lactuside B降低腦缺血損傷大鼠海馬和紋狀體TRPM7 mRNA的表達

詹合琴，賈巖龍，閆福林，牛秉軒，尹延彥

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院藥學院1.藥理教研室，2.藥物化學教研室，3.綜合辦公室，河南新鄉(xiāng)453003)

lactuside B降低腦缺血損傷大鼠海馬和紋狀體TRPM7 mRNA的表達

詹合琴1，賈巖龍1，閆福林2，牛秉軒1，尹延彥3

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院藥學院1.藥理教研室，2.藥物化學教研室，3.綜合辦公室，河南新鄉(xiāng)453003)

目的探討lactuside B對大鼠腦缺血損傷后海馬和紋狀體TRPM7 mRNA表達的影響。方法采用大腦中動脈缺血再灌注損傷模型，SD雄性大鼠缺血2 h后再灌，分別于再灌后ip給予lactuside B 12.5，25和50 mg·kg－1，每天2次，每組1/2大鼠給藥1 d，另1/2大鼠連續(xù)給藥3 d，于末次給藥后觀察神經缺失癥狀并處死大鼠;RT-PCR技術檢測大腦皮質和海馬TRPM7 mRNA的表達。結果模型組大鼠各時間段神經缺失癥狀評分明顯升高，海馬和紋狀體的TRPM7 mRNA表達均顯著增加(P＜0.01)。給予lactuside B 12.5，25和50 mg·kg－11 d后，海馬和紋狀體TRPM7 mRNA表達分別為0.68±0.02，0.55±0.02和0.56±0.02，及0.32±0.02，0.25±0.01和0.35±0.01，與模型對照組比較均明顯降低(P＜0.01);給予lactuside B 12.5，25和50 mg·kg－13 d，海馬和紋狀體TRPM7 mRNA分別為0.29±0.02，0.18±0.01和0.26±0.01，及0.28±0.02，0.19±0.01和0.27±0.01，與模型對照組比較均明顯降低(P＜0.01)。結論lactuside B可降低海馬和紋狀體TRPM7基因的表達，提示該化合物對腦缺血損傷可能具有治療作用。

lactuside B;再灌注損傷，腦;海馬;紋狀體;TRPM7陽離子通道

腦缺血的發(fā)病機制異常復雜，以往認為與興奮性神經遞質谷氨酸的大量釋放、導致神經細胞內鈣超載并最終引起細胞損傷和死亡有關［1－2］。然而，抗興奮性中毒療法(anti-excitotoxic therapies，AET)的臨床試驗結果卻不能使人滿意，甚至還有較多的不良反應出現［3－4］。

近年來，人們發(fā)現與腦缺血治療靶點相關的非谷氨酸機制能夠使離子失衡導致細胞死亡。體內研究表明，酸敏感膜通道和瞬時型受體電位通道中的瞬時型受體電位黑素抑素7(transient receptor potential melastatin 7，TRPM7)和容量調整陰離子通道等非谷氨酸機制參與了腦缺血的發(fā)病過程［5－6］，但TRPM7對腦缺血的影響更使人關注。

腦缺血時鈣超載激活了一氧化氮合酶，使一氧化氮和過氧化物等大量產生，引起TRPM7活性增強和過度表達。有研究表明，TRPM7通道在缺氧缺糖神經元死亡過程中發(fā)揮重要作用［7］，提示興奮性氨基酸受體拮抗劑不能阻斷TRPM7激活后所致的損害，不能改善AET對腦缺血治療的局限性，故尋找作用于非谷氨酸機制的抗腦缺血藥物具有十分重要的意義。

3β-葡萄糖-14-羥基-11β，13-二氫木香烯內酯(lactuside B)是從河南桐柏高翅果菊植物地下部分中分離提取的主要化學成分，本課題組前期研究發(fā)現，該單體化合物具有良好的抗腦缺血作用［8－9］。鑒于TRPM7通道對腦缺血損傷具有重要的影響，故本研究主要探討lactuside B對大鼠腦缺血后腦組織海馬和紋狀體TRPM7基因表達的影響，以期從多部位多方面觀察該單體化合物抗腦缺血損傷的分子效應。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

lactuside B由新鄉(xiāng)醫(yī)學院藥學院天然藥物化學教研室提供，為黃白色粉末，純度＞96%;尼莫地平注射液購自山東方明藥業(yè)股份有限公司;上樣緩沖液(6×)和RT-PCR試劑盒購自寶生物工程大連有限公司;TAE緩沖液購自廣州威佳科技有限公司，DEPC液和溴化乙錠購自美國Sigma公司;D2000DNA分子量標志物購自北京天根生化有限公司;Trizol購自美國Invitrogen公司;水合氯醛粉劑購自天津市瑞金特化學品有限公司。SYQ-DSX-280B立式電熱壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠;79-2型磁力加熱攪拌器，江蘇金壇市佳美儀器有限公司;Hfsafe-1200生物安全柜，西化儀北京科技有限公司;AG PCR擴增儀，德國Eppendorf公司;DYY-7C型水平電泳儀，北京市六一儀器廠;TGL-16G-A臺式高速低溫離心機，上海安亭科學儀器廠;MDFU4086S超低溫冰箱，日本Sanyo公司;UV-2102PC紫外分光光度計，尤尼柯上海儀器有限公司;TOCAN240凝膠成像系統(tǒng)，上海領成生物科技有限公司。

1.2 動物及缺血性腦損傷模型的制備

健康雄性SD大鼠(清潔Ⅱ級)，體質量280～320 g，由河南省實驗動物中心提供，合格證號:SYXK(豫)2005-0012。參照Longa線栓法［10］制備大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷模型(麻醉采用10%水合氯醛)，將預先制備好的阻塞線(1.5號日本漁線，直徑0.2 mm，長2 cm)從頸內動脈插入到大腦中動脈，使其頭端阻塞大腦中動脈入口。假手術組阻塞線只插入頸內動脈0.5 cm長，然后將大鼠傷口縫合后回籠飼養(yǎng)。所有大鼠均阻塞2 h后再把阻塞線球端拉回到頸外動脈進行再灌注。

1.3 實驗分組和給藥

大鼠隨機分為假手術組、模型組、尼莫地平1 mg·kg－1組、lactuside B 12.5，25和50 mg·kg－1組，每組8只(由于腦缺血再灌注損傷模型大鼠的死亡率較高，故按每組大鼠多出1/2來分，剔除模型失敗和死亡的大鼠，使存活大鼠至少達到8只)。于缺血2 h后再灌注，均ip給予5 ml·kg－1，每天2次，每組1/2大鼠給藥1 d，另1/2大鼠連續(xù)給藥3 d，于末次給藥后分別處死相應的大鼠取腦備用。

1.4 Zea-Longa評分法［10］進行神經功能評分

實驗大鼠于手術清醒和末次給藥后分別進行神經功能缺失癥狀評分，前者進行評分主要是判斷模型的成功性，后者評分主要是觀察藥物的抗腦缺血損傷作用。

1.5 RT-PCR法檢測TRPM7基因表達水平

處死大鼠取腦，迅速分離出雙側海馬和紋狀體(取殼核和尾狀核的全部條紋狀組織)結構，Trizol法抽提總RNA，并檢測其純度和濃度保證提取的RNA無降解和污染。用TaKaRa pimeScript TM RT-PCR試劑盒合成cDNA模板，以β肌動蛋白作為內參。PCR反應溶液為50 μl。TRPM7，661bp，F:5'-CTGAAGAGGAATGACTACAC-3'，R:5'-ACAGGGAAAAAGAGAGGGAG-3';β肌動蛋白，208 bp，F:5'-CCTTCCTGGGCATGGAGTCCTG-3'，R:5'-GGAGCAATGATCTTGATCTTC-3'，各0.5 μl(100 μmol·L－1)。PCR反應條件為:95℃預變性5 min，95℃變性30 s，51℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)，最后一個循環(huán)結束后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產物在瓊脂糖凝膠上電泳40 min后，用UVP凝膠成像系統(tǒng)觀察并攝圖，以Quantity One圖像分析軟件測定各條帶灰度，用擴增的特異性目的片段灰度值和同時擴增的內參β肌動蛋白片段灰度值的比值作為特異性擴增目的片段的半定量檢測值。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 lactuside B對大鼠神經缺失癥狀評分的影響

表1結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠神經缺失癥狀評分均增高(P＜0.01)。與模型組比較，給藥1 d和3 d后，lactuside B 12.5，25和50 mg·kg－1組大鼠的神經行為學評分均降低(P＜0.01)，同時lactuside B 12.5，25和50 mg·kg－1組神經行為學評分明顯好于尼莫地平1 mg·kg－1組(P＜0.05，P＜0.01);lactuside B 25和50 mg·kg－1組用藥3 d后大鼠的神經缺失癥狀評分更低，與給藥1 d比較差異顯著(P＜0.05)。

Tab.1 Effect of lactuside B on neurologic deficit score of ischemia/reperfused(I/R)rats

2.2 lactuside B對大鼠大腦海馬TRPM7 mRNA表達的影響

表2和圖1數據顯示，模型組大鼠腦缺血再灌注損傷后海馬TRPM7 mRNA表達增加，與假手術組比較有顯著性差異(P＜0.01)。與模型組比較，給予lactuside B 25和50 mg·kg－11 d時，TRPM7 mRNA表達顯著降低(P＜0.01)，給藥3 d時，lactuside B 12.5，25和50 mg·kg－1組TRPM7 mRNA表達均降低(P＜0.01)，且25 mg·kg－1組優(yōu)于尼莫地平1 mg·kg－1組(P＜0.01);除假手術組外，其他各組用藥3 d與用藥1 d相比均有顯著性差異。)

Tab.2 Effect of lactuside B on TRPM7 mRNA expression in hippocampus of I/R rats

See Tab.1 for the treatment.TRPM7 mRNA expression was detected by RT-PCR for hippocampus.±s，n=4.＊＊P＜0.01，compared with sham group;##P＜0.01，compared with model group;△△P＜0.01，compared with model+nimodipine group;▲▲P＜0.01，compared with corresponding administered for 1 d group.

Fig.1 Effect of lactuside B on TRPM7 mRNA expression in hippocampus of I/R rats by RT-PCR.See Tab.1 for the treatment.A:administered for 1 d;B:administered for 3 d.1:sham group;2:I/R model group;3:I/R model+nimodipine 1 mg·kg－1;4:I/R model+lactuside B 12.5 mg·kg－1;5:I/R model+lactuside B 25 mg·kg－1;6:I/R model+lactuside B 50 mg·kg－1.

2.3 lactuside B對大鼠大腦紋狀體TRPM7 mRNA表達的影響

如表3和圖2數據顯示，模型組大鼠腦缺血再灌注損傷后紋狀體TRPM7 mRNA表達增加，與假手術組比較有顯著性差異(P＜0.05)。給藥1 d時，與模型組比較，lactuside B 12.5，25和50 mg·kg－1組TRPM7 mRNA表達均顯著降低(P＜0.05，P＜0.01);lactuside B 25 mg·kg－1組與尼莫地平組比較有顯著性差異(P＜0.01)。給藥3 d時，與尼莫地平組比較，lactuside B 12.5，25和50 mg·kg－1組均有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01);除假手術組和lactuside B 12.5 mg·kg－1組外，其他各組用藥3 d與用藥1 d相比均有顯著性差異。

Tab.3 Effect of lactuside B on TRPM7 mRNA expression in striatum of I/R rats

Fig.2 Effect of lactuside B on TRPM7 mRNA expression in striatum of I/R rats.See Tab.1 for the treatment.A:administered for 1 d;B:administered for 3 d.1:sham group;2:I/R model group;3:I/R model+nimodipine 1 mg·kg－1;4:I/R model+lactuside B 12.5 mg·kg－1;5:I/R model+lactuside B 25 mg·kg－1;6:I/R model+lactuside B 50 mg·kg－1.

3 討論

近年來，TRPM7與腦缺血損傷的病理生理關系已成為研究熱點。一些研究表明，局灶性腦缺血再灌注損傷可誘導大鼠海馬和皮質組織TRPM7的表達水平增加［11］。Lee等［12］研究發(fā)現，TRPM7通道在腦缺血期除了使Ca2+增高外還可使Zn2+增高;Koh等［13］發(fā)現，在腦缺血損傷后很短的時間內，海馬CA1區(qū)細胞在死亡之前，細胞內的Zn2+有一個延遲的增加。最近研究表明，由TRPM7介導的Zn2+誘導的神經毒性很大［14］。也有研究表明，當腦缺血損傷NMDA受體過度激活時，則形成鈣超載，活性氧自由基增多，TRPM7通道激活，鈣進入細胞內加重超載的惡性循環(huán)［7］。以上研究結果充分提示，研究抗腦缺血損傷的藥物lactuside B可從TRPM7的作用靶點去考慮。

本研究結果顯示，模型組大鼠神經缺失癥狀評分均增高，與假手術組比較有顯著性差異，但隨時間延長，神經缺失癥狀評分有所下降，與給藥1 d比較無顯著性差異。lactuside B各劑量組均可降低大鼠的神經行為學評分，且其各劑量組在給藥1 d和3 d時均明顯好于尼莫地平1 mg·kg－1組，但只有l(wèi)actuside B 25和50 mg·kg－1組用藥3 d后大鼠的神經缺失癥狀評分更低，與給藥1 d比較差異顯著，提示lactuside B能有效改善腦缺血損傷后動物的神經缺失癥狀。

本研究RT-PCR實驗結果顯示，腦缺血損傷后大鼠海馬和紋狀體的TRPM7 mRNA表達明顯增多，但隨時間延長，其表達卻有下降趨勢，可能為腦組織對缺血性損傷的反應性降低所致，此結果與以往研究相一致。結果又顯示，lactuside B各劑量組均能降低海馬和紋狀體TRPM7 mRNA的表達水平，但lactuside B 50 mg·kg－1組卻作用較差，與大鼠的神經功能評分結果并不一致，可能是lactuside B的抗腦缺血損傷作用尚有其他機制，也或是實驗中出現的其他未知因素所致?？傮w上，lactuside B各劑量組腦缺血損傷后海馬和紋狀體組織TRPM7基因的表達降低，對腦缺血損傷產生了積極的影響，且有些劑量組在某些時間點強于尼莫地平。但是，實驗中還發(fā)現，給藥3 d后除假手術組外，其他各組降低TRPM7的作用幾乎均強于給藥1 d，而大鼠的神經缺失癥狀評分結果卻顯示出模型組用藥1 d和3 d并無顯著性差異，提示實驗結果存在著不一致的情況。由于模型組的TRPM7降低有時效差異性，故lactuside B作用的時效性或無實際意義。

綜上所述，lactuside B的抗腦缺血作用與降低海馬和紋狀體TRPM7基因的表達有較大關系，該單體化合物可能通過調控TRPM7基因的表達來改變其指導功能蛋白質的合成數量，調控細胞內以鈣離子為主的陽離子濃度，從而影響腦缺血的病理過程。lactuside B對腦缺血損傷后TRPM7基因表達的影響使抗腦缺血藥物的研發(fā)范圍和作用靶點進一步擴大，對于其開發(fā)價值和應用前景有著顯著的意義。

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Inhibitory effect of lactuside B on TRPM7 mRNA expression in hippocampus and striatum in cerebral ischemic rats

ZHAN He-qin1，JIA Yan-long1，YAN Fu-lin2，NIU Bing-xuan1，YIN Yan-yan3
(1.Department of Pharmacology，2.Department of Medicinal Chemistry，3.General Office，School of Pharmacy，Xinxiang Medical University，Xinxiang453003，China)

OBJECTIVETo explore the effect of lactuside B on transient receptor potential melastatin 7(TRPM7)mRNA expression in rat hippocampus and striatum after cerebral ischemia injury.METHODSThe middle cerebral artery occulsion was used to make the ischemia(2 h)reperfusion injury model.After reperfusion，the rats were respectively ip given lactuside B 12.5，25 and 50 mg·kg－1twice daily.Half of the rats of each group administered for 1 d while the rest administered continuously for 3 d.After the neurologic deficit score was observed in the last administration，the rats were sacrificed.The expression of TRPM7 mRNA on hippocampus and striatum was detected by RT-PCR.RESULTSCompared with sham group，the neurological lack symptom score in model group was significantly higher and the TRPM7 mRNA expression increased in hippocampus and striatum in rats.After lactuside B 12.5，25 and 50 mg·kg－1was administered for 1 d，TRPM7mRNAexpressionwasdecreasedinhippocampusandstriatum(hippocampus:0.68±0.02，0.55±0.02 and 0.56±0.02;striatum:0.32±0.02，0.25±0.01 and 0.35±0.01).TRPM7 mRNA expression was lower after lactuside B administered for 3 d(hippocampus:0.29±0.02，0.18±0.01 and 0.26±0.01;striatum:0.28±0.02，0.19±0.01 and 0.27±0.01).CONCLUSIONLactuside B can reduce TRPM7 gene expression in hippocampus and striatum，suggesting that lactuside B play a positive therapeutic and protective role.

lactuside B;reperfusion injury，brain;hippocampus;striatum;TRPM7 cation channel

The project supported by National Natural Science Foundation of China(81172953);Natural Science Research Foundation of Henan Bureau of Education(2009A310009)

ZHAN He-qin，E-mail:xiaofei1@126.com，Tel:13781966576

R285

A

1000-3002(2012)04-0489-05

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.04.004

國家自然科學基金(81172953);河南省教育廳自然科學研究基金(2009A310009)

詹合琴(1967－)，女，碩士，副教授，碩士生導師，主要從事神經藥理學研究。

詹合琴，E-mail:xiaofei1@126.com，Tel:(0373)3029101

2011-11-16接受日期:2012-03-20)

(本文編輯:喬虹)