應(yīng)用脂肪干細(xì)胞構(gòu)建組織工程化小口徑血管平滑肌層的實(shí)驗(yàn)研究

王琛 郭芳芳 張昀 鞏倫禮 崔磊

應(yīng)用脂肪干細(xì)胞構(gòu)建組織工程化小口徑血管平滑肌層的實(shí)驗(yàn)研究

王琛 郭芳芳 張昀 鞏倫禮 崔磊

目的 探索利用脂肪干細(xì)胞在生物反應(yīng)器內(nèi)構(gòu)建組織工程血管平滑肌層的可行性。方法 用抽吸的脂肪獲取脂肪干細(xì)胞，在生長(zhǎng)因子TGF-β1和BMP4作用下誘導(dǎo)成平滑肌細(xì)胞，然后將誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞接種于PGA上，將細(xì)胞-材料復(fù)合物置于生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，在模擬胚胎發(fā)育血流動(dòng)力學(xué)的刺激下（搏動(dòng)頻率：75次/分；擴(kuò)展量<5%），構(gòu)建小口徑的血管平滑肌組織。培養(yǎng)8周后，取材行組織學(xué)和生物力學(xué)檢測(cè)并與正常血管對(duì)比。結(jié)果 脂肪干細(xì)胞在TGF-β1和BMP4的誘導(dǎo)下，細(xì)胞呈現(xiàn)平滑肌細(xì)胞特有的“波峰-波谷”樣生長(zhǎng)特點(diǎn)，并表達(dá)平滑肌細(xì)胞的特異性標(biāo)記物α-SMA、SM22α、calponin和SM-MHC；反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)8周后，構(gòu)建的管狀組織膠原分泌旺盛，具有一定的力學(xué)強(qiáng)度和彈性。結(jié)論 利用脂肪干細(xì)胞可在體外生物反應(yīng)器內(nèi)構(gòu)建組織工程化小口徑血管平滑肌層，為臨床上小血管病變的修復(fù)提供了一種新的可能的途徑。

聚羥基乙酸 脂肪干細(xì)胞 平滑肌細(xì)胞 血管組織工程 生物反應(yīng)器

血管組織的缺損是臨床上常見的外科疾病之一。目前臨床上大多采用自體移植、異體移植以及人工合成替代品移植技術(shù)來修復(fù)這些缺損，但這些方法各有其缺點(diǎn)，很難滿足臨床上血管缺損修復(fù)的需要[1-2]。組織工程學(xué)的產(chǎn)生為血管病變的修復(fù)提供了新的途徑。脂肪干細(xì)胞（Adipose derived stem cell，ADSCs）來源廣泛，取材方便，對(duì)供體損傷小，體外增殖能力強(qiáng)，不受年齡影響[3-4]，有望作為構(gòu)建組織工程血管的種子細(xì)胞。同時(shí)，我們的前期實(shí)驗(yàn)也證明，在應(yīng)用能模擬體內(nèi)血流循環(huán)、血管搏動(dòng)的裝置（血管生物反應(yīng)器）的作用下，可以產(chǎn)生具有一定力學(xué)強(qiáng)度的組織工程化血管平滑肌層[5-6]。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用hADSCs作為種子細(xì)胞，在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β1）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白 4（BMP4）的作用下，向平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化，并應(yīng)用生物反應(yīng)器在體外構(gòu)建組織工程化血管組織。

1 材料和方法

1.1 hADSC的分離、培養(yǎng)

脂肪組織來源于我科脂肪抽吸術(shù)患者，均為女性，平均年齡30歲。根據(jù)Zuk等[7]的方法進(jìn)行，即：無菌PBS沖洗脂肪，用0.075%Ⅰ型膠原酶（Sigma-Aldrich公司）在37℃搖床中消化60 min后，加同體積含10%FBS（Gibco公司）的低糖DMEM培養(yǎng)液終止消化，1 200 g離心10 min，小心吸除上層脂肪油層和大部分上清，50 μm濾網(wǎng)過濾離心成分，再以600 g離心10 min，去除上清，用含10%FBS的LGDMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，以4.0×104cells/cm2接種于10 cm培養(yǎng)皿，24 h后去除非貼壁細(xì)胞，之后每隔3天換液，細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)，常規(guī)傳代，第4～6代的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 hADSC向平滑肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

當(dāng)hADSCs達(dá)50%～60%融合時(shí)，分組加入不同的培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)觀察：①LG-DMEM+10%FBS（正常培養(yǎng)液）；②LG-DMEM+1%FBS；③LG-DMEM+1%FBS+5 ng/mL TGF-β1； ④LG-DMEM+1%FBS+2.5 ng/mL BMP4；⑤LG-DMEM+1%FBS+2.5 ng/mL BMP4+5 ng/mL TGF-β1。人臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（hUASMCs）作為陽性對(duì)照。每2天換液一次，共誘導(dǎo)7 d。

1.3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的檢測(cè)

將不同培養(yǎng)液中的細(xì)胞分 1 d、3 d、5 d、7 d和10 d五個(gè)時(shí)間點(diǎn)以DNA定量的方法進(jìn)行計(jì)數(shù)。即以0.5 mg/mL的蛋白酶K溶解消化細(xì)胞，每孔0.5 mL，56℃過夜。1 200 r/min離心，洗去40 μL上清與160 μL Hoechst33258染液混合，移入黑色平底96孔板中，避光37℃孵化20 min，以全波段酶標(biāo)儀檢測(cè)360 nm熒光強(qiáng)度（激發(fā)光波長(zhǎng)465 nm）。并以相同方法檢測(cè)確定細(xì)胞數(shù)的DNA的360 nm熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)熒光值得出所測(cè)樣本的細(xì)胞數(shù)。

1.4 免疫熒光檢測(cè)

乙醇∶冰醋酸（99∶1）固定細(xì)胞或組織切片 15 min，PBS漂洗；10%羊血清封閉30 min；加適當(dāng)稀釋的一抗：鼠單克隆抗 α-SMA（Sigma-Aldrich 公司）、SMMHC（Sigma-Aldrich公司），兔多克隆抗 SM22α（Abcam公司）和兔單克隆抗calponin（Abcam公司），4℃過夜；PBS漂洗，滴加FITC標(biāo)記的相應(yīng)二抗，37 ℃孵育 45 min，PBS 漂洗；碘化丙啶（PI）襯核后，熒光顯微鏡下觀察。以臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞為陽性對(duì)照。

1.5 RT-PCR檢測(cè)

用Trizol提取不同條件下誘導(dǎo)7 d的細(xì)胞內(nèi)總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)平滑肌特異性標(biāo)記物α-SMA、SM22α、calponin和SMMHC的表達(dá)，反應(yīng)條件：95℃3 min變性，95℃30 sec，56℃30 sec，72℃60 sec，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸 10 min。引物序列如表1。

表1 RT-PCR反應(yīng)引物序列Table 1 Primers for RT-PCR

1.6 Western-Blotting檢測(cè)

用細(xì)胞裂解緩沖液裂解細(xì)胞或組織，獲取蛋白，將蛋白與2×上樣緩沖液混合后，SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將印跡后的PVDF膜用甲醇浸泡，加入封閉液（5%BSA，TBST），4℃封閉過夜。各一抗和β-actin加入膜上，4℃過夜，吸去一抗，加入IRDye 700DX或IRDye 800CW標(biāo)記的二抗，以O(shè)dyssey紅外圖像成像系統(tǒng)掃描成像，β-actin的表達(dá)作為各組細(xì)胞的內(nèi)參。

1.7 PGA膜片制備及細(xì)胞-PGA復(fù)合物體外培養(yǎng)

將50 mg未編織的PGA纖維制作成55 mm×45 mm×2 mm大小的膜片，75%乙醇浸泡1 h，紫外線照射30 min，用標(biāo)準(zhǔn)DMEM液浸泡過夜。收集hADSCs 5×107cells/mL，將1 mL的細(xì)胞懸液接種于PGA材料上，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，黏附4 h后加入誘導(dǎo)液，體外培養(yǎng)皿中培養(yǎng)7 d，取細(xì)胞-PGA復(fù)合物同時(shí)做掃描電鏡觀察和DiO標(biāo)記細(xì)胞后的激光共聚焦顯微鏡，觀察細(xì)胞在材料上的黏附情況。

1.8 細(xì)胞-PGA復(fù)合物在生物反應(yīng)器內(nèi)的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)

1周后，將細(xì)胞-PGA復(fù)合物卷裹于反應(yīng)器反應(yīng)槽內(nèi)的無菌硅膠管上（內(nèi)徑4 mm），并用無菌可吸收縫線固定。動(dòng)態(tài)組：將其接于動(dòng)態(tài)槽內(nèi)接口，予以動(dòng)態(tài)力學(xué)刺激（參數(shù)設(shè)定為搏動(dòng)頻率75次/分，擴(kuò)張量<5%，流量為70～80 mL/min至100～120 mL/min，壓力為0.01～0.02 MPa）。每周換液1次，共培養(yǎng)8周。

1.9 組織學(xué)檢測(cè)

常規(guī)石蠟切片，分別做HE染色、Masson三色染色和Gomori醛復(fù)紅染色觀察新生管樣組織的組織學(xué)特點(diǎn)、膠原分泌情況和彈性纖維的合成情況。

1.10 生物力學(xué)檢測(cè)

用INSTRON力學(xué)測(cè)定儀對(duì)構(gòu)建的組織的最大張力、彈性模量和縫線張力進(jìn)行測(cè)定。

1.11 組織工程化血管膠原含量的測(cè)定

將構(gòu)建的組織稱重，并用10∶1比例的胃蛋白酶進(jìn)行消化，振蕩過夜，根據(jù)Sircol Soluble Collagen Assay試劑盒，用分光光度儀測(cè)量540 nm處的光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定測(cè)定組織中總膠原的含量，用μg/g濕重表示。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有結(jié)果均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件（Student's t檢驗(yàn)）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，當(dāng)P<0.05時(shí)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察

hADSCs在正常培養(yǎng)液培養(yǎng)下細(xì)胞呈成纖維樣梭形生長(zhǎng)（圖1a），在單純低血清培養(yǎng)液（BM）中呈扁平樣生長(zhǎng)（圖1b），而在含有TGF-β1和/或BMP4的誘導(dǎo)液的作用下，細(xì)胞呈梭形生長(zhǎng)，與hUASMCs的生長(zhǎng)形態(tài)相似，呈平滑肌細(xì)胞特有的“波峰-波谷”樣生長(zhǎng)模式（圖1c～f）。 TGF-β1和 BMP4的聯(lián)合誘導(dǎo)作用下細(xì)胞形態(tài)變化更明顯，Phalloidin染色（圖1插圖）也顯示了細(xì)胞內(nèi)的肌絲與hUASMCs的一致。

2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

從圖2的生長(zhǎng)曲線可以看出，hADSCs在正常培養(yǎng)液中持續(xù)生長(zhǎng)，而在其他組，無論是單純的低血清誘導(dǎo)組還是加有生長(zhǎng)因子的誘導(dǎo)組，細(xì)胞都出現(xiàn)了生長(zhǎng)停滯，說明hADSCs的生長(zhǎng)活性良好；同時(shí)，在加有生長(zhǎng)因子的情況下，細(xì)胞生長(zhǎng)停滯有利于細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化。

2.3 hADSCs在TGF-β1和BMP4的作用下平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物的表達(dá)

免疫熒光檢測(cè)可以看出，hADSCs在TGF-β1和BMP4的聯(lián)合誘導(dǎo)作用下，表達(dá)平滑肌細(xì)胞的特異性蛋白：α-SMA、SM22α、calponin和 SM-MHC。而在正常培養(yǎng)液組盡管可見α-SMA、SM22α的基礎(chǔ)表達(dá)，但在生長(zhǎng)因子的作用下，這兩個(gè)標(biāo)記物的表達(dá)有明顯的提高，且只有在聯(lián)合誘導(dǎo)下，才有SM-MHC的表達(dá)，這一標(biāo)記物只在平滑肌細(xì)胞中表達(dá)，從而證明在TGF-β1和BMP4的聯(lián)合作用下，hADSCs分化成平滑肌樣細(xì)胞（圖3）。

為了證明免疫熒光染色的結(jié)果，我們又通過Western-Blot來觀察上述指標(biāo)在蛋白水平的表達(dá)情況。從圖4A可以看出，α-SMA、SM22α在正常培養(yǎng)液和單純低血清組也有一定的表達(dá)，但只有在TGF-β1和BMP4的聯(lián)合誘導(dǎo)組，這些特異性蛋白的表達(dá)才與陽性對(duì)照組相當(dāng)。這與熒光觀察的結(jié)果一樣。同時(shí)，為了進(jìn)一步證明TGF-β1和BMP4對(duì)hADSCs的誘導(dǎo)分化作用，我們又采用RT-PCR來檢測(cè)這些平滑肌細(xì)胞相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況。從圖4B可以看出，未分化的hADSCs只表達(dá)低水 平 的 α-SMA and SM22αmRNA，TGF-β1 或BMP4單純誘導(dǎo)組可見calponin的表達(dá)，而只有兩者聯(lián)合作用組才見SM-MHC的表達(dá)與陽性對(duì)照組相似。從而在蛋白和轉(zhuǎn)錄水平證明了在TGF-β和BMP4的聯(lián)合作用下，hADSCs分化成了平滑肌細(xì)胞。

2.4 細(xì)胞-PGA復(fù)合物的體外及生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)

細(xì)胞-PGA復(fù)合物在體外培養(yǎng)7 d，電鏡和激光共聚焦觀察可見大量細(xì)胞黏附于材料上，并有大量的細(xì)胞外基質(zhì)分泌充填于PGA纖維間，且細(xì)胞分布于PGA膜片的各個(gè)部位（圖5a-d）。隨著復(fù)合物在反應(yīng)器內(nèi)的培養(yǎng)，PGA材料逐漸降解，形成管樣組織（圖5e）。培養(yǎng)8周后，形成新生的組織工程化肌管組織。新生組織色澤光亮，質(zhì)地均勻，管腔圓潤(rùn)，具有一定的彈性和強(qiáng)度（圖5f）。

2.5 組織學(xué)觀察

反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)8周后，HE染色可見構(gòu)建的組織結(jié)構(gòu)致密，平滑肌纖維排列規(guī)則，分布較均勻，PGA纖維已基本降解。Masson染色可見膠原分泌旺盛且濃密，肌纖維排列整齊，細(xì)胞分布規(guī)則，PGA已降解完全。但是未見彈性纖維的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)（圖6A）。同時(shí)，我們對(duì)構(gòu)建的組織進(jìn)行免疫組化分析，可以看出細(xì)胞在反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)8周后仍然表達(dá)平滑肌細(xì)胞的標(biāo)記物，細(xì)胞分布均勻規(guī)則（圖6B）。

2.6 膠原定量和生物力學(xué)檢測(cè)

反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)8周構(gòu)建組織的膠原含量達(dá)（48.4±6.65）μg/g濕重，而正常的人大隱靜脈的膠原含量為（78.15±5.57）μg/g濕重，達(dá)到正常血管的60%。將構(gòu)建的組織沿環(huán)狀面切開，根據(jù)應(yīng)力-應(yīng)變曲線，可以看出反應(yīng)器內(nèi)力學(xué)動(dòng)態(tài)培養(yǎng)構(gòu)建組織的最大張力達(dá)0.63×106Pa，達(dá)到了正常人大隱靜脈的65%。8周后，構(gòu)建組織的縫線張力達(dá)（0.93±0.04）N，達(dá)到正常大隱靜脈的56%（表2）。以上結(jié)果說明，在生物反應(yīng)器內(nèi)力學(xué)刺激的培養(yǎng)下，所構(gòu)建的管樣組織力學(xué)強(qiáng)度達(dá)到了正常大隱靜脈的近60%。

圖1 倒置相差顯微鏡觀察TGF-β1和BMP4對(duì)細(xì)胞形態(tài)變化的影響Fig.1 Morphology observation of TGF-β1 and BMP4 on inverted phase contrast microscope

圖2 hADSCs在不用培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)增殖情況Fig.2 Cell proliferation of hADSCs cultured in different media at indicated time points

圖3 免疫熒光染色觀察hADSCs在不同培養(yǎng)條件下作用7 d表達(dá)平滑肌細(xì)胞特異性蛋白的情況（標(biāo)尺大小：25 μm；插圖的標(biāo)尺：50 μm）Fig.3 Expression of SMC-specific proteins in hADSCs under different culture conditions for 7 days(Bar scales:25 μm for all figures;50 μm for insets)

圖4 hADSCs在不同培養(yǎng)條件下表達(dá)平滑肌細(xì)胞特異性蛋白的情況Fig.4 Expression of SMC-specific proteins in hADSCs at the transcript and protein levels

圖5 細(xì)胞-PGA復(fù)合物體外培養(yǎng)情況Fig 5 PGA-smooth muscle compound cultured in vitro

A：構(gòu)建組織（a，c，e）和人臍動(dòng)脈（b，d，f）。 其中 a-b 為 HE 染色，c-d為Masson三色染色，e-f為Gomori醛復(fù)紅染色。箭頭示彈性纖維。標(biāo)尺：100 μmA:Histological characterization of the engineered blood vessel walls(a,c,e).Human umbilical arteries(normal)(b,d,f)were set as positive controls.Section were stained with hematoxylin and eosin(a,b),Masson trichrome staining(c,d),and Gomori staining(e,f).Arrow indicates the elastic fibers.Scale bars:100 μm

圖6 在反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)8周所構(gòu)建管壁的組織學(xué)特點(diǎn)Fig.6 Histological and immunohistochemical observation at 8 weeks

表2 構(gòu)建組織的生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果Table 2 Biochemical detection of constructed vessels

3 討論

隨著自體血管移植技術(shù)的發(fā)展、尤其是人工合成血管（如Dacron、ePTFE等）制備技術(shù)的不斷提升，使臨床修復(fù)直徑大于6 mm血管的成功率大大提高。但是對(duì)于直徑小于6 mm的小口徑血管，由于缺乏內(nèi)皮覆蓋，易發(fā)生血栓，造成血管堵塞。組織工程技術(shù)的出現(xiàn)為解決小口徑血管重建的難題提供了可能。但種子細(xì)胞來源不足使其很難進(jìn)入臨床應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)證明，在TGF-β1和BMP4的聯(lián)合誘導(dǎo)作用下，hADSCs表現(xiàn)出平滑肌細(xì)胞的形態(tài)，并且表達(dá)平滑肌細(xì)胞的特異性標(biāo)記物α-SMA、SM22α、calponin和SM-MHC。同時(shí)，我們的前期試驗(yàn)還表明，誘導(dǎo)后的細(xì)胞接種于膠原凝膠上出現(xiàn)和正常成熟平滑肌細(xì)胞一樣的收縮反應(yīng)。說明hADSCs可作為種子細(xì)胞用于構(gòu)建組織工程化血管。

為了使構(gòu)建的組織獲得理想的力學(xué)強(qiáng)度，必須使接種的材料有合適的降解速率。本實(shí)驗(yàn)采用PGA作為支架材料[8]。我們?cè)谇捌谘芯恐袘?yīng)用PGA和成熟平滑肌細(xì)胞成功構(gòu)建了大口徑血管壁組織。但是，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的PGA膜片支架是手工編織的，容易造成PGA纖維的分布不均，從而造成細(xì)胞分布不均，構(gòu)建的組織薄厚不均，影響了最終的力學(xué)強(qiáng)度。因此，有待改進(jìn)技術(shù)以提高PGA膜片支架的一致性和均一性。

研究表明，循環(huán)張力可以明顯提高構(gòu)建的血管組織的力學(xué)強(qiáng)度，降低細(xì)胞的程序性死亡[9]，促進(jìn)細(xì)胞的定向排布，增加膠原含量，防止平滑肌細(xì)胞的表型改變[10]，從而增加平滑肌細(xì)胞的收縮特性。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，在生物反應(yīng)器內(nèi)動(dòng)態(tài)刺激下所構(gòu)建的組織工程化平滑肌層，組織學(xué)結(jié)構(gòu)層次清晰，結(jié)構(gòu)致密，膠原含量明顯增加；同時(shí)，在動(dòng)態(tài)力學(xué)的刺激下，新生組織細(xì)胞分布有序，膠原濃密，排列規(guī)則。說明適宜的力學(xué)刺激有利于血管組織的形成和細(xì)胞適應(yīng)性再塑。該結(jié)果與Seliktar的報(bào)道[11]相一致，他們認(rèn)為循環(huán)張力通過過度表達(dá)金屬蛋白酶-2可提高基質(zhì)的重塑。同時(shí)，我們觀察到，誘導(dǎo)的hADSCs在沒有生長(zhǎng)因子的作用下，在生物反應(yīng)器內(nèi)動(dòng)態(tài)培養(yǎng)8周，仍能維持平滑肌細(xì)胞的表型。

本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的生物反應(yīng)器，主要模擬了血管承受的雙軸張力，即細(xì)胞橫斷面上的同向張力和軸向張力。而對(duì)于血管承受的流體剪切應(yīng)力，即流動(dòng)的血液順血流方向作用于腔側(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞單位面積上的力，尚無法模擬。因此，需進(jìn)一步完善生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)，使之能模擬立體剪切應(yīng)力作用，以使其能更完全地模擬體內(nèi)流體作用的環(huán)境。

血管的生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)緩慢而復(fù)雜的過程，其生物力學(xué)性能也是隨著血管的不斷生長(zhǎng)，在血流的不斷作用下，而逐漸提高的。體外生物反應(yīng)器只是給予細(xì)胞-材料復(fù)合物一個(gè)更接近的生長(zhǎng)環(huán)境，其最終的目的是要回植到體內(nèi)，用于血管缺損的修復(fù)。而體內(nèi)的大環(huán)境才是血管生長(zhǎng)成熟的最佳環(huán)境，體內(nèi)的血流刺激才是最有效地作用因素。今后可考慮同時(shí)接種血管內(nèi)皮細(xì)胞，回植到體內(nèi)，在血流的作用下，使其進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育，從而構(gòu)建出更符合生理功能的血管組織。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，hADSCs在TGF-β1和BMP4的作用下可誘導(dǎo)分化為平滑肌細(xì)胞，并且誘導(dǎo)的細(xì)胞可在三維PGA支架上保持平滑肌細(xì)胞的表型。細(xì)胞-材料復(fù)合物可在生物反應(yīng)器內(nèi)形成具有一定強(qiáng)度的小口徑血管組織（內(nèi)徑4 mm）。此外，本方法還可能用于構(gòu)建其他小口徑的肌管組織，如輸尿管、膽管和輸卵管等。

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Experimental Study on Tissue Engineered Small-Diameter Blood Vessel Walls Using Adipose Derived Stem Cells

WANG Chen,GUO Fangfang,ZHANG Yun,GONG Lunli,CUI Lei.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011.

ObjectiveTo investigate the feasibility of constructing tissue engineered blood vessel walls in bioreactor using adipose derived stem cells.MethodsAdipose derived stem cells (ADSCs)were obtained from fresh human lipoaspirates,and under the induction of TGF-β1 and BMP4,hADSCs were differentiated into smooth muscle cells,and then the differentiated hADSCs were collected and seeded onto PGA mesh to form cell-PGA constructs.Thereafter,the cell/PGA constructs were cultivated in a bioreactor with the pulsatile radial stress (pulse rate:75/min,radical distension<5%)for 8 weeks.New small diameter blood vessel walls was formed,the constructs were examined histologically and biomechanically and compared with normal blood vessels.ResultsWith induction of TGF-β1 and BMP4 together,hADSCs acquired a SMC morphology,and grew in a"hill and valley"pattern similar to what was observed in primary isolated hUASMCs,with the expression of smooth muscle-specific contractile proteins including α-SMA,SM22α,calponin,and SM-MHC.An elastic small diameter vessel wall(4 mm in diameter)with improved biomechanical strength and well-organized collagenous fibers were engineered by in vitro culture of SMC-differentiated hADSCs on the PGA scaffold in a blood vessel bioreactor.ConclusionhADSCs can serve as a new cell source for SMCs in blood vessel engineering,and an elastic small diameter vessel wall could be engineered in a bioreactor.It is a promising candidate for treating cardiovascular diseases and for blood vessel engineering purposes.

Polyglycolic acid;Adipose derived stem cells;Smooth muscle cells;Blood vessel tissue engineering;Bioreactor.

Q813.1+1

A

1673－0364（2012）05－0249－07

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.05.003

上海市自然科學(xué)基金（11ZR1420300）。

200011 上海市 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。

2012年8月7日；

2012年9月22日）