艾洛替尼耐藥肝癌HepG2細胞系的建立及其耐藥機制

任志廣，趙青，魏寅祥，賈硯寒，李新穎，黎燕，彭暉，馬遠方

(1.河南大學醫(yī)學院細胞與分子免疫學實驗室，河南開封475004;2.軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所分子免疫學研究室，北京100850;3.南開大學醫(yī)學院，天津300071)

艾洛替尼耐藥肝癌HepG2細胞系的建立及其耐藥機制

任志廣1，2，趙青2，3，魏寅祥1，2，賈硯寒2，李新穎2，黎燕2，彭暉2，馬遠方1

(1.河南大學醫(yī)學院細胞與分子免疫學實驗室，河南開封475004;2.軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所分子免疫學研究室，北京100850;3.南開大學醫(yī)學院，天津300071)

目的體外建立艾洛替尼(erlotinib)耐藥的人肝癌細胞系HepG2/erlotinib，鑒定其生物學特性，并對其耐藥機制進行初步探討。方法逐步遞增艾洛替尼并最終給予艾洛替尼50 μmol·L－1連續(xù)沖擊HepG2細胞12個月，建立HepG2/erlotinib?；酋Ａ_丹明B法檢測HepG2/erlotinib耐藥倍數(shù)和耐藥譜;測定細胞生長曲線并計算細胞增殖時間;流式細胞術(shù)檢測細胞周期;RT-PCR和Western印跡法檢測HepG2/erlotinib細胞乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)基因和蛋白的表達;流式細胞術(shù)檢測細胞表面BCRP蛋白表達。結(jié)果經(jīng)過12個月艾洛替尼誘導的HepG2耐藥細胞，艾洛替尼的IC50值為(72.3±6.1)μmol·L－1，艾洛替尼對正常HepG2細胞的IC50值為(10.6±0.3)μmol·L－1，耐藥倍數(shù)為6.8±0.7，表明HepG2/erlotinib為艾洛替尼耐藥細胞系。HepG2/erlotinib對順鉑、多柔比星、米托蒽醌和拓撲替康的IC50均大于正常HepG2細胞的IC50，表明產(chǎn)生交叉耐藥性。HepG2細胞和HepG2/erlotinib細胞的群體倍增時間分別為(20.7±3.3)h和(26.7±1.2)h，耐藥細胞倍增時間延長。與HepG2細胞相比，HepG2/erlotinib的S期細胞比例明顯增高(P＜0.05)，G0/G1期細胞比例明顯降低(P＜0.01);HepG2/erlotinib細胞中BCRP基因和BCRP蛋白表達顯著升高(P＜0.05)。結(jié)論建立的HepG2/erlotinib具有耐藥細胞的特征和生物學特性，其耐藥機制與BCRP蛋白表達增加有關。

艾洛替尼;肝癌;細胞系;耐藥

大量研究表明，人類多種常見癌癥中均有表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)高表達，其中包括肝癌(EGFR表達率占58.18%［1］)。近年來，分子靶向藥物開始試用于晚期肝癌治療，個別藥物取得了突破性進展。艾洛替尼(erlotinib)作為EGFR酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)對許多表達EGFR的患者癌細胞系都具有抑制活性，如卵巢癌、前列腺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、子宮頸癌及頭頸癌等［2］，其作為治療NSCLC和胰腺癌的藥物已被美國FDA批準上市［3］，但是在臨床治療NSCLC中出現(xiàn)了耐藥現(xiàn)象［4］。現(xiàn)在艾洛替尼用于肝癌的治療已經(jīng)處于Ⅲ期臨床研究，將來有可能作為EGFR-TKI治療肝癌。多個Ⅱ期臨床研究顯示出喜人的結(jié)果［5－6］，一項艾洛替尼治療晚期肝癌的Ⅱ期臨床研究顯示［6］，38例不宜手術(shù)的晚期肝癌患者在接受艾洛替尼治療后，12例(32%)在6個月時沒有出現(xiàn)腫瘤進展，其中3例(8%)達到部分緩解并分別維持了2，10和11個月，19例(50%)病情穩(wěn)定，中位疾病進展時間為3.2個月，中位生存期為13個月。其單藥或聯(lián)合其他藥物治療的臨床研究正在進行中，以EGFR為靶點的治療方法被認為是最有希望的肝癌靶向治療途徑之一［7］。本研究選取高表達EGFR的肝癌HepG2細胞來誘導艾洛替尼的耐藥，探討EGFR在未來肝癌靶向治療的可行性及療效，進而為其發(fā)病機制研究和耐藥防治提供新的思路和理論依據(jù)。本研究采用逐步遞增給予艾洛替尼沖擊HepG2細胞，建立艾洛替尼耐藥的肝癌HepG2細胞系，并觀察其生物學特性和耐藥機制，為研究腫瘤細胞對艾洛替尼耐藥的分子機制及設計和篩選有效的抗耐藥腫瘤藥物提供了條件。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

艾洛替尼購自百靈威公司，純度＞98%，以二甲基亞砜(DMSO)溶解成10 mmol·L－1儲備液，臨用前用培養(yǎng)基稀釋;順鉑和鹽酸米托蒽醌注射液，江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn);注射用鹽酸多柔比星，輝瑞制藥有限公司產(chǎn)品;紫杉醇注射液，浙江海正藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品;注射用鹽酸拓撲替康，黃石飛云制藥有限公司產(chǎn)品;藥物以DMSO溶解成5 mmol·L－1儲備液，臨用前用培養(yǎng)基稀釋為相應濃度;高糖DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司，胎牛血清購自元亨金馬公司;磺酰羅丹明B(SRB)購自Sigma公司;一抗小鼠抗人ABCG2(BCRP，ab3380)單克隆抗體購自Abcam公司，一抗小鼠抗人GAPDH(CB100127)單克隆抗體購自California Bioscience公司，二抗辣根酶標記山羊抗小鼠IgG抗體(HRP-GAM，2B-2305)購自中山金橋公司;流式直標PE抗體5D3〔乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)，CD338〕購自eBiosciences公司;PVDF膜購自Millipore公司;碘化丙啶(propidium iodide，PI)購自Sigma公司;Trizol購自Invitrogen公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自全式金生物技術(shù)有限公司;Tap酶及其他分子生物學試劑購自天根生化科技有限公司;其余試劑為國產(chǎn)分析純試劑。Forma 3111型CO2培養(yǎng)箱(美國);Olympus CK40型倒置顯微鏡(日本);BD FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司);PCR擴增儀Eppendorf AG22331(德國)。

1.2 細胞系和細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞系HepG2為本室傳代保存，細胞在含有10%滅活胎牛血清，青霉素100 kU·L－1和鏈霉素100 kU·L－1的DMEM完全培養(yǎng)基中，放入37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。0.02%EDTA-2Na和0.25%胰蛋白酶按1∶1混合后消化傳代。細胞按常規(guī)方法培養(yǎng)，并取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.3 HepG2/erlotinib耐藥細胞系的誘導

采用程國鈞等［8－9］介紹的逐步遞增聯(lián)合大劑量方法在體外進行誘導，具體方法為:取對數(shù)生長期的HepG2細胞加入到含艾洛替尼的DMEM培養(yǎng)液中，從低濃度0.5 μmol·L－1開始，處理24 h后撤去含藥培養(yǎng)基，加入新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，細胞恢復正常生長后加入高濃度的艾洛替尼，反復換液傳代，逐步提高濃度，分別為1，5，10，20，50 μmol·L－1，間歇換液誘導，艾洛替尼最終處理濃度為50 μmol·L－1。經(jīng)過12個月的誘導，成功建立艾洛替尼耐藥的肝癌細胞系HepG2/erlotinib。

1.4 SRB法檢測藥物體外的耐藥倍數(shù)和交叉耐藥譜

取對數(shù)生長期的HepG2和HepG2/erlotinib細胞制成單細胞懸液接種到96孔板中，每孔細胞數(shù)為3×104個，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h后加入艾洛替尼0，0.025，0.1，0.4，1.56，6.25，12.5，25和100 μmol·L－1檢測耐藥倍數(shù)，順鉑、多柔比星、紫杉醇、米托蒽醌和拓撲替康0，0.003，0.012，0.05，0.20，0.78，3.125，12.5和50 μmol·L－1檢測交叉耐藥譜［10］，溶液總體積為200 μl，均設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)72 h，以SRB［11］法檢測，具體步驟如下:用真空泵將96孔板中的培養(yǎng)基吸出，每孔加入70 μl SRB染液，室溫反應30 min，150 μl 1%醋酸溶液洗板3次，晾干，最后每孔200 μl加入Tris溶液10 mmol·L－1溶解染液，用酶標儀檢測570 nm的吸光度(A)值。以Prism 3.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理并計算藥物的半數(shù)抑制濃度IC50，即細胞存活率減少50%時的藥物劑量。并計算HepG2/erlotinib細胞對相應藥物的耐藥倍數(shù)，耐藥倍數(shù)(resistant factor，RF)=藥物在HepG2/erlotinib細胞中的IC50/藥物在HepG2細胞中IC50值［12］。

1.5 HepG2/erlotinib細胞群體倍增時間測定

取對數(shù)生長期的HepG2和HepG2/erlotinib細胞，按1×104個每孔分別接種于24孔板中，設置3個復孔，放置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育，分別在24，48，72，96，120和144 h進行細胞計數(shù)，并計算平均值。以細胞數(shù)為縱坐標，培養(yǎng)時間為橫坐標繪制細胞生長曲線。按照Patterson法［13］計算細胞群體倍增時間，細胞群體倍增時間=t×lg2/(lgNtlgN0)，其中t為Nt－N0的時間，N0為初始細胞數(shù)，Nt為終末細胞數(shù)。

1.6 流式細胞術(shù)檢測HepG2/erlotinib細胞的細胞周期

收集HepG2和HepG2/erlotinib細胞，按照每管5×105個細胞進行實驗，PBS洗2次，70%冰乙醇－20℃固定36 h，PBS洗2次，加入100 μl RNA酶1 g·L－1，37℃避光孵育30 min，再加入100 μl PI染液避光孵育30 min，置流式細胞儀檢測，Cell Quest軟件分析細胞周期比例。

1.7 RT-PCR檢測耐藥基因BCRP的表達

用于特異性擴增BCRP上游引物為CCCGCGACAGCTTCCAATGA，下游引物為GGCGTTGAGACCAGGTTTCA，擴增長度171 bp。用于特異性擴增GAPDH上游引物為CCGTCTAGAAAAACCTGCC，下游引物:GCCAAATTCGTTGTCATACC擴增長度320 bp。由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成引物。收集對數(shù)生長期的HepG2和HepG2/erlotinib各5×106個細胞，用Trizol試劑提取細胞中的總RNA。取2 μl RNA，再加入Oligo(dT)，TX Mix，2×TX Mix，無RNA酶H2O，反應總體積20 μl，混勻，42℃反應30 min，85℃反應5 min，反應產(chǎn)物－20℃保存。取2 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，再加入相應引物、2×Tap Mix、適量去離子水，混勻，PCR擴增儀擴增目的基因，反應結(jié)束，進行EB瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈觀察結(jié)果并照相，對基因條帶進行灰度分析，以GAPDH為內(nèi)參，計算BCRP基因表達。

1.8 Western印跡法檢測BCRP蛋白的表達

收集對數(shù)生長期HepG2和HepG2/erlotinib各5×106個細胞，PBS洗2次，在冰上加入WB裂解液，制備蛋白樣品。取30 μg樣品上樣于12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束將蛋白條帶轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，一抗1∶1000，4℃孵育過夜，洗滌后加入山羊抗小鼠的IgG二抗1∶2000室溫孵育1 h，以ECL顯色，暗室曝光，對蛋白條帶進行灰度分析，以GAPDH為內(nèi)參，計算BCRP蛋白表達。

1.9 流式細胞術(shù)檢測BCRP表達

收集對數(shù)生長期細胞HepG2和HepG2/erlotinib各5×105個細胞，PBS洗2次，每管加入10 μl PE直標BCRP抗體，4℃避光孵育30 min，PBS洗2次，最后以300 μl PBS懸浮細胞，流式細胞儀檢測分析。陽性率以細胞膜表面BCRP蛋白與抗體結(jié)合的強度Gate值表示［14］，實驗重復3次取平均值。

1.10 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 HepG2/erlotinib耐藥系耐藥特性鑒定

HepG2細胞經(jīng)12個月的連續(xù)誘導、培養(yǎng)，傳代30次以上后，可以穩(wěn)定生長在含有艾洛替尼50 μmol·L－1的DMEM培養(yǎng)基中。新建立的細胞系，HepG2/erlotinib，細胞毒檢測結(jié)果顯示，艾洛替尼對于HepG2/erlotinib的IC50值為(72.3±6.1)μmol·L－1，而對于HepG2的IC50值為(10.6±0.3)μmol·L－1，其耐藥倍數(shù)為(6.84±0.7)倍。HepG2/erlotinib細胞系停止艾洛替尼刺激1個月，細胞的耐藥倍數(shù)仍能保持6倍左右。表明HepG2/erlotinib為艾洛替尼穩(wěn)定耐藥系。

2.2 HepG2/erlotinib細胞交叉耐藥譜

表1結(jié)果顯示，HepG2/erlotinib對多柔比星、順鉑、米托蒽醌和拓撲替康的IC50明顯高于相應的HepG2細胞的IC50(P＜0.01)，耐藥倍數(shù)以米托蒽醌最高，達10.87±0.92，最低的紫杉醇，為0.49±0.01，說明HepG2/erlotinib細胞為多藥耐藥細胞;多柔比星、米托蒽醌和拓撲替康均為耐藥相關蛋白BCRP的底物［15］，提示HepG2/erlotinib耐藥性可能與BCRP相關。

Tab.1 IC50of HepG2 cells and HepG2/erlotinib cells to different anticancer agents

2.3 HepG2細胞和HepG2/erlotinib細胞群體倍增時間

圖1為HepG2細胞和HepG2/erlotinib細胞的生長曲線。從圖中可以看出，HepG2/erlotinib細胞的群體倍增時間明顯高于HepG2細胞，分別為(20.7±3.3)h和(26.7±1.2)h，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

Fig.1 Proliferative rate of HepG2 and HepG2/erlotinib cells.±s，n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with HepG2 cells.

2.4 HepG2和HepG2/erlotinib的細胞周期

如表2所示，與HepG2細胞相比，HepG2/erlotinib細胞的G0/G1期比例減少(P＜0.01)，S期比例增加(P＜0.05)，G2/M期比例稍有增高，但差異沒有統(tǒng)計學意義。

Tab.2 Cell cycle of HepG2 and HepG2/erlotinib cells

2.5 耐藥基因BCRP在HepG2/erlotinib中的表達

圖2顯示，HepG2細胞中未見相應BCRP條帶顯示，說明HepG2細胞中無BCRP的表達;而在HepG2/erlotinib細胞中耐藥基因BCRP表達有明顯水平。定量結(jié)果顯示，HepG2灰度值(0.14±0.12)，HepG2/erlotinib灰度值(0.44±0.16)，兩者之間存在顯著性差異(P＜0.05)(圖B)，表明HepG2/erlotinib耐藥性的出現(xiàn)與BCRP的高表達有關。

Fig.2 Breast cancer resistance protein(BCRP)mRNA expression in HepG2 and HepG2/erlotinib cells.

2.6 BCRP蛋白在HepG2/erlotinib中的表達

圖3顯示，HepG2細胞中未見相應BCRP條帶，說明HepG2細胞中無BCRP蛋白的表達;而在HepG2/erlotinib細胞中耐藥蛋白BCRP表達有明顯水平。定量結(jié)果顯示，HepG2灰度值(0.83±0.01)，HepG2/erlotinib灰度值(0.94±0.04)，兩者之間存在顯著差異(P＜0.05)，表明HepG2/erlotinib耐藥性的出現(xiàn)與BCRP蛋白的高表達有關。

Fig.3 BCRP protein expression in HepG2 cells and HepG2/erlotinib cells by Western blotting.

圖4中的流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，HepG2/erlotinib細胞膜表面有BCRP蛋白表達，HepG2細胞與BCRP抗體結(jié)合陽性率僅為(1.49±0.44)%，HepG2/erlotinib細胞與BCRP抗體結(jié)合陽性率為(11.51±1.39)%(P＜0.01)，進一步表明HepG2/erlotinib耐藥性的出現(xiàn)與BCRP蛋白的高表達有關。

Fig.4 BCRP protein expression on HepG2 and HepG2/erlotinib cell surface by flow cytometry.1:HepG2 cells;2:HepG2/erlotinib cells.

3 討論

目前，我國是世界上肝癌發(fā)病率最高的國家，發(fā)病數(shù)占全世界的55%，死亡數(shù)占45%［16］，且在肝癌中有較高的EGFR表達率［7］，多藥耐藥是影響化療后的療效和臨床預后的主要原因［17］，因此尋找新的治療藥物和解決藥物產(chǎn)生的耐藥性為治療肝癌的策略和手段。腫瘤的耐藥機制復雜，體外建立腫瘤細胞耐藥株模型為研究耐藥機制提供先決條件［9］。艾洛替尼作為肝癌的分子靶向治療，已經(jīng)進入Ⅲ期臨床研究，極有可能成為第一個EGFR-TKI用于肝癌治療。艾洛替尼在臨床治療NSCLC中已出現(xiàn)了耐藥現(xiàn)象，其主要原因是EGFR T790M突變導致對EGFR-TKI治療的耐藥性的產(chǎn)生［18］，而HepG2/erlotinib耐藥細胞中進行EGFR突變區(qū)檢測并未發(fā)現(xiàn)T790M突變，提示肝癌對艾洛替尼耐藥機制復雜與NSCLC有所不同。

本研究采用逐步遞增聯(lián)合大劑量沖擊方法，經(jīng)過12個月的誘導培養(yǎng)，成功建立了艾洛替尼耐藥的肝癌細胞系HepG2/erlotinib，為深入研究肝癌艾洛替尼的耐藥機制和篩選耐藥逆轉(zhuǎn)劑提供了理想的模型。對其細胞特性進行了初步鑒定，耐藥倍數(shù)為6.84±0.7，與HepG2細胞相比，HepG2/erlotinib細胞的G0/G1期比例減少及S期比例增加，可能與耐藥細胞生長速度變慢有關，細胞的群體倍增時間變長，表明HepG2/erlotinib細胞對藥物的敏感性下降［19］。耐藥譜檢測發(fā)現(xiàn)對化療藥物順鉑、多柔比星、米托蒽醌和拓撲替康有一定的交叉耐藥性，對紫杉醇保持敏感，而多柔比星、米托蒽醌和拓撲替康是耐藥相關蛋白BCRP的底物［15］，表明HepG2/erlotinib的耐藥性的出現(xiàn)可能與BCRP相關。RT-PCR，Western印跡法和流式細胞術(shù)研究結(jié)果證實了耐藥細胞中存在BCRP基因和蛋白的表達上調(diào)，說明其耐藥性的產(chǎn)生與BCRP相關。以往的肝癌耐藥性研究中，Ding等［20］報道肝癌耐藥產(chǎn)生與P糖蛋白有相關，而楊俊霞等［21］在誘導建立順鉑耐藥的肝癌細胞系時發(fā)現(xiàn)其耐藥性的產(chǎn)生與細胞內(nèi)谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶蛋白的高表達相關，可能與所用的不同化療藥治療相關，也說明了肝癌細胞產(chǎn)生耐藥性的復雜性。而本實驗室建立的HepG2/erlotinib細胞，與多個化療藥有交叉耐藥，其耐藥性的產(chǎn)生是否與P糖蛋白和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶蛋白相關還有待進一步研究。HepG2/erlotinib細胞系對DNA損傷類藥物順鉑也存在交叉耐藥，表明其耐藥機制的復雜性，為此我們將用基因組學和蛋白組學的研究方法進一步闡明其耐藥的產(chǎn)生機制。

總之，HepG2/erlotinib細胞對艾洛替尼產(chǎn)生耐藥的原因很復雜，本研究初步鑒定了HepG2/erlotinib細胞中BCRP蛋白的高表達與其耐藥性有一定的關系。此外，HepG2/erlotinib耐藥細胞系的建立，也為進一步研究分子靶向在肝癌治療中的應用、可能的耐藥機制和篩選耐藥逆轉(zhuǎn)劑提供了物質(zhì)基礎。

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Establishment of erlotinib-resistant HepG2 cell line and its resistant mechanisms

REN Zhi-guang1，2，ZHAO Qing2，3，WEI Yin-xiang1，2，JIA Yan-han2，LI Xin-ying2，LI Yan2，PENG Hui2，MA Yuan-fang1
(1.Laboratory of Cellular and Molecular Immunology，School of Medicine，Henan University，Kaifeng475004，China;2.Department of Molecular Immunology，Institute of Basic Medical Sciences，Academy of Military Medical Sciences，Beijing100850，China;3.School of Medicine，
Nankai University，Tianjin300071，China)

OBJECTIVETo establish a human hepatocellular carcinoma cell line with resistance to erlotinib，and to investigate its possible resistance mechanism.METHODSThe cell line HepG2 was cultured by gradually increasing dose of erlotinib and final dose 50 μmol·L－1in vitro for 12 months to generate its resistance cell line HepG2/erlotinib.The resistant index of ertotinib was determined by sulforhodamine B(SRB);cell growth curve，doubling time and cell cycle phase distribution were measured;breast cancer resistance protein(BCRP)mRNA and its protein level were examined by RT-PCR，Western blotting and flow cytometry.RESULTSAfter induced for 12 months，a resistant cell line HepG2/erlotinib was established.The IC50value of HepG2/erlotinib to erlotinib was(72.3±6.1)μmol·L－1while that of HepG2 to erlotinib was(10.6±0.3)μmol·L－1，with the resistant index of 6.84±0.7.The IC50values of HepG2/erlotinib to cisplatin，doxorubicin，mitoxantrone and topotecan were greater than that of HepG2 cells，indicated that it had cross resistance to these drugs.The doubling time of HepG2 and HepG2/erlotinib was(20.7±3.3)h and(26.7±1.2)h，respectively.In the HepG2/erlotinib resistant cell line，the cell numbers of S phase increased(P＜0.05)while that of G0/G1phase decreased(P＜0.01).HepG2/erlotinib cells expressed higher levels of BCRP mRNA and BCRP protein compared with parental cells(P＜0.05).CONCLUSIONAn erlotinib-resistant human hepatocellular carcinoma cell line HepG2/erlotinib is established.It shows a typical resistant phenotype and biological characteristics.The high BCRP expression may contribute to its resistance to erlotinib.

erlotinib;hepatocellular carcinoma;cell line;drug resistance

The project supported by National Natural Science Foundation of China(30873083);and National Natural Science Foundation of China(81173082)

PENG Hui，E-mail:p_h2002@hotmail.com，Tel:(010)66931326;MA Yuan-fang，E-mail:mayf@henu.edu.cn，Tel:(0378)3885036

R979.1

A

1000-3002(2012)06-0823-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.06.008

國家自然科學基金(30873083);國家自然科學基金(81173082)

任志廣(1986－)，男，碩士研究生，E-mail:renzhiguang66@126.com，主要從事腫瘤藥理學研究。

彭暉，E-mail:p_h2002@hotmail.com，Tel:(010)66931326;馬遠方，Tel:(0378)3885036，E-mail:mayf@henu.edu.cn

2012-01-05接受日期:2012-03-13)

(本文編輯:喬虹)