黃芪提取物與紅花總黃酮配伍對急性血瘀大鼠血液流變學的改善作用

馬旭，張可，韓淑燕，3，馬治中，屠鵬飛

(1.北京大學藥學院天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室，北京100191;2.國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作北京中心，北京100083;3.北京大學臨床腫瘤學院北京腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所惡性腫瘤發(fā)病機制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點實驗室，北京100142)

黃芪提取物與紅花總黃酮配伍對急性血瘀大鼠血液流變學的改善作用

馬旭1，2，張可1，韓淑燕1，3，馬治中1，屠鵬飛1

(1.北京大學藥學院天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室，北京100191;2.國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作北京中心，北京100083;3.北京大學臨床腫瘤學院北京腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所惡性腫瘤發(fā)病機制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點實驗室，北京100142)

目的觀察黃芪提取物(EAM)與紅花總黃酮(ECT)配伍對急性血瘀模型大鼠血液流變學指標的影響。方法大鼠隨機分為正常對照、急性血瘀模型、陽性對照阿司匹林100 mg·kg－1，EAM 400 mg·kg－1，ECT 200 mg·kg－1，EAM 400 mg·kg－1+ECT 200 mg·kg－1組。每天早晚各給藥1次，共7次。第5次給藥后，大鼠sc給予腎上腺素加冰浴制備急性血瘀模型。錐板法測定全血黏度和血漿黏度;微量毛細管法測定血細胞比容(Hct);光電比濁法測定二磷酸腺苷(ADP)誘導的血小板聚集;光電電磁法測定凝血參數(shù)。結(jié)果與正常對照組相比，模型組大鼠全血黏度和血漿黏度升高，紅細胞聚集指數(shù)和血小板最大聚集率顯著增加，Hct顯著升高，纖維蛋白原(Fib)含量顯著增加，凝血酶時間(TT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)和凝血酶原時間(PT)均顯著縮短(P＜0.01)。與模型組相比，單獨應用EAM和ECT均能顯著降低全血黏度及血漿黏度，明顯降低Hct、紅細胞聚集指數(shù)和血小板最大聚集率，其中EAM還能顯著降低Fib含量，延長APTT和TT;ECT還能顯著延長PT。與單獨應用EAM或ECT相比，EAM與ECT配伍能進一步改善血液流變學指標，在延長TT上優(yōu)于單用ECT(P＜0.05)，對血小板最大聚集率的抑制作用優(yōu)于單用EAM或ECT(P＜0.05)。與阿司匹林相比，單用EAM或ECT抑制血小板聚集的作用不及阿司匹林，但EAM降低Fib的作用較好，ECT延長PT的作用較好;EAM與ECT配伍對血液流變學的改善作用與阿司匹林相似。結(jié)論EAM和ECT單用能顯著改善血瘀模型大鼠血液流變學指數(shù)，且二者配伍后能增強對血瘀模型大鼠血液流變學的改善作用。

黃芪提取物;紅花總黃酮;血液流變學;血瘀;血小板聚集;全血凝固時間;纖維蛋白原

冠心病屬中醫(yī)“胸痹”范疇，其病機為氣虛血瘀?！皻庋碚摗笔侵嗅t(yī)學體系的重要理論基礎，對臨床辨證施治、選方用藥和判斷預后等均有重要的指導意義。冠心病與血液流變學關系密切，從血液流變學角度研究中醫(yī)藥的作用機制，可促進中醫(yī)藥在冠心病治療方面的應用。

補氣中藥黃芪具有抑制血小板聚集、防止血栓形成、降低全血和血漿黏度、增加冠脈血流量等作用?；钛兴幖t花及其制劑對二磷酸腺苷(adenosinediphosphate，ADP)誘導的血小板聚集具有抑制作用，能增加大鼠血液纖維蛋白酶溶解活性，對大鼠體外血栓形成有抑制作用［1］。黃芪總皂苷和總黃酮是黃芪發(fā)揮藥效的主要活性成分，紅花中主要含有黃酮類化合物，均具有改善血液流變異常的作用［2－5］。本研究將以總皂苷和總黃酮為有效部位的黃芪提取物(extract of Astragalus membranaceus，EAM)與紅花總黃酮(extract of Carthamus tinctorius，ECT)配伍，探討益氣活血中藥及其配伍對血液流變學指標的改善作用。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑

黃芪為豆科植物蒙古黃芪〔A.membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao〕或膜莢黃芪〔A.membranaceus(Fisch.)Bge.〕的干燥根。本研究所用黃芪藥材來源于山西省渾源縣，經(jīng)北京大學藥學院天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室屠鵬飛教授鑒定為蒙古黃芪，樣品保存在北京大學藥學院天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室。EAM的制備工藝為:黃芪飲片加8倍體積去離子水浸泡1 h，加熱煎煮提取3 h，濾過，濾液備用;藥渣再加6倍體積去離子水，煎煮提取2次，每次2 h，濾過。合并3次濾液，減壓濃縮至相對密度1.15～1.20(50℃)，冷卻至室溫，加95%乙醇至含醇量達80%，放置12 h。傾出上清液，沉淀離心，備用。合并上清液和濾液，減壓回收乙醇并濃縮至相對密度1.05～1.10(50℃);濃縮液加0.5倍體積水稀釋，濾過，濾液徐徐注入已處理好的HPD-600大孔吸附樹脂柱內(nèi)，先用去離子水洗至近無色(檢測還原糖反應陰性，用水量約為藥材量的10倍)，棄去水液;再用2倍柱體積量的20%乙醇洗脫，棄去20%乙醇洗脫液;再用4倍量的70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，回收乙醇并濃縮至相對密度1.15～1.25(50℃)，真空干燥(60℃)，粉碎，即得EAM，收率為1.0%。EAM中含有黃芪甲苷13.61%，黃芪皂苷Ⅲ0.97%，黃芪皂苷Ⅱ3.71%，黃芪皂苷Ⅰ0.8%，毛蕊異黃酮苷6.08%，芒柄花素3.95%。

紅花為菊科植物紅花(Carthamus tinctorius L.)的干燥花。紅花藥材來源于河北省安國市，經(jīng)北京大學藥學院天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室屠鵬飛教授鑒定為紅花，樣品保存在北京大學藥學院天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室。ECT為本實驗室自制［6］，含羥基紅花黃色素A 12.20%，山奈酚-3-O-蕓香糖苷0.71%。

阿司匹林腸溶片，拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號:BTA6E93;鹽酸腎上腺素10 mg·L－1注射液，天津市氨基酸公司，批號:20070612;凝血酶時間(thrombin time，TT)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin，APTT)、凝血酶原時間(prothrombin time，PT)和纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)ib)檢測試劑，均購自北京中勤世帝科學儀器公司;ADP，中國科學院上海生物化學研究所。

1.2 主要儀器

LG-R-80B型血液黏度儀和血小板聚集凝血因子分析儀，北京中勤世帝科學儀器有限公司;LBY-BX2紅細胞變形儀，北京普利生儀器有限公司;TGL-16G A冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠;3F-2型多功能微量高速離心機，中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學暨航空工業(yè)部華興航空機輪公司。

1.3 動物及急性血瘀模型制備［7］

Sprague-Dawley(SD)大鼠，雄性，體質(zhì)量240～280 g，由北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部提供，動物合格證號:SCXK(京)2002-0001。大鼠sc給予腎上腺素0.8 mg·kg－1共2次，間隔時間為4 h。第1次sc給予腎上腺素0.8 mg·kg－1后2 h，將大鼠置于0℃冰水中游泳5 min，2 h后再第2次sc給予腎上腺素0.8 mg·kg－1，造成大鼠急性血瘀癥。

1.4 動物分組及給藥

將大鼠隨機分為6組，每組10只，即正常對照、急性血瘀模型、陽性對照阿司匹林100 mg·kg－1、EAM 400 mg·kg－1、ECT 200 mg·kg－1和EAM 400 mg·kg－1+ECT 200 mg·kg－1組。各給藥組大鼠ig給藥，正常對照組和模型組大鼠ig給予等體積的生理鹽水，每日早晚各1次，共7次。于第5次給藥后，除對照組sc給予生理鹽水外，其余各組大鼠制備大鼠急性血瘀癥模型后，禁食16～18 h，期間給第6次和第7次藥。最后一次給藥后30 min腹主動脈取血，肝素鈉20 kU·L－1抗凝，用于全血黏度、血漿黏度和血細胞比容(hematocrit，Hct)的測定，3.8%枸櫞酸鈉抗凝血(枸櫞酸鈉∶全血為1∶9，V/V)用于APTT，TT，PT和Fib及血小板聚集的測定。

1.5 全血黏度和血漿黏度的測定

以錐板式旋轉(zhuǎn)黏度計測定大鼠全血黏度。取肝素抗凝的0.8 ml全血加入血液黏度計的樣品池中，于37℃測定切變率200，100，50和1 s－1下的全血黏度，并計算紅細胞聚集指數(shù)(erythrocyte aggregation index，EAI)［8］，即EAI=ηa1/ηa100，其中ηa1是切變率1 s－1下的全血黏度，ηa100是切變率100 s－1下的全血黏度。取2 ml肝素抗凝血，3000×g離心15 min，取0.8 ml血漿于37℃測定血漿黏度。

1.6 血細胞比容的測定

取肝素鈉抗凝血適量，10 000×g離心5 min，以微量毛細管法測定Hct。

1.7 比濁法測定血小板聚集性

取枸櫞酸鈉抗凝血2 ml，800×g離心10 min，制備富血小板血漿;再以2500×g離心10 min，制備貧血小板血漿，調(diào)節(jié)血小板密度約2.5×1011L－1，以終濃度5 μmol·L－1的ADP為血小板聚集誘導劑，采用比濁法于37℃測定血小板最大聚集率。

1.8 APTT，TT，PT和Fib含量的測定

取枸櫞酸鈉抗凝血1 ml，3000×g離心15 min，取上層血漿，采用血小板聚集凝血因子分析儀，按測定試劑說明方法于37℃測定APTT，TT，PT和Fib含量。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 黃芪提取物和紅花總黃酮對急性血瘀大鼠全血黏度和血漿黏度的影響

表1顯示，與正常對照組相比，模型組大鼠切變率在200，100，50和1 s－1下的全血黏度及血漿黏度明顯增高(P＜0.01)。與模型組相比，切變率在200，100，50和1 s－1時，EAM 400 mg·kg－1和ECT 200 mg·kg－1單獨使用均可顯著降低全血黏度及血漿黏度;EAM與ECT配伍組與單味藥組相比無明顯差異(P＞0.05)。

2.2 黃芪提取物和紅花總黃酮對急性血瘀大鼠血細胞比容和紅細胞聚集的影響

表2顯示，與正常對照組相比，模型組大鼠的Hct和EAI明顯增加(P＜0.01)。與模型組相比，單獨使用EAM 400 mg·kg－1和ECT 200 mg·kg－1均可明顯降低Hct(P＜0.05)和EAI(P＜0.05)。與單用EAM和ECT相比，EAM與ECT配伍組能進一步降低Hct(P＜0.05)和EAI(P＜0.01)，表明EAM和ECT配伍在降低Hct和EAI方面具有一定的協(xié)同作用。

2.3 黃芪提取物和紅花總黃酮對二磷酸腺苷誘導血小板聚集的影響

表3顯示，與正常對照組相比，血瘀模型組大鼠的血小板聚集率明顯增加(P＜0.01)。與模型組相比，單獨使用EAM 400 mg·kg－1或ECT 200 mg·kg－1

Tab.2 Effect of EAM and ECT alone or in combination on hematocrit(Hct)and erythrocyte aggregation index(EAI)in rats with blood stasis

均可顯著降低血小板的聚集(P＜0.05)。與單用EAM和ECT相比，EAM與ECT配伍組能進一步降低血小板最大聚集率(P＜0.05)，提示配伍組在抑制ADP誘導的血小板聚集上具有協(xié)同增效作用。

Tab.3 Effect of EAM and ECT alone or in combination on platelet maximum rate in rats with blood stasis

Tab.1 Effect of extract of A.membranaceus(EAM)and extract of C.tinctorius(ECT)alone or in combination on whole blood and plasma viscosity in rats with blood stasis

2.4 黃芪提取物和紅花總黃酮對凝血參數(shù)的影響

表4顯示，與正常對照組相比，急性血瘀模型組的Fib含量升高，APTT，TT和PT顯著縮短(P＜0.01)。與模型組相比，EAM 400 mg·kg－1能顯著降低Fib含量，延長APTT和TT(P＜0.05);ECT 200 mg·kg－1能顯著延長PT(P＜0.05)，但對Fib含量以及APTT和TT無明顯影響。與單用EAM或ECT相比，EAM+ECT配伍組能進一步降低Fib，延長APTT，TT和PT，且在延長TT方面與ECT相比具有顯著性差異(P＜0.05)。

3 討論

心肌缺血時，冠狀動脈的狹窄阻塞勢必會影響血液流變學的改變。臨床研究資料表明，心肌缺血患者存在不同程度血液流變學的異常，主要表現(xiàn)在Fib、血漿黏度、全血黏度和EAI升高，纖溶活性和紅細胞變形下降，這些血流變異常對缺血心肌產(chǎn)生負面效應。

全血黏度反映血液流變性的總體變化，高切值反映紅細胞的變形能力情況，低切值反映紅細胞和血小板聚集能力的變化，血漿黏度反映血中可溶性成分的變化，其中Fib和紅細胞聚集性是影響兩者的主要原因。Fib分子是纖維狀，容易彎曲，引起分子間牽連而使黏度增大。同時Fib通過橋聯(lián)作用連接鄰近紅細胞，使之成為可逆性簇狀的一堆聚集體，導致紅細胞聚集性顯著增高，原來不易聚集的部位，如微動脈或毛細血管近動脈段，也可出現(xiàn)紅細胞聚集體。紅細胞聚集性增高可堵塞血管，導致嚴重的微循環(huán)障礙。缺血缺氧狀態(tài)下紅細胞發(fā)生嚴重聚集會影響局部微循環(huán)暢通，使血流阻滯。因此，當紅細胞膜的彈性減低，而剛性指標增高，紅細胞變硬、變脆，造成組織灌注不良，缺氧和酸中毒，引起血小板聚集，這些結(jié)果又反過來加重血液黏度的增高，聚集性增高，造成惡性循環(huán)［9－10］。

黃芪作為補氣要藥，可降低血小板黏附率、抑制血小板聚集、降低Fib和Hct、防止血栓形成，從而降低全血和血漿黏度、增加冠脈血流量［11－12］。此外，活血中藥紅花及其制劑對ADP誘導的血小板聚集具有抑制作用，能增加大鼠血液纖維蛋白酶溶解活性，降低高、低切變率時的全血黏度、血漿黏度和紅細胞的聚集性，抑制大鼠體外血栓形成，增強紅細胞變形性等［13］。

中醫(yī)理論認為“大怒致瘀”，“外寒也可致瘀”。本研究采用給予大鼠皮下注射大劑量腎上腺素模擬暴怒時的機體狀態(tài)，并以冰水浸泡模擬寒邪入侵，在兩種因素綜合作用下復制大鼠急性血瘀證模型。腎上腺素為α和β受體激動劑，具有收縮外周血管和增加心肌收縮力的作用，使心臟負荷增加，心肌耗氧代謝增加，心功能下降，從而使血液運行障礙，血液黏度增加，加之液體的黏度在溫度降低時升高，再給動物施以冰水冷浴。二者的綜合作用使得模型組各項血液流變學指標均較正常組顯著升高，復制出血液流變性呈“黏、濃、凝、集”的狀態(tài)。

給予EAM，ECT及其復方配伍后血瘀大鼠的全血黏度、EAI及血小板聚集率降低，說明其可以通過抑制血細胞聚集而達到抑制血“聚”的作用。血漿黏度降低，表明其可能通過降低血漿中Fib等生物大分子物質(zhì)的含量起到抑制血“濃”、“黏”的作用。APTT反映內(nèi)源性凝血系統(tǒng)各凝血因子總的凝血狀態(tài)，PT反映外源性凝血系統(tǒng)因子的凝血狀況，TT反映Fib轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，至凝固所需的時間。EAM及EAM與ECT配伍組能使血瘀大鼠的APTT和TT顯著升高，而Fib含量顯著降低，且配伍組的作用優(yōu)于EAM單味藥組;ECT及EAM與ECT配伍組可使血瘀大鼠的PT顯著升高，且配伍組的作用優(yōu)于ECT單味藥組，可見EAM，ECT及其配伍可通過對內(nèi)、外源性凝血系統(tǒng)各因子的作用和降低血漿中Fib含量來延長凝血時間進而起到抑制血“凝”的作用。其中EAM在降低血漿Fib含量，延長凝血APTT和TT等方面的作用強于ECT;而ECT在降低紅細胞指數(shù)、抑制血小板聚集率及延長凝血PT等方面則體現(xiàn)出了優(yōu)勢，且總體來講EAM+ECT配伍組的作用優(yōu)于單味藥組。

Tab.4 Effect of EAM and ECT alone or in combination on fibrinogen(Fib)，activated partial thrombin time(APTT)，thrombin time(TT)and prothrombin time(PT)in rats with blood stasis

綜上所述，EAM，ECT及其配伍具有一定的糾正血液流變性異常的作用，且配伍組的作用優(yōu)于兩個單味藥組，進一步提示在改善血瘀大鼠的血液流變學方面黃芪和紅花配伍可以補氣活血，氣血雙補，兼二者之長，為臨床上聯(lián)合應用補氣藥和活血藥進行心血管方面疾病的治療提供了一定的實驗依據(jù)。

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Ameliorative effect of extract of Astragalus membranaceus combined
with flavonoids of Carthamus tinctorius on hemorheology in rats with acute blood stasis

MA Xu1，2，ZHANG Ke1，HAN Shu-yan1，3，MA Zhi-zhong1，TU Peng-fei1
〔1.State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs，School of Pharmaceutical Sciences，Peking University，Beijing100191，China;2.Patent Examination Cooperation Center of SIPO，Beijing100083，China;3.Beijing Cancer Hospital＆Institute，School of Oncology，Peking University，Key Laboratory of Carcinogenesis and Translational Research(Ministry of Education)，Beijing100142，China〕

OBJECTIVETo evaluate the effect of extract of Astragalus membranaceus(EAM)combined with extract(flavonoids)of Carthamus tinctorius(ECT)on the hemorheological abnormality in rats with acute blood stasis.METHODSThe rats were ig given EAM 400 mg·kg－1，ECT200 mg·kg－1，EAM400 mg·kg－1+ECT200 mg·kg－1andaspirin 100 mg·kg－1，twice a day，for seven consecutive times.After the 5th administration，the rats were given adrenaline and ice water soaking to set up the acute blood stasis model.Whole blood viscosity and plasma viscosity were evaluated by cone-plate viscometer，hematocrit(Hct)determined by micro-capillary method，platelet aggregation measured by photoelectric turbidimetry and coagulation parameters evaluated by optical electromagnetic method.RESULTSCompared with normal control group，the whole blood viscosity and plasma viscosity of rats significantly increased，erythrocyte aggregation index(EAI)and the maximum platelet aggregation rate were also remarkably elevated in blood stasis model group.Simultaneously，Hct and fibrinogen(Fib)contents were also increased while prothrombin time(PT)，activated partial thrombin time(APTT)and thrombin time(TT)were shortened(P＜0.01).Compared with model group，EAM 400 mg·kg－1or ECT 200 mg·kg－1alone could obviously decrease whole blood viscosity and plasma viscosity，reduce EAI and Hct，and inhibit the ADP-induced platelet maximum aggregation rate(P＜0.05，P＜0.01).Meanwhile，EAM 400 mg·kg－1significantly decreased Fib content but delayed the APTT and TT;ECT 200 mg·kg－1significantly delayed the PT.Compared with EAM or ECT group，EAM 400 mg·kg－1+ECT 200 mg·kg－1ameliorated abnormal hemorheology in rats with acute blood stasis，as revealed by the more delayed TT(P＜0.05)and greater platelet maximum aggregation inhibition(P＜0.05).Compared with aspirin group，EAM and ECT showed less inhibition of platelet aggregation while EAM had a little better effect on Fib content reduction，ECT could more effectively delay PT.EAM+ECT could improve hemorheology as much as aspirin.CONCLUSIONEAM 400 mg·kg－1+ECT 200 mg·kg－1improves abnormal hemorheology in rats with acute blood stasis more effectively in combination than used alone.

extract of Astragalus membranaceus;flavonoids of Carthamus tinctorius;hemorheology;blood stasis;platelet aggregation;whole blood coagulation time;fibrinogen

The project supported by National Science Fund for Distinguished Young Scholars(30525043)

TU Peng-fei，E-mail:pengfeitu@vip.163.com，Tel:(010)82802750

R973，R285

A

1000-3002(2012)04-0504-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.04.007

國家杰出青年基金資助課題(30525043)

馬旭(1980－)，女，助理研究員，主要從事藥物領域?qū)＠暾垖嵸|(zhì)審查;屠鵬飛(1963－)，男，教授，博導，主要從事天然藥物活性成分與新藥研究。

屠鵬飛，E-mail:pengfeitu@vip.163.com，Tel:(010)82802750

2011-12-05接受日期:2012-04-26)

(本文編輯:齊春會)