卡托普利對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化家兔血管內(nèi)皮功能的保護(hù)作用及其機(jī)制

徐文娟，馮梅，劉麗華，魯長(zhǎng)武，熊燕1，

(1.廣州醫(yī)學(xué)院蛇毒研究所藥理學(xué)教研室，廣東廣州510182;2.中南大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，湖南長(zhǎng)沙410078)

卡托普利對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化家兔血管內(nèi)皮功能的保護(hù)作用及其機(jī)制

徐文娟1，2*，馮梅1，2*，劉麗華2，魯長(zhǎng)武2，熊燕1，2

(1.廣州醫(yī)學(xué)院蛇毒研究所藥理學(xué)教研室，廣東廣州510182;2.中南大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，湖南長(zhǎng)沙410078)

目的探討卡托普利對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化(AS)家兔血管內(nèi)皮功能和形態(tài)的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法采用高脂、高膽固醇飼料飼養(yǎng)家兔制備AS模型的同時(shí)口服給予卡托普利8 mg·kg-1，每天1次，連續(xù)12周;HE染色觀察血管組織形態(tài)，檢測(cè)血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL);高效液相色譜測(cè)定血清非對(duì)稱性二甲基精氨酸(ADMA)濃度;用重組編碼人類二甲基精氨酸-二甲胺水解酶2(hDDAH2)基因的腺病毒感染AS家兔離體胸主動(dòng)脈環(huán)2 h，檢測(cè)對(duì)乙酰膽堿累積濃度誘導(dǎo)的最大舒張反應(yīng)(Emax)、半數(shù)有效量(EC50)及DDAH活性。結(jié)果與正常組比較，高脂模型家兔胸主動(dòng)脈內(nèi)膜和中膜增厚，血清TC，TG和LDL水平升高;血清ADMA濃度升高至(2.24±0.28)μmol·L-1(P＜0.01);血管壁DDAH活性降至(0.048±0.007)U·g-1蛋白(P＜0.01);Emax降低至(56±8)%(P＜0.01)，EC50升高至(158±52)nmol·L-1(P＜0.01)。與AS模型組比較，卡托普利治療組血管內(nèi)膜增厚減輕，血脂無(wú)明顯降低，血清ADMA濃度顯著降低至(1.37±0.23)μmol·L-1(P＜0.01)，血管DDAH活性增加至(0.084±0.013)U·g-1蛋白(P＜0.01)，內(nèi)皮依賴性血管舒張功能改善，Emax增加至(88±4)%(P＜0.01)，EC50降低至(90±35)nmol·L-1(P＜0.01)。AS模型血管轉(zhuǎn)染DDAH2基因后，血管Emax回升至(88±4)%，EC50降低至(98±42)nmol·L-1，DDAH活性升高至(0.112±0.017)U·g-1蛋白，與卡托普利治療組相似。結(jié)論卡托普利對(duì)AS家兔血管形態(tài)和內(nèi)皮功能具有明顯保護(hù)作用，其機(jī)制可能與增加血管DDAH活性，降低內(nèi)源性ADMA濃度有關(guān)。

動(dòng)脈粥樣硬化;內(nèi)皮功能不全;卡托普利;非對(duì)稱性二甲基精氨酸;二甲基精氨酸二甲胺水解酶

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是許多心血管疾病的共同病理基礎(chǔ)，血管內(nèi)皮功能不全在AS的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。一氧化氮(nitric oxide，NO)介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)降低或消失是血管內(nèi)皮功能不全的主要特征;這種血管反應(yīng)性變化早于AS性斑塊形成之前，被認(rèn)為是AS的早期標(biāo)志;對(duì)人群的前瞻性研究表明，內(nèi)皮功能不全還是心血管事件的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子［1］。

血管內(nèi)皮細(xì)胞合成、分泌的NO是一種強(qiáng)大的血管舒張因子，由其前體L-精氨酸在內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelialnitricoxidesynthase，eNOS)催化下轉(zhuǎn)化而來(lái);除介導(dǎo)內(nèi)皮依賴性血管舒張和調(diào)節(jié)血管張力以外，NO還可抑制白細(xì)胞黏附、血小板聚集和血管平滑肌增殖等AS形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是一種重要的抗AS分子。機(jī)體存在著一種調(diào)節(jié)NO合成的內(nèi)源性機(jī)制，L-精氨酸的同系物非對(duì)稱性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)能與L-精氨酸競(jìng)爭(zhēng)NOS，減少NO生成;因此，ADMA被確認(rèn)是NOS的內(nèi)源性抑制物［2］。ADMA除少部分經(jīng)腎原形排泄外，90%以上由廣泛分布于各組織和細(xì)胞中的二甲基精氨酸-二甲胺水解酶(dimethylarginine dimethylaminohydrolase，DDAH)代謝為胍氨酸和二甲胺［3］。已知DDAH分為DDAH1和DDAH2亞型，其中DDAH2主要分布于表達(dá)eNOS的組織。因此，DDAH2是決定血管內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)源性ADMA濃度的重要調(diào)節(jié)因子。大量研究表明，ADMA是內(nèi)皮功能不全的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子，已成為AS新的標(biāo)志物［3-6］。因此，尋找對(duì)抗ADMA所致血管內(nèi)皮功能損傷的有效藥物對(duì)于臨床防治AS性心血管疾病具有重要意義。

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI)是目前臨床上治療多種心血管疾病的一類重要藥物?？ㄍ衅绽?captopril)是一個(gè)含巰基的ACEI。國(guó)內(nèi)外的研究表明，卡托普利不僅能阻斷腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活，還具有改善內(nèi)皮依賴性血管舒張功能的心血管保護(hù)效應(yīng)［7-10］。但卡托普利的心血管保護(hù)作用是否與DDAH和ADMA有關(guān)還不完全清楚。因此，本研究采用高脂、高膽固醇飼養(yǎng)致AS家兔模型，探討卡托普利對(duì)血管形態(tài)和內(nèi)皮功能的保護(hù)作用及其機(jī)制，并采用DDAH2基因過(guò)表達(dá)以針對(duì)性地降低血管內(nèi)皮細(xì)胞中ADMA含量作為陽(yáng)性對(duì)照，比較卡托普利治療組與體外轉(zhuǎn)染DDAH2基因治療對(duì)AS家兔血管環(huán)DDAH活性抑制以及內(nèi)皮依賴性舒張功能損害的治療效果，以闡明ACEI保護(hù)血管內(nèi)皮功能的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

苯腎上腺素、乙酰膽堿、ADMA、安替比林及二乙酰單肟購(gòu)自Sigma公司(St Louis，MO，USA)，卡托普利由湖南湘雅制藥有限公司惠贈(zèng)，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純;血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglycerides，TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)測(cè)試盒均為浙江東甌生物工程有限公司產(chǎn)品，考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 動(dòng)物、動(dòng)脈粥樣硬化模型的制備及分組

成年雄性家兔15只，1.5±0.2 kg，由中南大學(xué)動(dòng)物學(xué)部提供，合格證號(hào):SCXK(湘)2009-0004。經(jīng)1周適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組和卡托普利組，每組5只;正常對(duì)照組飼普通飼料，高脂模型組飼高脂飼料(含1%膽固醇、5%豬油和10%蛋黃粉)，卡托普利組每天飼含卡托普利8 mg·kg-1的高脂混合飼料連續(xù)12周。所有家兔分籠飼養(yǎng)，自由攝食和飲水，并維持室溫在20～25℃。

1.3 標(biāo)本采集

家兔模型飼養(yǎng)結(jié)束后，采用3%戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1，ip)麻醉并行頸動(dòng)脈插管取血，離心分離血清，保存于-70℃用于測(cè)定血脂和血清ADMA含量。取血后立即開胸，摘取胸主動(dòng)脈置于預(yù)冷的(4℃)Krebs-Henseleit(K-H)緩沖液(mmol·L-1:NaCl 118.3，KCl 4.7，CaCl22.5，MgSO41.2，KH2PO41.2，NaHCO325.0，葡萄糖11.0)中，并充以95%O2和5%CO2的混合氣體;小心剔除血管周圍結(jié)締組織及脂肪組織，避免損傷血管內(nèi)皮;取靠近主動(dòng)脈弓部的血管段進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)檢查;其中一段血管條剪成3～4 mm長(zhǎng)血管環(huán)，用于血管舒張功能的檢測(cè)、體外基因轉(zhuǎn)染以及DDAH活性測(cè)定。

1.4 病理形態(tài)檢查

取靠近升主動(dòng)脈根部1 cm 血管段連同主動(dòng)脈弓縱行切開，先肉眼觀察動(dòng)脈內(nèi)壁是否光滑，有無(wú)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。然后用10%甲醛溶液浸泡固定血管段，常規(guī)乙醇脫水、石蠟包埋，制成6 μm厚切片、HE染色，光鏡下觀察動(dòng)脈內(nèi)膜及中膜的形態(tài)變化;造模成功的形態(tài)學(xué)標(biāo)志是肉眼觀動(dòng)脈壁有淡黃色斑點(diǎn)沉淀，表面凹凸不平，光鏡下有內(nèi)膜增厚、中膜平滑肌細(xì)胞增生。

1.5 血脂測(cè)定

參照試劑盒提供的方法，分別采用膽固醇氧化酶-過(guò)氧化物酶-4-氨基安替比林-酚法(CHOD-PAP法)、甘油磷酸氧化酶-過(guò)氧化物酶-4-氨基安替比林-酚法(GPO-PAP法)、聚乙烯硫酸沉淀法(PVS法)和磷鎢酸鎂沉淀法(PTA-Mg2+)檢測(cè)TC，TG，LDL和HDL水平。

1.6 血清ADMA含量檢測(cè)

按照我室已建立的高效液相色譜檢測(cè)血清ADMA濃度的方法［9］，取血清1 ml，加入5-磺基水楊酸沉淀蛋白，離心后取10 μl血清樣本或標(biāo)準(zhǔn)品加入100 μl衍生試劑(鄰苯二甲醛與硼酸緩沖液及β-巰基乙醇的混合物)，混勻，室溫下反應(yīng)3 min后進(jìn)樣，然后用線性梯度洗脫的方式將樣品從分析柱中洗脫。流動(dòng)相為4%乙腈和0.4%三氟乙酸;流速為0.2 ml·min-1。經(jīng)過(guò)柱處理后，用MS-2010質(zhì)譜儀對(duì)樣品及內(nèi)標(biāo)ADMA進(jìn)行測(cè)定(ADMA的質(zhì)荷比為203，氮?dú)饬魉贋?.0 L·min-1)。

1.7 AS模型血管轉(zhuǎn)染編碼人類DDAH2基因

采用本室［11］構(gòu)建的編碼人類DDAH2基因的重組腺病毒Ad5CMVh DDAH2和對(duì)照腺病毒——編碼β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-Gal)基因的重組腺病毒Ad5CMVβ-Gal(1.5×1013L-1)懸液在37℃下孵育AS家兔胸主動(dòng)脈環(huán)2 h，用PBS清洗后換成含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基在恒溫37℃的器官浴槽中繼續(xù)孵育24 h，并持續(xù)充以95%O2，5%CO2;孵育結(jié)束后血管環(huán)用于血管內(nèi)皮依賴性舒張功能和DDAH活性測(cè)定。

1.8 血管環(huán)內(nèi)皮依賴性舒張功能的檢測(cè)

按照我室已建立的離體血管環(huán)檢測(cè)內(nèi)皮依賴性舒張的方法［10］，取1.3中各組的家兔胸主動(dòng)脈環(huán)和1.7中轉(zhuǎn)染腺病毒的模型組胸主動(dòng)脈環(huán)，固定于盛有5 ml K-H緩沖液的器官浴槽中，并連接張力換能器;用MS-302生物信號(hào)記錄分析系統(tǒng)描記張力變化;浴槽恒溫37℃并持續(xù)充以95%O2和5%CO2的混合氣，每隔15 min更換槽中K-H液。實(shí)驗(yàn)時(shí)血管環(huán)加靜息張力6 g，平衡90 min;先用KCl 60 mmol·L-1使血管環(huán)平滑肌去極化，重復(fù)此過(guò)程至血管環(huán)收縮達(dá)坪值;沖洗后平衡血管環(huán)30 min，用苯腎上腺素0.1 μmol·L-1預(yù)收縮血管，待張力上升并穩(wěn)定后，加入0.03～3 μmol·L-1累積濃度的乙酰膽堿舒張血管，用等長(zhǎng)張力記錄法測(cè)定和計(jì)算各組血管環(huán)對(duì)乙酰膽堿誘導(dǎo)的最大舒張反應(yīng)(Emax)和半數(shù)有效量(EC50)。同時(shí)比較卡托普利治療和體外轉(zhuǎn)染DDAH2基因的AS血管環(huán)內(nèi)皮依賴性舒張功能。

1.9 血管DDAH活性的測(cè)定

按照本室已建立的DDAH活性測(cè)定方法來(lái)檢測(cè)各組血管環(huán)DDAH活性［12］。將胸主動(dòng)脈置試管中剪碎，加入冰的磷酸緩沖液(0.1 mol·L-1，pH 6.5)制成5%組織勻漿，4℃下1500×g離心30 min，取50 μl上清與ADMA 1 mmol·L-1反應(yīng)，并與二乙酰單肟和安替比林共孵育100 min;采用UV755B分光光度計(jì)讀取466 nm處吸光度值，計(jì)算L-胍氨酸的生成量;未加ADMA的反應(yīng)體系作為陰性對(duì)照，并從所測(cè)得的數(shù)據(jù)中減去每個(gè)樣品的陰性對(duì)照值以得出DDAH活性的實(shí)際數(shù)值;DDAH的酶活性單位定義為37℃下每分鐘催化形成1 μmol·L-1L-胍氨酸所需DDAH量，U·g-1蛋白表示;組織勻漿中的蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)試劑盒方法測(cè)定。

1.10 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，組間差異比較用方差分析和Newman-Keuls檢驗(yàn)，以P＜0.05認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 卡托普利治療對(duì)高脂飼養(yǎng)家兔血管壁病理形態(tài)的影響

肉眼觀察正常對(duì)照家兔胸主動(dòng)脈管壁呈紅色，內(nèi)膜光滑;而高脂、高膽固醇飼養(yǎng)致AS家兔胸主動(dòng)脈管壁為白色或黃色，管徑增粗，內(nèi)膜凹凸不平，有黃色脂樣物向管腔突出;卡托普利治療家兔胸主動(dòng)脈內(nèi)膜脂紋減少。光鏡下可見正常對(duì)照組血管壁各層無(wú)明顯改變(圖1A);而AS組管腔不規(guī)則，可見內(nèi)膜和中膜平滑肌細(xì)胞增生(圖1B);卡托普利治療組血管雖然可見中膜平滑肌細(xì)胞增生，但內(nèi)膜增厚不明顯，較AS組病變明顯減輕(圖1C)。

2.2 卡托普利治療對(duì)高脂飼養(yǎng)家兔血脂和血清ADMA水平的影響

如表1所示，與正常對(duì)照組相比，AS模型組血清TC，TG和LDL水平和ADMA濃度均明顯升高，而血清HDL含量則明顯降低(P＜0.01);卡托普利治療對(duì)高血脂水平無(wú)改善作用，但可顯著降低ADMA含量，并接近正常對(duì)照組水平。

Fig.1 Effect of captopril(Cap)on vascular pathological morphology of rabbits fed high-fat diet(HE×40).Control rabbits(A)were received a standard chow，and atherosclerostic(AS)rabbits(B)were fed a high fat diet，Cap treated group(C)was fed a high-fat diet plus Cap 8 mg·kg-1，once daily，for 12 weeks.

Tab.1 Effect of Cap on serum lipids and asymmetric dimethylarginine(ADMA)levels in AS rabbits

2.3 卡托普利治療對(duì)高脂飼養(yǎng)家兔血管組織DDAH活性的影響

如表2所示，高脂飼養(yǎng)兔胸主動(dòng)脈組織中DDAH活性明顯低于正常對(duì)照組(P＜0.01);經(jīng)卡托普利治療12周后可顯著減輕高脂飼養(yǎng)兔血管組織DDAH活性的抑制(P＜0.01)。

Tab.2 Effect of captopril on dimethylarginine dimethylaminohydrolase(DDAH)activity in AS rabbits

2.4 卡托普利治療對(duì)高脂飼養(yǎng)家兔血管內(nèi)皮依賴性舒張功能的影響

與正常對(duì)照組比較，高脂飼養(yǎng)兔離體胸主動(dòng)脈環(huán)對(duì)乙酰膽堿誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)明顯降低(圖2);正常對(duì)照組Emax和EC50分別為(94±4)%和(86±33)nmol·L-1，AS模型組Emax顯著降低為(56±8)%(P＜0.01)，EC50顯著升高為(158±52)nmol·L-1(P＜0.01)，提示血管內(nèi)皮功能損害。經(jīng)卡托普利治療12周后，Emax增加到(88±4)%，EC50降低至(90±35)nmol·L-1(P＜0.01)，說(shuō)明卡托普利能明顯改善高脂飼養(yǎng)兔血管內(nèi)皮依賴性舒張功能。

Fig.2 Effect of captopril on impaired endotheliumdependent relaxation of aortic rings from AS rabbits.See Fig.1 for the treatment.±s，n=5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group;##P＜0.01，compared with AS model group.

2.5 體外轉(zhuǎn)基因?qū)Ω咧曫B(yǎng)家兔血管內(nèi)皮功能損害和DDAH2活性抑制的影響

用滴度為1.5×1013L-1的重組腺病毒Ad5CMVhDDAH2感染高脂飼養(yǎng)家兔血管環(huán)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，體外轉(zhuǎn)染DDAH2基因可逆轉(zhuǎn)高脂血癥對(duì)內(nèi)皮依賴性血管舒張功能的抑制，使Emax回升至(88±4)%、EC50降低至(98±42)nmol·L-1，并接近正常對(duì)照組水平;而用相同滴度的重組腺病毒Ad5CMVβ-gal孵育高脂飼養(yǎng)兔血管環(huán)，卻不能改善其內(nèi)皮依賴性舒張功能的損害(圖3和表3)。

Fig.3 Effect of ex vivo DDAH2 gene transfection on impaired endothelium-dependent relaxation of aortic rings from AS rabbits.The thoracic aortic rings from AS rabbits were incubated with PBS(untransfection)，1.5×1013L-1of Ad5CMVhDDAH2(DDAH2-transfection)and control adenovirus Ad5CMVβ-gal(β-Galtransfection)at 37℃for 2 h，respectively，and then incubated with DMEM containing 10%newborn bovine serum for 24 h.±s，n=5.＊＊P＜0.01，compared with untransfecion group.

Tab.3 Effect of ex vivo DDAH2 gene transfection on Emax and EC50values for acetylcholine-induced relaxation of isolated aortic rings from AS rabbits

體外轉(zhuǎn)染DDAH2基因明顯增加高脂飼養(yǎng)家兔血管環(huán)組織DDAH活性，從未轉(zhuǎn)染組的(0.045±0.008)U·g-1蛋白升高至(0.112±0.017)U·g-1蛋白(P＜0.01);而轉(zhuǎn)染β-Gal基因?qū)ρ芙M織DDAH活性〔(0.046±0.006)U·g-1蛋白〕無(wú)明顯影響。以上結(jié)果表明，體外轉(zhuǎn)染DDAH2基因?qū)Ω咧曫B(yǎng)家兔血管內(nèi)皮依賴性舒張功能和DDAH活性的影響與卡托普利長(zhǎng)期治療作用相似，其改善程度亦與卡托普利治療效果相當(dāng)。

3 討論

本研究采用高脂、高膽固醇飼養(yǎng)家兔12周，經(jīng)血管病理形態(tài)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，血管腔內(nèi)有脂質(zhì)條紋沉積、血管平滑肌增生;血脂檢測(cè)顯示，血清TC，TG和低密度脂蛋白水平均升高，HDL水平減低;這些結(jié)果表明，高脂、高膽固醇飼養(yǎng)12周制備AS家兔模型成功。離體血管環(huán)內(nèi)皮功能檢測(cè)顯示，AS家兔胸主動(dòng)脈環(huán)對(duì)乙酰膽堿誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)明顯降低，表明血管內(nèi)皮功能損害。該結(jié)果與國(guó)內(nèi)外學(xué)者在多種AS動(dòng)物模型上獲得的類似實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致［7，13-14］;由此可見血管內(nèi)皮功能不全是促進(jìn)AS形成的重要因素。

本文作者和國(guó)內(nèi)外學(xué)者以前研究表明，高脂、高膽固醇飼養(yǎng)兔血清內(nèi)源性ADMA明顯升高，并與內(nèi)皮依賴性舒張功能障礙密切相關(guān)［3，6，15］;此外，還在動(dòng)物模型和臨床患者發(fā)現(xiàn)，易致AS的一些危險(xiǎn)因素如氧化型低密度脂蛋白、同型半胱氨酸也能導(dǎo)致ADMA水平升高并產(chǎn)生相似的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能損害［9，16］。本研究再次證明，實(shí)驗(yàn)性AS家兔血中內(nèi)源性ADMA水平較正常對(duì)照組顯著增高，并伴有離體胸主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)的明顯降低。這些研究表明，內(nèi)源性NOS抑制物ADMA蓄積是AS時(shí)內(nèi)皮功能不全的重要機(jī)制。

內(nèi)源性ADMA主要被廣泛存在于組織細(xì)胞中的DDAH代謝消除。因此，血管DDAH活性是決定內(nèi)皮細(xì)胞ADMA濃度的關(guān)鍵因素［3］。本研究發(fā)現(xiàn)，高脂飼養(yǎng)致AS家兔血管組織DDAH活性較正常對(duì)照組明顯降低，并伴有內(nèi)源性ADMA水平升高。本文作者和其他學(xué)者曾研究發(fā)現(xiàn)，用AS危險(xiǎn)因子如氧化型低密度脂蛋白或同型半胱氨酸直接注射動(dòng)物，均可降低血管壁DDAH活性，并升高內(nèi)源性ADMA水平［9，16］;DDAH基因過(guò)表達(dá)不僅能降低載脂蛋白E缺陷小鼠血清ADMA濃度，減輕血管壁動(dòng)脈粥樣斑塊形成［17］;還能對(duì)抗氧化型低密度脂蛋白的主要成分溶血性磷脂酰膽堿對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞DDAH活性的抑制和NO合成的損害［18］;這些研究都支持本研究結(jié)果，并證明DDAH活性降低是導(dǎo)致AS時(shí)內(nèi)源性ADMA升高的重要原因。

由以上研究可知，尋找保護(hù)血管組織DDAH活性、降低內(nèi)源性ADMA蓄積的藥物，對(duì)防治血管內(nèi)皮功能不全和AS形成具有重要意義。ACEI是目前臨床上治療包括AS在內(nèi)的許多心血管疾病的常用藥物，卡托普利是最早用于臨床而且至今仍被廣泛應(yīng)用的ACEI。近年研究表明，ACEI或卡托普利抗AS作用可能不依賴腎素-血管緊張素系統(tǒng)［19］，但有關(guān)ACEI或卡托普利抗AS的機(jī)制卻不十分清楚。本研究率先提供了卡托普利抗高脂飼養(yǎng)致AS家兔血管形態(tài)和功能損害是通過(guò)保護(hù)血管壁DDAH活性、減少內(nèi)源性ADMA蓄積所產(chǎn)生的，而不是通過(guò)影響血脂代謝所致的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。此外本研究還發(fā)現(xiàn)，卡托普利治療對(duì)高脂飼養(yǎng)兔血管內(nèi)皮依賴性舒張功能的保護(hù)作用與體外轉(zhuǎn)染DDAH2基因?qū)S家兔血管內(nèi)皮依賴性舒張功能損害的逆轉(zhuǎn)效果相當(dāng);表明卡托普利治療與血管壁DDAH過(guò)表達(dá)均可增加內(nèi)皮細(xì)胞合成、釋放NO。血管內(nèi)皮細(xì)胞合成釋放的NO已被廣泛認(rèn)為是一種內(nèi)源性抗AS分子，而內(nèi)源性NOS抑制物ADMA升高則被認(rèn)為是血管內(nèi)皮功能不全以及AS形成的生物標(biāo)志［3，5］。根據(jù)這些研究可以認(rèn)為，卡托普利增加血管壁DDAH活性，從而減少內(nèi)源性ADMA蓄積是其抗AS形成的重要機(jī)制。

雖然有關(guān)卡托普利保護(hù)高脂飼養(yǎng)家兔血管壁DDAH活性的進(jìn)一步機(jī)制尚未明了，但知卡托普利是一個(gè)含巰基的ACEI，除了減少血管緊張素Ⅱ生成以外，還有強(qiáng)大的抗氧化作用。也有研究報(bào)道，DDAH的活性及表達(dá)均可被氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)［20］。Napoli等［21］應(yīng)用含巰基的左芬普利治療高血壓患者，一方面明顯減少體內(nèi)氧化應(yīng)激，另一方面也顯著降低內(nèi)源性ADMA濃度;而使用不含巰基的依那普利治療則對(duì)ADMA水平無(wú)明顯影響。根據(jù)這些研究結(jié)果可推測(cè)，卡托普利保護(hù)高脂飼養(yǎng)兔血管壁DDAH活性可能是由于其抗氧化作用所致。但其確切分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，卡托普利可改善高脂血癥致AS家兔血管形態(tài)和功能的損害，其機(jī)制可能是通過(guò)其抗氧化作用上調(diào)DDAH活性，降低內(nèi)源性ADMA蓄積所致。本研究結(jié)果為闡明卡托普利抗AS機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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Protective effect and mechanism of captopril against endothelial dysfunction of thoracic aortas from atherosclerotic rabbits

XU Wen-juan1，2*，F(xiàn)ENG Mei1，2*，LIU Li-hua2，LU Chang-wu2，XIONG Yan1，2
(1.Department of Pharmacology，Research Institute of Snake Venom，Guangzhou Medical College，Guangzhou 510182，China;2.School of Pharmaceutical Sciences，Central South University，
Changsha410078，China)

OBJECTIVETo investigate the protective effects and mechanisms of captopril against vascular endothelial dysfunction and morphologic damage in atherosclerotic(AS)rabbits.METHODSThe rabbits were fed a high-cholesterol and high-fat diets to induce AS，and at the same time treated with captopril(po 8 mg·kg-1)once daily for 12 week.The morphologic changes of thoracic aortas were observed by HE staining.Serum levels of total cholesterol(TC)，triglycerides(TG)，low-density lipoprotein(LDL)and high-density lipoprotein(HDL)were determined.Serum levels of asymmetric dimethylarginine(ADMA)were assayed by high-pressure liquid chromatography.Recombinant human dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2(DDAH2)gene adenoviruses(Ad5CMVhDDAH2)were ex vivo transferred to thoracic aortic rings from atherosclerotic rabbits for 2 h.Endothelium-dependent maximal relaxation of aortic ring response to accumulative concentrations of acetylcholine(Emax)，concentration for 50%of maximal effect(EC50)and vascular DDAH activity were measured 24 h after transfection，respectively.RESULTSCompared with normal control group，the intima and media of thoracic aortas were thickened and serum lipid profiles including TC，TG and LDL were obviously increased in rabbits fed high-fat diet.Serum ADMA levels were increased to(2.24±0.28)μmol·L-1(P＜0.01)and vascular DDAH activity was inhibited to(0.048±0.007)U·g-1protein(P＜0.01);Emaxwas decreased to(56±8)%(P＜0.01)and EC50was increased to(158±52)nmol·L-1(P＜0.01).Treatment with captopril not only decreased vascular intima thickening and serum ADMA level to(1.37±0.23)μmol·L-1(P＜0.01)，but also increased vascular DDAH activity to(0.084±0.013)U·g-1protein(P＜0.01)，Emaxincreased to(88±4)%(P＜0.01)and EC50decreased to(90±35)nmol·L-1(P＜0.01)without influence on serum lipid profiles.The similar results of Emax(88±4)%，EC50(98±42)nmol·L-1and DDAH activity(0.112±0.017)U·g-1protein could also be observed when human DDAH2 gene was ex vivo transferred to isolated aortas from AS rabbits.CONCLUSIONCaptopril can protect against the injuries of vascular morphology and endothelial function in high-fat diet-induced AS rabbits，and the mechanisms may be involved in increase in DDAH activity and decrease in endogenous ADMA accumulation in vascular endothelium.

atherosclerosis;endothelial dysfunction;captopril;asymmetric dimethylarginine;dimethylarginine dimethylaminohydrolase

The project supported by National Natural Science Foundation of China(81170778);and National Natural Science Foundation of China(30873062)

XIONG Yan，E-mail:Xiongyan2001@yahoo.com

R972

A

1000-3002(2012)06-0816-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.06.007

國(guó)家自然科學(xué)基金(81170778);國(guó)家自然科學(xué)基金(30873062)

徐文娟(1986-)，女，碩士研究生;熊燕(1960-)，女，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事心血管疾病和糖尿病心血管并發(fā)癥研究。

熊燕，E-mail:xiongyan2001@yahoo.com

*共同第一作者

*Jiont-first authors

2012-02-01接受日期:2012-04-19)

(本文編輯:喬虹)