preS1-preS2-HBsAg真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在293細(xì)胞中的表達(dá)

牛明福，吉萍，武漢良，邵勇，高麗華，胡顯文

(1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽471003;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，北京100071)

preS1-preS2-HBsAg真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在293細(xì)胞中的表達(dá)

牛明福1*，吉萍1，2*，武漢良1，邵勇2，高麗華2，胡顯文2

(1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽471003;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，北京100071)

目的研究含有前S1抗原、前S2抗原的乙肝病毒外膜蛋白(前S1蛋白+前S2蛋白+S蛋白)的跨膜特性。方法依據(jù)乙肝病毒大外膜蛋白的計(jì)算機(jī)模擬圖將其分為分別命名為HBsAg1(1-174)，HBsAg2(1-245)，HBsAg3(1-294)，HBsAg4(1-341)，HBsAg5(1-373)，HBsAg6(1-400)，最終累加成一條連續(xù)的長鏈狀態(tài)，貫穿在細(xì)胞內(nèi)外形成四次跨膜區(qū)，并以此6個片段為模板設(shè)計(jì)6對引物。從含有乙肝病毒外膜蛋白基因的質(zhì)粒pcDNA3.1-preS1-preS2-HBsAg中擴(kuò)增出前S1，S2基因，采用重疊延伸PCR方法連接人尿激酶原信號肽+6×組氨酸(His)+前S1蛋白、前S2蛋白+HBsAg(1～6)+血細(xì)胞凝集素(HA);PCR產(chǎn)物經(jīng)XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切后插入經(jīng)同樣處理的真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP，構(gòu)建含有Pro-UK，6×His，preS1，preS2，HBsAg跨膜序列及HA的表達(dá)載體pIRES2-EGFP/Pro-UK-6×His-preS1-preS2-HBsAg(1～6)-HA，該表達(dá)載體應(yīng)能夠共表達(dá)乙肝病毒外膜蛋白和綠色熒光蛋白。采用陽離子脂質(zhì)體法將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，經(jīng)G418加壓篩選陽性克隆，并進(jìn)一步通過熒光觀察、蛋白質(zhì)免疫印跡、免疫雙標(biāo)等方法檢測目的蛋白在293細(xì)胞的表達(dá)。結(jié)果PCR結(jié)果顯示，電泳片段大小符合HBsAg1～HBsAg6片段的600，810，957，1098，1194和1275 bp理論值。酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒測序結(jié)果與預(yù)期序列完全一致。轉(zhuǎn)染和單克隆篩選后得到轉(zhuǎn)染成功的HBsAg1～HBsAg6的293細(xì)胞，呈亮綠色，細(xì)胞形態(tài)良好，熒光表達(dá)強(qiáng)度高;Western印跡結(jié)果顯示，在相對分子質(zhì)量31 000，34 000，44 000，47000，54 000和60 000處有明顯的階梯狀蛋白信號，條帶清晰并與理論值相一致。結(jié)論成功構(gòu)建了含有前S1、前S2蛋白的乙肝外膜蛋白基因的真核表達(dá)載體，并獲得了能共表達(dá)乙肝外膜蛋白跨膜序列和綠色熒光蛋白的293細(xì)胞系。

真核表達(dá)載體，pIRES2-EGFP;乙肝外膜蛋白;293細(xì)胞

我國是乙型肝炎感染的高發(fā)區(qū)，母嬰傳播和嬰幼兒感染形成耐受性是我國乙型肝炎病毒(HBV)感染的流行和發(fā)病的特點(diǎn)之一。HBV主要以一種尚未明確的機(jī)制感染肝細(xì)胞。接種乙肝疫苗是控制乙型肝炎傳播最為直接和最為有效的措施［1-2］。在HBV感染期間，肝細(xì)胞大量分泌20 nm的外膜主蛋白顆粒，由細(xì)胞系或酵母產(chǎn)生的同樣顆粒就是有效預(yù)防病毒感染的疫苗［3］。乙肝疫苗經(jīng)歷了乙肝病毒外膜主蛋白(s蛋白，HBsAg)重組疫苗;乙肝病毒外膜主蛋白、中蛋白(前S2蛋白+S蛋白)及大蛋白(前S1蛋白+前S2蛋白+S蛋白)重組疫苗和乙肝DNA疫苗等幾個階段。這些疫苗有效地降低了HBV母嬰傳播的發(fā)生率，但在人體保護(hù)率、抗體應(yīng)答水平及免疫持久性等方面還存在一定的問題。因此，尋找免疫原性更強(qiáng)的HBV疫苗就成為了主要研究方向。

HBV的外膜由開放讀碼框S基因(S-ORF，核苷酸nt2854-0-832)編碼合成，包括3種外膜成分:大蛋白(L)，中蛋白(M)和主蛋白(S)，它們由1個開放讀碼框編碼，分別使用3個起始密碼子和1個共同的終止密碼子。外膜蛋白主要是主蛋白HB-sAg，由226個氨基酸組成，是攜帶全部抗原反應(yīng)性的結(jié)構(gòu)蛋白。M是在S的氨基端擴(kuò)加55個氨基酸(前S2蛋白)，前S2蛋白在外膜三種蛋白成分中的免疫原性最強(qiáng);L是在M前再擴(kuò)加108～119個氨基酸(前S1蛋白)。病毒附著于肝細(xì)胞，最重要的介導(dǎo)部位就是前S1蛋白的氨基端21～47肽段，前S1/AA21～47區(qū)段比較保守，只要這一段完整，變異的病毒就具有傳染性［4］。目前，提高疫苗免疫原性的主要策略是在構(gòu)建HBV主蛋白疫苗的基礎(chǔ)上加入其他蛋白成分，如前S1蛋白、前S2蛋白以及C蛋白等［5-6］。

本研究根據(jù)外膜蛋白的跨膜特性，將大外膜蛋白人為地分為6段，設(shè)計(jì)了6對引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，分別使擴(kuò)增產(chǎn)物在前S1、前S2編碼區(qū)的5'端加入尿激酶原的信號肽序列，并加入了組氨酸(His)標(biāo)簽和血細(xì)胞凝集素(HA)標(biāo)簽的編碼序列。這6段擴(kuò)增產(chǎn)物含有跨膜區(qū)的編碼序列。由于HBV前S1的氨基端錨定于細(xì)胞膜上，本研究設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不含有前S1蛋白氨基端前11個氨基酸的編碼區(qū)。構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)染人腎上皮293細(xì)胞，通過綠色熒光染色，Western印跡及激光共聚焦等方法檢測蛋白在細(xì)胞內(nèi)外的表達(dá)情況［7-9］。

1 材料與方法

1.1 載體、菌株和細(xì)胞系

含乙肝病毒外膜前S1、前S2和主蛋白基因序列的pcDNA3.1載體及293細(xì)胞株均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所保存，真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP、大腸桿菌Trans10 Chemically Competent Cell購自全式金生物技術(shù)有限公司，引物由華大基因有限公司合成。

1.2 試劑

高保真Pyrobest聚合酶、T4 DNA連接酶及T4 DNA聚合酶購自大連寶生物生物工程有限公司;限制性內(nèi)切酶XhoⅠ，EcoRⅠ購自NEB公司;DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取、DNA產(chǎn)物純化試劑盒購自Tiangen公司;Lipofectamine 2000和G418購自Sigma公司;山羊抗人IgG-HRP抗體、Hoechst33342熒光抗體、CF555驢抗鼠IgG抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;LB培養(yǎng)基各組分購自O(shè)xoid公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)條件

細(xì)胞培養(yǎng)基為含有5%加強(qiáng)型小牛血清的DF完全培養(yǎng)基，于含5%CO2的37℃溫箱進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)［3，10］。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［11］及計(jì)算機(jī)模擬，設(shè)計(jì)合成6段HBV表面抗原跨膜基因，使表達(dá)產(chǎn)物含有四次跨膜區(qū)。設(shè)計(jì)思路見圖1。以含乙肝病毒外膜前S1、前S2和主蛋白基因序列的pcDNA3.1載體為模板，對已設(shè)計(jì)的6段乙肝病毒外膜基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所有上游引物均相同，同時(shí)為了克隆方便，在上游加入酶切位點(diǎn)XhoⅠ，下游加入酶切位點(diǎn)EcoRⅠ。引物序列見表1。引物合成由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

Fig.1 Designed six fragments of HBV surface antigen for transmembrane.A:computer simulation schematic diagram of HBSAg transmembrane.B:the six fragments of HBV surface antigen base on the HBSAg transmembrane schematic diagram.

Tab.1 Primers used PCR procedure

1.5 Pro-UK-6×His-preS1-preS2-HBsAg-HA基因擴(kuò)增

PCR反應(yīng)總體系為50 μl，其中含有10 μl 5×Pyrobest緩沖液、5 μl dNTPs 2.5 mmol·L-1、1 U Pyrobest聚合酶、2 μl 10 μmol·L-1上、下游引物、2 μl模板DNA。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性2 min;95℃，20 s，60℃，20 s，72℃90 s，30個循環(huán);72℃，5 min，4℃保存試。1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，經(jīng)PCR產(chǎn)物回收劑盒純化目的基因，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 重組載體pIRES2-EGFP/Pro-UK-6×HispreS1-preS2-HBsAg-HA的構(gòu)建及酶切鑒定

用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切上述PCR回收目的產(chǎn)物，純化HBsAg1～HBsAg6各基因片段，將雙酶切后的目的基因與同樣處理的質(zhì)粒pIRES2-EGFP按照摩爾比3∶1混合，室溫孵育30 min，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans10，菌液涂布于含卡那霉素(100 mg·L-1)的LB固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)12～16 h，從平板上分別挑取單個克隆加入6 ml含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃200 r·min-1搖床培養(yǎng)12 h后用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，篩選插入目的條帶正確的陽性質(zhì)粒送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果用DNAman軟件進(jìn)行比對以驗(yàn)證目的片段序列的正確性，最終構(gòu)建的表達(dá)載體如圖2。

Fig.2 pIRES2-EGFP dicistronic expression vector with Pro-UK-6×His-preS1-preS2-HBsAg(1～6)-HA gene sequence.

1.7 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞及陽性克隆的初步篩選

將構(gòu)建好的pIRES2-EGFP/Pro-UK-6×HispreS1-preS2-HBsAg(1～6)-HA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，按照Lipofectamine 2000陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行:取測序正確的質(zhì)粒1μg進(jìn)行轉(zhuǎn)染，用G418(500 mg·L-1)加壓篩選，培養(yǎng)約2周，待細(xì)胞形成明顯單克隆后，熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染成功的克隆細(xì)胞形態(tài)良好，并均勻分布發(fā)綠色熒光，未轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞不發(fā)綠色熒光，挑取陽性單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.8 Western blotting鑒定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的293細(xì)胞陽性克隆

為了進(jìn)一步明確pIRES2-EGFP/Pro-UK-6×HispreS1-preS2-HBsAg(1～6)-HA在293細(xì)胞內(nèi)的獲得表達(dá)，將綠色熒光陽性的細(xì)胞裂解，裂解液稀釋100倍后做SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用5%脫脂奶粉于4℃封閉過夜，一抗用鼠抗HA抗體37℃輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，二抗用HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體37℃輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，用化學(xué)發(fā)光法顯色5 min，壓片顯影，具體操作參照Ida等［12］的方法。將陽性克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后凍存?zhèn)溆茫?3-14］。

1.9 細(xì)胞免疫雙標(biāo)法檢測細(xì)胞膜蛋白及定位

用免疫雙標(biāo)法對膜蛋白進(jìn)行精確定位。將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞稀釋為密度1×108L-1接入激光共聚焦專用培養(yǎng)皿中，有血清DF培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，觀察皿內(nèi)生長狀態(tài)良好的單層或是單個細(xì)胞，用20 g·L-1甲醇固定細(xì)胞10 min，冰冷的1×PBS清洗，6%BSA 37℃封閉1 h后，冷PBS清洗2次，用1%BSA稀釋一抗HRP標(biāo)記的鼠抗HA抗體，37℃孵育1 h后，冷PBS清洗3次，每次5 min，加入二抗CF-555驢抗鼠IgG紅色熒光標(biāo)記，37℃孵育1 h后，冷PBS清洗3次，每次5 min，充分洗滌后加入Hoechst33342藍(lán)色熒光標(biāo)記染細(xì)胞核15 min，冷PBS清洗3次，每次5 min，用空293細(xì)胞作為陰性對照，熒光顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 Pro-UK-6×His-preS1-preS2-HBsAg(1～6)-HA基因的擴(kuò)增

HBsAg1～6的PCR結(jié)果如圖3，HBsAg1～6片段的理論值分別為600，810，957，1098，1194和1275 bp，每條帶之間差別較小，電泳片段大小符合理論值，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，含有前S1、前S2蛋白的HBsAg(1～6)共六段真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2 重組載體pIRES2-EGFP/Pro-UK-6×HispreS1-preS2-HBsAg(1～6)-HA酶切鑒定和測序鑒定

重組質(zhì)粒用XhoⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖4。可見質(zhì)粒大片段條帶和各大小不同的目的基因片段條帶，此驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了含有前S1、前S2蛋白的HBsAg(1～6)共6段真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒樣品送至北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序鑒定，測序結(jié)果與預(yù)期序列完全一致(測序結(jié)果略)。

Fig.3 Products of HBsAg1－HBsAg6 observed by PCR.M:DNA marker DL4500;lanes 1-6:HBsAg1-HBsAg6.

Fig.4 Double enzyme digestion products of the recombinant plasmids observed by PCR.M:DNA marker DL4500;lanes 1-6:pIRES2-EGFP-pres1-pres2-HBsAg(1-6)-HA.

2.3 重組載體質(zhì)粒在293細(xì)胞中的表達(dá)

熒光顯微鏡下(圖5)可見經(jīng)轉(zhuǎn)染和單克隆篩選后得到轉(zhuǎn)染成功的HBsAg1～6的293細(xì)胞，呈亮綠色，細(xì)胞形態(tài)良好，熒光表達(dá)強(qiáng)度高;沒有轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞經(jīng)G418加壓篩選期間部分死亡，小部分不發(fā)熒光。經(jīng)Western印跡進(jìn)一步驗(yàn)證(圖6)，蛋白在細(xì)胞上均有特異性表達(dá)，在預(yù)期大小相對分子質(zhì)量(Mr)31 000，34 000，44 000，47 000，54 000和60 000處有明顯的階梯狀蛋白信號，條帶清晰并與理論值相一致。

2.4 重組載體質(zhì)粒在293細(xì)胞膜蛋白的定位

基因HBsAg1～HBsAg6六個片段相互銜接構(gòu)成基因全長，各片段之間累加形成一條長鏈貫穿于細(xì)胞膜內(nèi)外，故選取基因全長HBsAg6片段為例，觀察構(gòu)建成功的長鏈細(xì)胞外膜蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位，圖7A中可看到外膜蛋白有清晰的表達(dá)，正常293細(xì)胞為陰性對照(圖7B)。

Fig.5 Transfection of recombinant plasmids to 293 cells under fluorescent microscope(×40).A-F:HBsAg1-HBsAg6.

Fig.7 Transfection of HBsAg1－HBsAg6 to 293 cells observed by Western blotting.M:marker;lanes 1-6:HBsAg1-HBsAg6.

Fig.7Transfection of pIRES2-EGFP/Pro-UK-6*His-preS1-preS2-HBs6Ag-HA to 293 cells under confocal laser microscope(×1000).A:transfected 293 cells;B:normal 293 cell.

3 討論

乙肝病毒的外膜蛋白在病毒顆粒分泌、附著及入侵新細(xì)胞中具有重要的介導(dǎo)作用，而且3種外膜蛋白均有較多的抗原表位。因此，構(gòu)建同時(shí)含有preS1和preS2的蛋白可以更好地誘導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答。

Neurath等［15］報(bào)道的觀察結(jié)果如下:一個短的包含前S1區(qū)第21位至第47位氨基酸(對應(yīng)于基因型D，E，G的第10位至第36位氨基酸)的表面蛋白片段與HepG2細(xì)胞結(jié)合，并最終完成乙肝病毒與這些細(xì)胞的結(jié)合。前S1區(qū)包含主要的細(xì)胞黏附抗原表位，也有報(bào)道在前S1區(qū)外也有抗原表位，它們也參與乙肝病毒-細(xì)胞黏附過程。此外，識別前S2區(qū)或S區(qū)內(nèi)抗原表位的抗體對感染具有抑制作用［16］。但是，這些抗體是通過直接遮蓋乙肝病毒-細(xì)胞黏附的重要序列發(fā)揮作用，還是它們的結(jié)合可發(fā)揮間隔物作用，從而阻礙病毒和細(xì)胞表面之間的緊密接觸，目前還不清楚。

本研究從含有乙肝外膜蛋白基因的質(zhì)粒中擴(kuò)增出S1和S2，與pIRES2-EGFP載體進(jìn)行酶切連接，構(gòu)建了能共表達(dá)乙肝前S1抗原、S2抗原、HBsAg和EGFP的真核表達(dá)載體。研究表明，乙肝表面抗原有3～4次跨膜特性，且前S1抗原、S2抗原參與前兩次跨膜，與文獻(xiàn)的報(bào)道一致［17-19］。

與目前我國使用的重組人S抗原的酵母/CHO基因工程疫苗相比，本共表達(dá)蛋白加入了S1抗原和S2抗原，可以提高其免疫原性，彌補(bǔ)了目前乙肝疫苗存在的抗體應(yīng)答水平和人群免疫保護(hù)率低下等不足。這為研究乙肝病毒與細(xì)胞的相互作用提供了依據(jù)，也為研究比較各段跨膜蛋白及HBsAg的抗原性，為下一步設(shè)計(jì)在哺乳動物細(xì)胞中分泌性表達(dá)含有前S1抗原和S2抗原的更有效的乙肝疫苗奠定了基礎(chǔ)。

［1］Maddrey WC.Hepatitis B:an important public health issue［J］.J Med Virol，2000，61(3):362-366.

［2］Gripon P，Rumin S，Urban S，Le Seyec J，Glaise D，Cannie I，et al.Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(24):15655-15660.

［3］Prange R，Mangold CM，Hilfrich R，Streeck RE.Mutational analysis of HBsAg assembly［J］.Intervirology，1995，38(1-2):16-23.

［4］Bruss V，Gerhardt E，Vieluf K，Wunderlich G.Functions of the large hepatitis B virus surface protein in viral particle morphogenesis［J］.Intervirology，1996，39(1-2):23-31.

［5］Lok AS.Hepatitis B infection:pathogenesis and management［J］.J Hepatol，2000，32(1 Suppl):89-97.

［6］Hu XW，Chen HP，Tang ZM，Ma QJ.The present and the future of biopharmaceuticals(2):trends and prospects［J］.China Biotechnol(中國生物工程雜志)，2005，25(1):86-93.

［7］Wang JH，Zhu ZM.Immunoperoxidasedetect membrane glycoprotein with a semi-dry blotting［J］.Prog Biochem Biophys(生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展)，1993，20(5):393-395.

［8］Liu KG，Xu GZ，Yao Y，Wu W，Li YJ，Ren TT，et al.Expression and significance of CEACAM1 and HBx in HBV related hepatocellular carcinoma［J］.Chin J Cell Mol Immunol(細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志)，2012，28(4):410-412.

［9］Gong XL，Sun Z，Zhang JL，Zhang JQ.The study of subcellular localization about HBV large protein and Homo sapiens pancreatic CDK5RAP3 protein using confocal fluorescence microscope［J］.J Xinjiang Med Univ(新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào))，2011，34(6):573-576.

［10］De Meyer S，Gong ZJ，Suwandhi W，van Pelt J，Soumillion A，Yap SH.Organ and species specificity of hepatitis B virus(HBV)infection:a review of literature with a special reference to preferential attachment of HBV to human hepatocytes［J］.J Viral Hepat，1997，4(3):145-153.

［11］Xu Z，Bruss V，Yen TS.Formation of intracellular particles by hepatitis B virus large surface protein［J］.J Virol，1997，71(7):5487-5494.

［12］Ida N，Hartmann T，Pantel J，Schr?der J，Zerfass R，F(xiàn)?rstl H，et al.Analysis of heterogeneous A4 peptides in human cerebrospinal fluid and blood by a newly developed sensitive Western blot assay［J］.J Biol Chem，1996，271(37):22908-22914.

［13］Hartung T，Balls M，Bardouille C，Blanck O，Coecke S，Gstraunthaler G，et al.Good cell culture practice.ECVAM good cell culture practice task force report 1［J］.Altern Lab Anim，2002，30(4):407-414.

［14］Huang PT.Translate.Spector DL，Goldman RD，Leinwand LA，ed.Cells:A Laboratory Manual(細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南)［M］∥Beijing:Science Press，2001:10-13.

［15］Neurath AR，Kent SB，Strick N，Parker K.Identification and chemical synthesis of a host cell receptor binding site on hepatitis B virus［J］.Cell，1986，46(3):429-436.

［16］Petersen J，Dandri M，Mier W，Lütgehetmann M，Volz T，von Weizs?cker F，et al.Prevention of hepatitis B virus infection in vivo by entry inhibitors derived from the large envelope protein［J］.Nat Biotechnol，2008，26(3):335-341.

［17］Eble BE，MacRae DR，Lingappa VR，Ganem D.Multiple topogenic sequences determine the transmembrane orientation of the hepatitis B surface antigen［J］.Mol Cell Biol，1987，7(10):3591-3601.

［18］Short JM，Chen S，Roseman AM，Butler PJ，Crowther RA.Structure of hepatitis B surface antigen from subviral tubes determined by electron cryomicroscopy［J］.J Mol Biol，2009，390(1):135-141.

［19］Fernholz D，Galle PR，Stemler M，Brunetto M，Bonino F，Will H.Infectious hepatitis B virus variant defective in pre-S2 protein expression in a chronic carrier［J］.Virology，1993，194(1):137-148.

Construction of preS1-preS2-HBsAg of eukaryotic expression vector and its transmembrane property in 293 cells

NIU Ming-fu1*，JI Ping1，2*，WU Han-liang1，SHAO Yong2，GAO Li-hua2，HU Xia-men2
(1.College of Food and Bioengineering，Henan University of Science and Technology，Luoyang471003，China;2.Institute of Biotechnology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing100071，China)

OBJECTIVETo study the transmembrane properties of preS1-preS2-HBsAg of hepatitis B virus.METHODSDevided the large envelope protein(L protein)into six fragments according to its computer simulation structure model to design six pairs of primers(named HBsAg1-6).Final accumulation into a continuous length of chain which could form the four transmembrane domain in the cells inside and outside.The preS1 and preS2 fragments were amplified from the plasmid pcDNA3.1-preS1-preS2-HBsAg.And we linked pro-urokinase signal peptide(pro-UK)with 6×histidine(6×His)，HBsAg(1-6)and hemagglutinin(HA)by overlapping extension PCR method.The PCR products were double digested with XhoⅠand EcoRⅠand cloned into the expression vector pIRES2-EGFP.The constructed expression vectors were pIRES2-EGFP/Pro-UK-6×HispreS1-preS2-HBsAg(1-6)-HA，and they could coexpress preS1-preS2-HBsAg(1-6)，GFP and HA theoretically.The vectors were transfected into 293 cells respectively using Lipofectamine method.The positive clones were screened by G418 pressure.The expression of preS1-preS2-HBsAg(1-6)was detected using fluorescence observation，Western blotting and immune double labeling method indirectly.RESULTSPCR results showed that，the size of electrophoresis fragment in line with the theoretical value of HBsAg 1-HBsAg 6 fragments which are 600，810，957，1098，1194 and 1275 bp.The restriction endonuclease digestion of recombinant plasmid sequencing results was entirely consistent with the expected sequence.Get 293 cells which were successfully transferred of HBsAg 1-HBsAg 6 after transfection and monoclonal antibody screening.The cells were bright green，in good shape，and with high fluorescence expression intensity.Western blotting results showed that，there was ladder-like protein signaling on relative molecular mass of 31 000，34 000，44 000，47 000，54 000 and 60 000.Clear bands were consistent with the theoretical value.CONCLUSIONEukaryotic expression vectors are successfully constructed，the vectors contain Pro-UK，6×His，preS1，preS2，HBsAg(1-6)and HA genes.And the 293 cell lines which could coexpress HBsAg(1-6)，GFP and HA proteins are obtained.

eukaryotic expression vector;pIRES2-EGFP;hepatitis B virus membrane protein;293 cell

The project supported by National High Technology Research and Development Program(863 Program)(81201)

HU Xian-wen，E-mail:huxianwen@163.com，Tel:(010)66948820

R966

A

1000-3002(2012)06-0810-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.06.006

*Jiont-first authors

2012-01-09接受日期:2012-04-09)

(本文編輯:喬虹)