City(Y20100330)

XIAO Min，E-mail:xiaomin@sina.com

R151.1，R285.5

A

1000-3002(2012)04-0515-007

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.04.009

浙江省自然科學(xué)基金(Y2110388);浙江省科技廳項(xiàng)目(2009F80004);浙江省科技廳項(xiàng)目(2011C37091);溫州市科技項(xiàng)目(Y20100330)

劉重斌(1972-)，副教授，博士，主要從事?tīng)I(yíng)養(yǎng)生理學(xué)研究。

肖敏，E-mail:wzxiaomin@sina.com

2012-01-15接受日期:2012-05-16)

(本文編輯:齊春會(huì))