Aggrecanase-2表達(dá)沉默對(duì)體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞基質(zhì)代謝的影響

王正輝 楊壯群 吳寶俊 常會(huì)敏 Kamal Mustafa 盧曉云

Aggrecanase-2表達(dá)沉默對(duì)體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞基質(zhì)代謝的影響

王正輝 楊壯群 吳寶俊 常會(huì)敏 Kamal Mustafa 盧曉云

目的 探討RNA干擾蛋白聚糖酶-2（Aggrecanase-2）對(duì)大鼠肋軟骨細(xì)胞基質(zhì)代謝的影響。方法 體外分離培養(yǎng)大鼠肋軟骨細(xì)胞，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將針對(duì)Aggrecanase-2的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞，觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞形態(tài)的變化；RT-PCR檢測(cè)Aggrecanase-2 mRNA水平的變化；Western Blot檢測(cè)蛋白多糖（Aggrecan）的變化。結(jié)果RNA干擾Aggreanase-2對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)速度及形態(tài)無明顯影響，可明顯降低Aggrecanase-2的mRNA表達(dá)水平（P<0.05），增加Aggrecan的含量（P<0.05）。結(jié)論 抑制Aggrecanase-2可減少蛋白多糖的降解，RNAi是一種有效的研究軟骨細(xì)胞基質(zhì)代謝的工具。

軟骨細(xì)胞 蛋白聚糖酶-2 RNA干擾

先天性畸形或后天獲得性疾病導(dǎo)致的軟骨組織缺損，如耳、鼻、氣管的缺損或畸形等，嚴(yán)重影響患者的顏面外觀或器官功能。軟骨是一種無血管的組織，自身修復(fù)能力有限。軟骨組織的來源主要以自體、同種異體和異種軟骨移植物為主。其中，同種異體軟骨為僅次于自體軟骨的良好生物材料，其成本低、來源廣泛且生物學(xué)性能良好的優(yōu)點(diǎn)，使其目前在臨床上應(yīng)用較多，效果良好，臨床成功率可達(dá)90%以上[1－2]。同種異體軟骨移植后，軟骨細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）發(fā)生大量的降解，尤其在移植后1個(gè)月內(nèi)最為明顯，表現(xiàn)為基質(zhì)中蛋白多糖（Aggrecan）和膠原的含量發(fā)生較大的變化[1-3]。目前研究認(rèn)為，Aggrecan的丟失可能是軟骨代謝失衡的始動(dòng)環(huán)節(jié)。因此，采用RNA干擾（RNA interference,RNAi）技術(shù)下調(diào)軟骨細(xì)胞多聚蛋白聚糖酶（Aggrecanase）的表達(dá)，減少其對(duì)Aggrecan的分解，將有可能保持軟骨移植后軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的平衡，從而維持軟骨的穩(wěn)定，減少軟骨的吸收。

本實(shí)驗(yàn)以大鼠Aggrecanase-2為靶基因，設(shè)計(jì)針對(duì)Aggrecanase-2特異性的小干擾RNA，并將該載體轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞，觀察其對(duì)細(xì)胞基質(zhì)代謝的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

慢病毒載體試劑盒（上?？党缮锕荆?；核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ（TaKaRa公司）；T4 DNA連接酶（MBI公司）；凝膠回收試劑盒（QIAGEN公司）。雌性SD大鼠（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心），1 月齡，體質(zhì)量（120±10）g。 DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、脂質(zhì)體LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）；胰蛋白酶（Sigma公司），Ⅱ型膠原酶、透明質(zhì)酸酶、阿爾新藍(lán)8GX（Sigma公司）；小鼠抗大鼠Ⅱ型膠原單克隆抗體（Neomarker公司）；羊抗大鼠Aggrecan單克隆抗體（Santa Cruz公司）；DAB免疫組織化學(xué)試劑盒（北京中杉公司）；RNA提取試劑盒（上海飛捷公司）；Revertaid First strand CDNA synthesis kit（MBI公司）。正置、倒置相差顯微鏡及顯微攝影系統(tǒng)（Nikon公司）；CO2培養(yǎng)箱等。

1.2 大鼠肋軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

參見文獻(xiàn)[4]的方法。清除附著于軟骨的其他組織，將軟骨切成1 mm3的小粒。0.05%透明質(zhì)酸酶10 mL室溫下消化20 min，棄去酶液，D-Hanks’液洗滌后，將軟骨小粒轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)，加入0.2%胰蛋白酶5 mL，于37℃磁力攪拌下消化30 min。再加入0.2%膠原酶5 mL，于37℃振蕩消化過夜，吸出含細(xì)胞酶液，200目篩網(wǎng)過濾消化后的細(xì)胞懸液，所得細(xì)胞沉淀重懸于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中。按2×104cells/cm2的密度，將上述細(xì)胞懸液接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶，37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24 h后更換培養(yǎng)液，以后培養(yǎng)基每2 d更換1次。

1.3 ShRNA重組表達(dá)載體的構(gòu)建[5]

按GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)大鼠Aggrecanase-2 mRNA（XM_341154）序列，根據(jù)RNAi設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)，挑選3段長(zhǎng)19 bp的特異性寡核苷酸為靶序列，命名為ag gre-21043-1061、aggre-21229-1247和 aggre-22293-231，陰性對(duì)照為aggre-2neg。

1.4 脂質(zhì)體介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將第1代軟骨細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)轉(zhuǎn)染構(gòu)建的載體質(zhì)粒。按照LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)分組為：空白對(duì)照、干擾組、陰性對(duì)照組。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

將細(xì)胞按每孔2×104個(gè)細(xì)胞接種于24孔板，每孔100 μL，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。 為避免血清干擾，培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)用小于10%的血清培養(yǎng)；分別于轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h、96 h 和 120 h 時(shí)，棄掉各孔培養(yǎng)基，加入 MTT（5 mg/mL）20 μL，另加 180 μL 無酚紅DMEM 37℃繼續(xù)孵育4 h；吸去混合液，每孔加入DMSO 200 μL，震蕩10 min使結(jié)晶充分溶解。在酶聯(lián)免疫儀上490 nm處測(cè)定光吸收值，記錄結(jié)果。

1.6 RT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后Aggrecanase-2的表達(dá)[6]

按照試劑盒說明提總RNA，使用cDNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將反轉(zhuǎn)錄的cDNA按照以下體系（25 μL體系）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

β-actin引物序列：正義鏈5'-GAGGGAAA TCGTGCGTGAC-3'；反義鏈 5'-TAGGAGCCA GGGCAGTAATCT-3'；反應(yīng)條件是 94 ℃ 2 min，94 ℃30 sec，53 ℃ 30 sec，72 ℃ 30 sec，循環(huán) 35 次。

Aggrecanase-2引物序列：正義鏈5'-CTGC GCTGTGATTGAAGATGAT-3'；反義鏈 5'-TGCTGGT AAGGATTGAAGACATT-3'；反應(yīng)條件是94℃2 min，94 ℃ 30 sec，53 ℃ 30 sec，72 ℃ 30 sec，循環(huán) 35 次。反應(yīng)產(chǎn)物于1%凝膠中進(jìn)行電泳。凝膠成像系統(tǒng)對(duì)各電泳條帶的吸光度進(jìn)行分析，得出Aggrecanase-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Aggrecan的表達(dá)

轉(zhuǎn)染后48 h，加入單去污細(xì)胞裂解液，在4℃以12 000 r/min離心3 min，取上清，用 Lowry法定量蛋白，經(jīng)聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離蛋白，用電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)置 PVDF膜上，依次加入封閉液、抗Aggrecan抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，再經(jīng)化學(xué)發(fā)光劑反應(yīng)，X線片壓片曝光。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

各取3個(gè)樣本，每個(gè)樣本重復(fù)3次。采用SPSS 10.0軟件包，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)和組間方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT

各組質(zhì)粒干擾后與對(duì)照組相比，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線無明顯變化（圖1）。

圖1 各組質(zhì)粒干擾后生長(zhǎng)曲線Fig 1.The growth curve of chondrocytes by different plasmids

2.2 RNAi對(duì)Aggrecanase－2 mRNA水平影響

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明：細(xì)胞中各組泳道中βactin基因擴(kuò)增片段條帶的亮度強(qiáng)弱相似，說明RTPCR中加入的模板的量一致，而擴(kuò)增的Aggrecanase-2基因電泳帶存在明顯差異。其中對(duì)照及陰性對(duì)照組PCR擴(kuò)增帶亮度較強(qiáng)，3組重組質(zhì)粒載體中，RNAi后Aggrecanase-2表達(dá)與對(duì)照組相比，aggre-21043-1061表達(dá)量為對(duì)照組的 60%（P<0.05），aggre-21229-1247組為 71.64%（P<0.05），而 aggre-22293-2311對(duì) Aggrecanase-2無明顯抑制作用，陰性對(duì)照組對(duì)Aggrecanase-2也無明顯影響，說明RNAi抑制的特異性（圖2）。

抑制率=（相對(duì)灰度值對(duì)照組－相對(duì)灰度值實(shí)驗(yàn)組）÷相對(duì)灰度值對(duì)照組

圖2 RT-PCR產(chǎn)物電泳及統(tǒng)計(jì)圖（★★P＜0.01）Fig 2.RT-PCR results and graph of statistics(★★P＜0.01)

2.3 Western Blot分析

采用Western Blot檢測(cè)干擾后的Aggrecan含量，發(fā)現(xiàn)aggre-21043-1061和aggre-21229-1247可明顯增加Aggrecan含量，與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）（圖3），與RT-PCR結(jié)果一致。

圖3 Western-blot條帶圖Fig 3.The graph of Western Blot

3 討論

同種異體軟骨移植后，常發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，導(dǎo)致移植軟骨被吸收和破壞。軟骨組織是由少量細(xì)胞和大量基質(zhì)成分組成的，具有抗原性，但其細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）能阻止分子量大于60 000的宿主大分子滲透、通過，隔離了軟骨細(xì)胞與宿主間的大分子（如免疫球蛋白）之間的接觸作用，形成了一道抗免疫反應(yīng)屏障，保護(hù)和預(yù)防或延緩宿主免疫移植排斥反應(yīng)，使軟骨成為一種弱抗原組織。因此，維持軟骨基質(zhì)的質(zhì)和量，對(duì)軟骨移植物的存活顯得非常重要。目前，減少軟骨移植后的免疫排斥反應(yīng)尚是難點(diǎn)問題。

楊壯群等[1-2]在同種異體軟骨移植中發(fā)現(xiàn)，同種異體軟骨移植后，軟骨ECM大量衰退（尤其在移植后1個(gè)月內(nèi)最為明顯），主要表現(xiàn)為單核淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)導(dǎo)致蛋白多糖的大量降解，隨后因MHCⅡ型分子的滲入使Ⅱ型膠原流失。軟骨移植后基質(zhì)的變化首先表現(xiàn)為蛋白多糖的喪失，這一軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解過程與骨關(guān)節(jié)炎的病理過程相類似。有關(guān)學(xué)者在研究類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）和退行性關(guān)節(jié)炎（OA）時(shí)發(fā)現(xiàn)，多聚蛋白聚糖的丟失是目前所知的關(guān)節(jié)軟骨在關(guān)節(jié)疾病中最早發(fā)生的代謝變化，甚至早于關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)病理改變[7]。致病因素所導(dǎo)致的多聚蛋白聚糖的丟失，可視為軟骨代謝失衡的始動(dòng)環(huán)節(jié)，如持續(xù)存在，則引起關(guān)節(jié)軟骨膠原纖維的降解和各種炎性信息因子的釋放，引發(fā)瀑布效應(yīng)，進(jìn)而徹底打破關(guān)節(jié)軟骨的代謝平衡，進(jìn)入不可逆性的負(fù)代謝狀態(tài)，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的損毀。因此，多聚蛋白聚糖的代謝改變和信息調(diào)控是研究軟骨基質(zhì)代謝障礙的關(guān)鍵所在。

參與多聚蛋白聚糖代謝的生物大分子很多，其中參與降解代謝的最重要的酶是多聚蛋白聚糖酶。Aggrecanases屬于帶有血小板凝血酶敏感蛋白樣模體的解整連蛋白金屬蛋白酶（A disintegrin and metalloproteinasewith thrombospondin motifs，ADAMTS）家族，主要降解軟骨多聚蛋白聚糖，具有很高的特異性。其公認(rèn)的成員只有兩個(gè)，即Aggrecanase-1和Aggrecanase-2。Aggrecanase-2在新生關(guān)節(jié)軟骨蛋白聚糖的代謝中起重要作用，并且在關(guān)節(jié)軟骨受到病理?yè)p害時(shí)，對(duì)蛋白聚糖的降解、糖氨聚糖（Glycossminoglycan，GAG）的丟失起主要責(zé)任。目前，Aggrecan因其為軟骨降解的始動(dòng)因素而受到廣泛的關(guān)注，Aggrecanases已成為減少軟骨降解新的靶點(diǎn)[8]。

RNAi是一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。RNAi技術(shù)具有穩(wěn)定性好、阻斷效率高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，現(xiàn)已成為操縱微生物和培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)的強(qiáng)有力工具。Ruohua等[9]采用RNAi技術(shù)應(yīng)用于人軟骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)通過抑制ADAMTS可明顯減少蛋白多糖的降解。本研究中，我們采用大鼠肋軟骨細(xì)胞作為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)表達(dá)shRNA的載體可明顯抑制Aggrecanase-2的mRNA水平，并可增加Aggrecan含量，與對(duì)照組相比差異顯著，aggre-21043-1061為最有效的RNA特異性抑制序列，同時(shí)觀察到抑制Aggrecanase-2對(duì)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)速率無明顯影響，為構(gòu)建Aggrecanase-2受抑制的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。

當(dāng)然，軟骨移植抑制后的免疫排斥反應(yīng)是個(gè)復(fù)雜的過程，不僅與自身軟骨組織、軟骨細(xì)胞代謝情況相關(guān)，還與炎性因子等有關(guān)。此外，Aggrecanase-2、MMPs等降解酶活性狀態(tài)啟動(dòng)的始動(dòng)因素，可能涉及到諸多方面的問題。是否可通過抑制Aggrecanase-2而減少Aggrecan的降解，以減緩排斥反應(yīng)的發(fā)生，尚需更深入的研究。

[1]鄭信民,楊壯群,侯成群,等.同種透明軟骨移植后蛋白多糖動(dòng)態(tài)變化的實(shí)驗(yàn)觀察[J].中華整形外科雜志,1995,11(2):129-131.

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[3]楊壯群,侯成群,常曉峰,等.同種軟骨移植后基質(zhì)動(dòng)態(tài)變化的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)雜志,1997,6(1):14-16.

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Effects of Inhibiting Aggrecanase-2 Gene Expression by RNA Interference on Cultured Chondrocyte Extracellular Matrix in Vitro

WANG Zhenghui1,YANG Zhuangqun2,WU Baojun1,CHANG Huimin1,Kamal Mustafa3,LU Xiaoyun4.1Department of Otolaryngology-Head&Neck Surgery,The Second Affiliated Hospital,Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710004,China;2 Department of Plastic and Burns Surgery,The First Affiliated Hospital,Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710061,China;3 Faculty of Dentistry,University of Bergen,Norwa;4 Department of Biological Science and Bioengineering,School of Life Science and Technology,Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710049,China.

ObjectiveTo evaluate the effect of RNAi mediated aggrecanase-2 on rat costochondral chondrocytes extracelluler matrix.MethodsRat costochondral chondrocytes were obtained by microdissection and digestion,and cultured in monolayer.The growth velocity and morphological changes of chondrocytes were observed after transfection.The mRNA of aggrecanase-2 expression was detected by RT-PCR method and aggrecan content was detected by western blot.ResultsThe specific inhibition of aggrecanase-2 by RNAi had no positive effect on the morphology and growth velocity of the chondrocytes.The express of mRNA of aggrecanase-2 was decreased significantly.RNAi significantly increased the aggrecan content of chondrocytes treated.ConclusionInhibition of aggrecanase-2 may decrease aggrecan degradation.RNAi technology can be a useful tool for studying degenerative processes in cartilage.

Chondrocyte;Aggrecanase-2;RNA interference

Q786

A

1673－0364（2012）05－0245－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.05.002

國(guó)家自然科學(xué)基金（81000416）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（西安交通大學(xué)國(guó)際合作類，交叉學(xué)科類）；西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院人才培養(yǎng)基金[RC(XM)201102]；西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院重點(diǎn)項(xiàng)目基金[YJ(ZD)201103]。

710004 陜西省西安市 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻喉-頭頸外科（王正輝，吳寶俊，常會(huì)敏）；710061 陜西省西安市 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形燒傷科（楊壯群）；挪威卑爾根大學(xué)牙科學(xué)院（Kamal Mustafa）；710049 陜西省西安市 西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（盧曉云）。

吳寶俊（E-mail:ehui4298@163.com）。

2012年8月5日；

2012年8月22日）