非接觸式共培養(yǎng)體外血腦屏障模型的跨膜電阻及通透性

張水華，季龍鳳，馬璟

(1.福建醫(yī)科大學(xué)福建省新藥安全性評價中心，福建福州350108;2.國家上海新藥安全性評價研究中心，上海201203)

非接觸式共培養(yǎng)體外血腦屏障模型的跨膜電阻及通透性

張水華1，2，季龍鳳2，馬璟2

(1.福建醫(yī)科大學(xué)福建省新藥安全性評價中心，福建福州350108;2.國家上海新藥安全性評價研究中心，上海201203)

目的建立大鼠腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(BCEC)與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)血腦屏障模型并評價其功能。方法采用SD大鼠原代分離培養(yǎng)獲得BCEC和星形膠質(zhì)細(xì)胞。經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、免疫組化檢測相關(guān)抗原后建立非接觸式共培養(yǎng)血腦屏障模型，測定共培養(yǎng)模型所形成的跨細(xì)胞電阻及熒光素鈉的通透性。采用LC-MS檢測6個化合物透過血腦屏障模型的通透性，并與文獻報道的體內(nèi)數(shù)據(jù)進行比較。結(jié)果培養(yǎng)的BCEC多數(shù)為短梭形外觀，免疫組化檢測可見細(xì)胞高表達因子Ⅷ;星形膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)具有細(xì)胞突起的典型形態(tài)，免疫組化檢測可見細(xì)胞高表達膠質(zhì)纖維酸性蛋白。共培養(yǎng)的體外血腦屏障模型跨BCEC單層的電阻值為(373±41)Ω·cm2，熒光素鈉跨BCEC單層的通透性為(0.34±0.14)×10－3cm·min－1，符合體外血腦屏障模型要求。對所選6個化合物體內(nèi)外透過BBB模型滲透系數(shù)的比較，表明具有一定的相關(guān)性(R2=0.7679，P＜0.05)。結(jié)論建立的體外BBB模型在跨內(nèi)皮電阻和通透性方面具備了在體BBB的基本特性，可以用于模擬體內(nèi)環(huán)境，進行藥物早期篩選方面的研究。

毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，腦;星形膠質(zhì)細(xì)胞;血腦屏障

血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)是腦屏障的重要組成部分，它能阻止血流中的大多數(shù)物質(zhì)進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中起著十分重要的作用。在藥物的研發(fā)過程中，研究藥物對BBB的作用及其機制具有重要意義，但由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，許多研究者通過建立體外BBB模型來研究藥物的作用機制［1］。BBB主要由腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain capillary endothelial cells，BCEC)、星形膠質(zhì)細(xì)胞足突、周細(xì)胞和基底膜組成，其中BCEC是構(gòu)成BBB的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，所以，獲得高純度的BCEC成為建立BBB的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)，單獨培養(yǎng)的BCEC會逐漸喪失BBB特性，在培養(yǎng)體系中加入星形膠質(zhì)細(xì)胞后能夠較好地模擬體內(nèi)環(huán)境，可以較好地保留BBB特性，因此，BBB模型由早期的單層BCEC培養(yǎng)逐漸向與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)過渡［2－3］。理想的體外模型不但要具有BBB的特征，而且要有使用簡單、重復(fù)性好、經(jīng)濟有效及能夠進行中、高通量篩選等特點，但目前所有模型都不能同時滿足上述特點［4］。通常采用細(xì)胞形態(tài)及其屏障功能等評價體外BBB模型，但其與體內(nèi)的相關(guān)性少有報道。本研究在建立模型的基礎(chǔ)上，選擇一系列化合物，初步測定其透過BBB模型的通透性并計算其相關(guān)性，以便進一步評價模型的可靠性。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司);脫氧核糖核酸酶Ⅰ(美國Sigma公司);牛血清白蛋白(瑞士Roche公司);Ⅰ型鼠尾膠原蛋白(杭州生友生物技術(shù)有限公司);Ⅱ型膠原酶(美國Invitrogen公司);西咪替丁(cimetidine)、安替比林(antipyrine)、秋水仙堿(colchicine)、水楊酸(salicylic acid)、甲苯磺丁脲(tolbutamide)、氫化可的松(hydrocortisone)和熒光素鈉，均購自美國Sigma公司;堿性成纖維生長因子(英國PeproTech公司);嘌羅霉素(puromycin，美國Amresco公司);因子Ⅷ和膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)免疫組化試劑盒(丹麥DAKO公司);1200-API4000型液質(zhì)聯(lián)用儀(美國安捷倫公司);MERS00001型Millicell-ERS跨內(nèi)皮阻抗測試儀(美國Millipore公司);Gemini EM熒光酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司);Transwell 3460細(xì)胞培養(yǎng)池(美國Corning公司)。

1.2 大鼠BCEC的分離和培養(yǎng)

取2周齡左右SD大鼠，脫臼處死，浸泡于75%乙醇中消毒5 min，無菌條件下取出大腦，置于盛有預(yù)冷的PBS培養(yǎng)皿中，解剖顯微鏡下分離腦組織，取出大腦皮質(zhì)，在無菌紗布上滾動粘去腦膜和大血管，再在解剖顯微鏡下剔除殘余的腦膜和大血管，用剪刀剪碎大腦皮質(zhì)成1 mm3大小糊狀，加入0.1%Ⅱ型膠原酶，置于CO2培養(yǎng)箱中消化1.5 h，1000×g下離心5 min，棄上清，將沉淀加入配制好的20%BSA溶液中混勻后，4℃，1000×g下離心20 min，保留底部沉淀，將淡紅色部分接種于預(yù)先鋪有Ⅰ型鼠尾膠原蛋白的6孔板中，20%FBS，每孔2 ml。次日換液并加入含有堿性成纖維生長因子10 μg·L－1、嘌羅霉素［5］3 mg·L－1、氫化可的松500 μg·L－1的培養(yǎng)基2 ml，3 d后換液，去除嘌羅霉素繼續(xù)培養(yǎng)，直至細(xì)胞長滿為止，鑒定。

1.3 星型膠質(zhì)細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

取1～3 d齡SD大鼠，脫臼處死，浸泡于75%乙醇中消毒5 min，無菌條件下取出大腦，置于盛有預(yù)冷的PBS培養(yǎng)皿中，解剖顯微鏡下分離腦組織，取出大腦皮質(zhì)，在無菌紗布上滾動粘去腦膜和大血管，再在解剖顯微鏡下剔除殘余的腦膜和大血管，用剪刀剪碎大腦皮質(zhì)成1 mm3大小糊狀，加入8 ml含有0.125%胰蛋白酶和DNA酶30 kU·L－1的PBS，37℃消化15 min，1000×g下離心3 min，棄上清。將沉淀轉(zhuǎn)移至玻璃離心管中，加入培養(yǎng)基后，反復(fù)輕輕吹打，收集已吹散成單個細(xì)胞的上層懸液，重復(fù)3～4次，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×109L－1左右，加入到包被好的25 cm2塑料培養(yǎng)瓶中。每3 d換液1次，培養(yǎng)9～10 d，密封好瓶口，37℃，置于搖床中以250 rpm·min－1，搖動12 h，傾去搖下來的細(xì)胞，剩余的貼壁細(xì)胞胰酶消化，1∶3傳代至新的鼠尾膠原包被的25 cm2塑料培養(yǎng)瓶［6］。

1.4 細(xì)胞鑒定

細(xì)胞培養(yǎng)板中取出長滿BCEC(或星形膠質(zhì)細(xì)胞)的蓋玻片，4%多聚甲醛室溫固定20 min，3%過氧化氫室溫處理10 min，10%正常羊血清37℃封閉30 min，分別加入兔抗人因子Ⅷ(或GFAP)一抗和羊抗兔二抗(1∶100)各1 h，再依次DAB染色、乙醇梯度脫水、二甲苯透明和中性樹脂封片。

1.5 BBB模型的建立

采用Corning公司Transwell 3460細(xì)胞培養(yǎng)池(PET膜材，孔徑0.4 μm)作為共培養(yǎng)的支持物建立大鼠BCEC與星形膠質(zhì)細(xì)胞非接觸式共培養(yǎng)模型，首先將分離的腦毛細(xì)血管段接種于包被好的細(xì)胞培養(yǎng)池的上室，培養(yǎng)3 d后，去除嘌呤霉素，將細(xì)胞培養(yǎng)池置于底部含有星形膠質(zhì)細(xì)胞的12孔板內(nèi)，7 d后BCEC即可形成致密單層。

1.6 BBB模型的評價

1.6.1 跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻的測定

通過測定模型中跨BCEC的電阻值評價體外BBB模型中細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運程度。用Millicell ERS測定共培養(yǎng)模型的跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值(transendothelial electric resistance，TEER)為內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell，EC)與濾過層TEER之和，以無細(xì)胞的培養(yǎng)池作為對照，測得其電阻值為濾過層的TEER，則單層BCEC的電阻值為:TEEREC=(TEEREC+filter－TEERfilter)×S(膜面積)，單位為:Ω·cm2。

1.6.2 熒光素鈉通透性的測定

通過熒光酶標(biāo)儀測定熒光素鈉0.004，0.02，0.1，0.5和1 mg·L－1的熒光強度，每個樣品測定3次，取平均值繪制熒光素鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)文獻報道的方法［7－8］，測定并計算熒光素鈉體外透過BCEC單層的量。首先在接受池中加入1.5 ml Hanks液，在供給池中加入0.5 ml含有熒光素鈉10 mg·L－1的Hanks液，于1 h后從接受池中取100 μl溶液，測定熒光強度，再通過熒光素鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算熒光素鈉透過BBB模型及無細(xì)胞對照組的量。再根據(jù)公式清除體積(μl)=(cA×VA)/cL計算清除體積。cA為接受池濃度;VA為接受池體積;cL為供給池初濃度。

通過以清除體積對時間作圖，其斜率表示清除率(μl·min－1)，記作相應(yīng)的通透性(P)×表面積(S)。熒光素鈉體外透過BCEC單層的通透性×表面積(PSe)可由以下公式計算得到:1/PSe=1/PSt－1/PSf，其中PSt表示BBB的通透性×表面積，PSf表示無細(xì)胞的培養(yǎng)池對照組的通透性×表面積，S為細(xì)胞培養(yǎng)池的膜面積，本實驗的S為1.12 cm2。

1.7 應(yīng)用建立的模型檢測已知化合物的通透性

初步選擇具有不同轉(zhuǎn)運機制的化合物，如西咪替丁、秋水仙堿、氫化可的松、甲苯磺丁脲是主動外排的底物;水楊酸是主動吸收的底物;安替比林是被動擴散方式吸收，研究這些化合物在BBB模型中的通透性，并與文獻報道的體內(nèi)數(shù)據(jù)［9－10］進行比較，探討其間的相關(guān)性，以進一步驗證模型的可靠性。根據(jù)1.6.2中的方法，計算各化合物在體外BBB模型中的通透性。待各孔的電阻值達到300 Ω·cm2后，在接受池中加入1.5 ml Hanks液，在供給池中加入0.5 ml含有約20 mg·L－1藥物的Hanks液，1 h后從接受池中取一定量的溶液，低溫保存待測，并計算透過單層BCEC的量。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)的大鼠BCEC鑒定

接種初期可見由內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的呈枝狀的腦毛細(xì)血管段和零散的細(xì)胞(圖1A);培養(yǎng)1 d后可見培養(yǎng)的細(xì)胞從貼壁的血管段周圍長出，細(xì)胞呈梭形(圖1B);隨著培養(yǎng)時間的延長，內(nèi)皮細(xì)胞不斷增殖，細(xì)胞呈鋪路石狀，6 d左右細(xì)胞達到融合(圖1C)。因子Ⅷ相關(guān)抗原是BCEC特征性蛋白，因此，免疫組化檢測因子Ⅷ可用來鑒定細(xì)胞的純度。實驗結(jié)果表明，培養(yǎng)的BCEC的胞漿及核周有棕黃色著色，胞核呈空泡狀結(jié)構(gòu)(圖2A);未加一抗的對照組染色為陰性(圖2B)。細(xì)胞純度達95%以上。

Fig.1 Cell morphology of rat brain capillary endothelial cells(BCEC)under light microscope(×100).A:0 d after seeding;B:1 d after seeding;C:6 d after seeding.

Fig.2 Purification detection of BCEC by immunohistochemistry(DAB×100).A:the cells were cultured with rabbit anti-human factor Ⅷ IgG as the first antibody and goat antirabbit IgG as the second antibody;B:control group cells treated without antibodies.

2.2 培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞鑒定

星形膠質(zhì)細(xì)胞在原代培養(yǎng)后的9～10 d，細(xì)胞達到融合狀態(tài)，細(xì)胞出現(xiàn)分層，位于下層的星形膠質(zhì)細(xì)胞成簇生長，小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞位于上層生長，通過搖床可有效地將兩層細(xì)胞分離。采用這種分離方法得到的星形膠質(zhì)細(xì)胞純度比較高，細(xì)胞胞體呈圓形，具有分支狀突起(圖3);膠質(zhì)纖維酸性蛋白是星形膠質(zhì)細(xì)胞特征性蛋白，因此免疫組化檢測膠質(zhì)纖維酸性蛋白可用來鑒定細(xì)胞的純度。實驗結(jié)果表明，培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿及核周有棕黃色著色，細(xì)胞純度達95%以上，未加一抗的對照組染色為陰性(圖4)。

Fig.3 Cell morphology of rat astrocytes under light microscope(×100).

Fig.4 Purificaton detection of rat astrocytes by immunohistochemistry(DAB×100).A:the cells were cultured with glial fibrillary acidic protein as first antibody and goat anti-rabbit IgG as the second antibody;B:control group cells treated without antibodies.

2.3 BBB模型跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值

通過測定BCEC兩側(cè)的電阻可以評價緊密連接形成的程度。由于不同動物來源的內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞株、模型共培養(yǎng)的方法以及其他實驗條件的差異，文獻報道的共培養(yǎng)模型所形成的跨細(xì)胞電阻值不盡相同。但大多數(shù)結(jié)果表明，跨細(xì)胞單層電阻值應(yīng)該在300 Ω·cm2以上［11］，本實驗共培養(yǎng)模型的電阻值為(373±41)Ω·cm2，符合體外BBB模型的要求。

2.4 BBB模型熒光素鈉通透性

從熒光素鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)中可以看出，熒光素鈉濃度與其熒光強度相關(guān)性較好，可以通過熒光強度的量來反映溶液中熒光素鈉的濃度。本實驗以熒光素鈉在BBB模型中的清除體積對時間作圖(圖6)，其中y=0.3175x表示熒光素鈉透過BBB模型的體積與時間的關(guān)系，清除體積=(19.05±7.24)μl;y=1.9725x表示無細(xì)胞的對照組，清除體積=(118±31)μl，通過公式1/PSe=1/PSt–1/PSf即可計算出熒光素鈉跨BCEC單層的滲透系數(shù)為(0.34±0.14)×10－3cm·min－1，與文獻［12］報道的范圍相近。

Fig.5 Standard curve of fluorescein sodium.

Fig.7 Clearance of fluorescein sodium across in vitro blood brain barrier(BBB)model(○)or across a filter coated with collagen(●).

2.5 化合物在建立的BBB模型上的通透性

為了評價體外BBB模型在預(yù)測化合物體內(nèi)BBB滲透性的能力，本研究選擇6個已有文獻報道體內(nèi)BBB滲透性的化合物，測定其體外通透性。圖7結(jié)果表明，具有被動擴散的化合物安替比林具有最高的通透性，而主動吸收的水楊酸及主動外排的西咪替丁具有較低的通透性，相關(guān)性分析表明P=0.022。

Fig.7Correlation of compounds between in vitro and in vivo.BBB:blood brain barrier.

3 討論

目前分離培養(yǎng)BCEC的動物主要有牛、豬、大鼠和小鼠等。一般認(rèn)為牛、豬等大動物來源的BCEC更適合建立體外BBB，但由于牛、豬等動物取材不易，故很多實驗室采用鼠，尤其是大鼠作為分離材料。但大鼠來源的BCEC在體外傳代效果差，且容易失去原有內(nèi)皮細(xì)胞的特性。為了使分離的BCEC在體外保持原有內(nèi)皮細(xì)胞特性，我們采用原代的大鼠來源的BCEC建立體外BBB，取得了較好的效果。BCEC的培養(yǎng)關(guān)鍵是細(xì)胞的純化，純化方法有通過免疫磁珠純化、Percoll離心純化［13－14］等，這些方法較為繁瑣，增加了分離的時間，也有可能影響細(xì)胞的活性。參考文獻［3］，在分離得到血管段后，省去Percoll離心等步驟，在培液中加入一定濃度的P-gp底物嘌羅霉素，結(jié)果表明嘌羅霉素可以起到很好地純化BCEC的作用，細(xì)胞純度達到95%以上。

星形膠質(zhì)細(xì)胞的分離與培養(yǎng)相對較為簡單，但其可能被小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞污染。McCarthy等［6］的研究表明，在原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)7～9 d后將培養(yǎng)瓶置于水平搖床，于250 rpm·min－1，37℃條件下?lián)u動15～18 h，使生長在星形膠質(zhì)細(xì)胞上的少突膠質(zhì)細(xì)胞和其他細(xì)胞脫離，通過換液棄去懸浮的雜細(xì)胞后，將仍附著于培養(yǎng)瓶的細(xì)胞用于培養(yǎng)，即可獲得純度95%以上的星形膠質(zhì)細(xì)胞。

BBB模型的建立一般采用BCEC與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的方式，基于膠質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)體系位置的不同可以分為以下2種:①接觸式共培養(yǎng)，即BCEC與膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)池兩側(cè)，上側(cè)接種內(nèi)皮細(xì)胞，下側(cè)接種膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞間可以緊密接觸。②非接觸式共培養(yǎng)，即內(nèi)皮細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)池的上側(cè)，膠質(zhì)細(xì)胞接種于培養(yǎng)板的底部，細(xì)胞間雖然不能夠相互接觸，但細(xì)胞間物質(zhì)可以自由交換。至于哪一種方法更好，目前還存在一些爭議。有研究表明，非接觸式共培養(yǎng)與體內(nèi)結(jié)果有很好的相關(guān)性，而接觸式共培養(yǎng)產(chǎn)生更強的限制性屏障。一般來說，接觸式共培養(yǎng)可以用于BBB功能的研究，而非接觸式共培養(yǎng)可以用于物質(zhì)通透性研究。其他模型，如3種細(xì)胞共培養(yǎng)模型或動態(tài)共培養(yǎng)模型等，它們可能更接近體內(nèi)的真實狀態(tài)，但相對較為繁瑣，難以廣泛應(yīng)用［15］。由于本研究主要側(cè)重于研究不同化合物的通透性，因此，建立的是非接觸式共培養(yǎng)模型。通過形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)對BCEC和星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定，表明符合建立BBB的基本細(xì)胞要求。通過測定BCEC單層細(xì)胞的電阻和熒光素鈉的通透性結(jié)果表明，建立的非接觸式體外BBB模型符合體外BBB模型的要求。盡管體外建立的BBB模型具有體內(nèi)的某些特點，但體外模型是否能夠預(yù)測體內(nèi)的情況，關(guān)鍵是看其相關(guān)性如何。因此，本研究測定了6個具有不同物化性質(zhì)的化合物在體外模型中的通透性，并與相應(yīng)的體內(nèi)數(shù)據(jù)比較，結(jié)果表明兩者具有一定的相關(guān)性(R2=0.7679)。

總之，本研究建立的BBB模型較好地反映了體內(nèi)的情況，可以用于模擬體內(nèi)環(huán)境，進行藥物早期篩選方面的研究。但由于本研究評價指標(biāo)的選擇、化合物數(shù)量及性質(zhì)的局限性，本方法還需進一步的驗證和完善。

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Transendothelial electric resistance and permeability of in vitro model of no-contact co-culture blood-brain barrier

ZHANG Shui-hua1，2，JI Long-feng2，MA Jing2
(1.Fujian Center for Safety Evaluation of New Drugs，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou350108，China;2.National Shanghai Center for New Drug Safety Evaluation and Research，Shanghai201203，China)

OBJECTIVETo establish and evaluate a co-culture model of blood-brain barrier(BBB)using primary rat brain capillary endothelial cells(BCEC)and astrocytes.METHODSPrimary cultures of BCEC and astrocytes were prepared from SD rats.Two kinds of cells were identified through cell morphology and immunohistochemistry.No-contact co-culture BBB model in vitro was developed and transendotheliar resistance and permeability of fluorescein sodium were measured.Additionally in vitro BBB permeabilities of six compounds were measured by LC-MS and compared their results with in vivo from literatures.RESULTSThe cultured BCEC possessed the spindle-shaped morphology and expressed factor Ⅷ antigen.The cultured astrocytes possessed cell process morphology and expressed GFAP antigen.Transendothelial electric resistance(TEER)and permeability of fluorescein sodium were(373±41)Ω·cm2and(0.34±0.14)×10－3cm·min－1，respectively.These values were consistent with literatures.The correlation(R2=0.7679，P＜0.05)between in vitro permeability of selected six compounds and the in vivo published data was calculated.CONCLUSIONTEER and permeability of in vitro BBB model have similar properties as that of in vivo BBB model.This model can simulate environment in vivo BBB and be used for drug screening study.

capillary endothelial cells，brain;astrocytes;blood-brain barrier

The project supported by state Major Scientific Special Project for″Major New Drugs Innovation and Development″(2008ZX09305-006);Scientific Research Foundation for Doctor of Fujian Medical University(2011BS5002);Fujian Province Government Special Fund(Min Fa Gai High-tech 2009-648)

Ma Jing，E-mail:jma@ncdser.com

R963

A

1000-3002(2012)06-0882-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.06.018

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(2008ZX09305-006);福建醫(yī)科大學(xué)博士科研啟動基金(2011BS002);福建省政府專項基金(閩發(fā)改高技2009-648)

張水華(1977－)，男，博士，主要從事藥物毒理學(xué)研究。

馬璟，E-mail:jma@ncdser.com

2012-03-22接受日期:2102-09-15)

(本文編輯:喬虹)