毛囊干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

許志成 李宏 張群

毛囊干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

許志成 李宏 張群

目的 探討體外誘導(dǎo)人毛囊干細(xì)胞成血管內(nèi)皮細(xì)胞的可行性。方法 采用中性蛋白酶（Dispase）分離人毛囊干細(xì)胞，用含10 ng/mL VEGF、2 ng/mL bFGF及10%血清的EGM-2誘導(dǎo)液對(duì)其誘導(dǎo)，以無(wú)誘導(dǎo)因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)液為對(duì)照組，對(duì)每代細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察。誘導(dǎo)4代后，檢測(cè)vWF（von Willebrand factor）與CD31的表達(dá)。結(jié)果 在誘導(dǎo)液的作用下，細(xì)胞形態(tài)逐步向內(nèi)皮細(xì)胞的鋪路石樣形態(tài)轉(zhuǎn)變，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)改變不明顯。至第4代，實(shí)驗(yàn)組已明顯表達(dá)vWF與CD31，對(duì)照組表達(dá)不明顯；流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，實(shí)驗(yàn)組陽(yáng)性表達(dá)率近80%，對(duì)照組則低于5%；RT-PCR顯示，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)vWF，對(duì)照組未見(jiàn)明顯表達(dá)。結(jié)論 使用含10 ng/mL VEGF、2 ng/mL bFGF及10%血清的EGM-2誘導(dǎo)液，可在體外誘導(dǎo)人毛囊干細(xì)胞分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞。

毛囊干細(xì)胞 血管內(nèi)皮細(xì)胞 組織工程

血管內(nèi)皮細(xì)胞是構(gòu)建組織工程化血管主要的種子細(xì)胞，來(lái)自成年哺乳動(dòng)物主動(dòng)脈消化的成熟內(nèi)皮細(xì)胞。由于成熟內(nèi)皮細(xì)胞體外大量擴(kuò)增技術(shù)的不成熟，內(nèi)皮細(xì)胞易老化，與生物材料黏附不牢，易被血流沖走而形成血栓等原因，使組織工程血管的研究受到限制[1]，干細(xì)胞可能為解決該問(wèn)題帶來(lái)曙光[2-3]。最近的研究表明，存在于毛囊外根鞘的毛囊干細(xì)胞于體外分離純化后，經(jīng)誘導(dǎo)可向多種組織轉(zhuǎn)化，并有利于組織再生[4-6]。Amoh等[7]研究發(fā)現(xiàn)，鼠皮膚新生毛細(xì)血管可源自毛囊干細(xì)胞；Liu等[8]證實(shí)，綿羊毛囊干細(xì)胞中含有平滑肌前體細(xì)胞，純化培養(yǎng)后可形成有收縮功能的平滑肌細(xì)胞，說(shuō)明頭發(fā)毛囊中的干細(xì)胞具有形成血管壁細(xì)胞的潛力。自體毛囊干細(xì)胞來(lái)源廣泛，取材時(shí)生理干擾小；有很強(qiáng)增殖能力，不易老化；體外誘導(dǎo)可多向分化；回植無(wú)免疫排斥反應(yīng)，而成為種子細(xì)胞的良好選擇。本實(shí)驗(yàn)分離人毛囊干細(xì)胞，采用VEGF和bFGF對(duì)其進(jìn)行體外誘導(dǎo)，觀察細(xì)胞在誘導(dǎo)擴(kuò)增后，表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)的比例，以期為進(jìn)一步體外血管構(gòu)建提供種子細(xì)胞。

1 材料和方法

1.1 材料

整形外科手術(shù)切除的成人頭皮5例；分離毛囊的器械包括眼科剪刀、鑷子、解剖顯微鏡和顯微器械；中性蛋白酶（Dispase，Gibco公司）；胰蛋白酶（Gibco 公司）；K—SFM（Define Keratinocyte Serum Free Medium）培養(yǎng)液，添加EGF和牛垂體提取物（Gibco 公司）；DMEM 培養(yǎng)液（Gibco 公司）；EGM-2培養(yǎng)液（Cambrex公司）；胎牛血清（Hyclone公司）；維生素 50 mg／L（Sigma 公司）；L-谷氨酰胺 300 mg/L（Sigma公司）；青霉素；鏈霉素（Sigma公司）。 鼠抗人vWF（DAKO 公司），鼠抗人 CD31（DAKO 公司）； 二抗：羊抗鼠 lgG-FITC（Santa Cruz公司）。

1.2 方法

1.2.1 毛囊干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

毛囊外根鞘的富集方法參考文獻(xiàn)[9]；毛囊干細(xì)胞的富集方法同文獻(xiàn)[10]。

1.2.2 VEGF和bFGF誘導(dǎo)分化毛囊干細(xì)胞

將VEGF和bFGF用稀釋液（EGM-2培養(yǎng)液）稀釋成每支1 μg/mL，分裝至Ep管中，-20℃冷凍保存，應(yīng)用前即時(shí)加入，在培養(yǎng)液中的終濃度分別為10 ng/mL和2 ng/mL。取第1代毛囊干細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)，在細(xì)胞全部貼壁后，加入含10 ng/mL VEGF、2 ng/mL bFGF及 10%血清的 EGM-2誘導(dǎo)液，置于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的條件下培養(yǎng)，隔日更換2/3量的培養(yǎng)液，注意觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，一般7 d后達(dá)到融合狀態(tài)，可繼續(xù)用誘導(dǎo)液傳代培養(yǎng)。當(dāng)出現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞類似形態(tài)時(shí)，可進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞特異性表型的鑒定。對(duì)照組僅用含10%FBS的EGM-2培養(yǎng)液培養(yǎng)，與實(shí)驗(yàn)組同期傳代、觀察。

1.2.3 形態(tài)學(xué)觀察

倒置相差顯微鏡（Olympus）觀察各代毛囊干細(xì)胞形態(tài)變化，以確定在誘導(dǎo)與未誘導(dǎo)的培養(yǎng)情況下，兩組細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)上是否有向內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)變的可能。

1.2.4 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)vWF和CD31的表達(dá)

分別收集實(shí)驗(yàn)組第4代細(xì)胞與對(duì)照組第4代細(xì)胞，用丙酮固定15 min，PBS漂洗，10% 羊血清封閉30 min，加入以0.1%BSA稀釋的1:100的vWF和CD31抗體，37℃孵育45 min；PBS漂洗，滴加FITC標(biāo)記相應(yīng)二抗，37℃孵育30 min，PBS漂洗。碘化丙啶襯核后，熒光顯微鏡下觀察。以臍動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，人耳廓軟骨細(xì)胞為陰性對(duì)照。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率

采用胰酶消化法收集實(shí)驗(yàn)組第4代細(xì)胞與對(duì)照組第4代細(xì)胞，消化得細(xì)胞懸液，離心5 min制備單細(xì)胞懸液，滴加0.25%TritonX-100作用5 min，PBS漂洗，離心5 min；分裝入4個(gè)1.5 mL Ep管，保證每管含1×106個(gè)以上細(xì)胞，其中3管內(nèi)分別加入抗vWF抗體和抗CD31抗體各10 μL，4℃孵育40 min；PBS漂洗，離心5 min，洗掉未結(jié)合抗體；各管同時(shí)加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗4 μL，4℃孵育30 min，離心5 min，洗掉未結(jié)合抗體。 用只加有FITC標(biāo)記二抗，而未加一抗的細(xì)胞作同型對(duì)照，1%多聚甲醛固定后送檢。

1.2.6 RT-PCR 檢測(cè) vWF 表達(dá)

實(shí)驗(yàn)分4組：實(shí)驗(yàn)組第4代細(xì)胞；對(duì)照組第4代細(xì)胞；正常內(nèi)皮細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照；軟骨細(xì)胞作為陰性對(duì)照。抽提各組細(xì)胞mRNA后按以下逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)與聚合酶鏈反應(yīng)條件進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中，在80V電壓下，電泳45 min，條帶與標(biāo)準(zhǔn)條帶位置進(jìn)行比較，判斷各種檢測(cè)目的mRNA的表達(dá)。應(yīng)用天能電泳圖象分析系統(tǒng)在紫外光下觀察各基因表達(dá)，以β-actin作為cDNA定量的內(nèi)參照。根據(jù)GenBank報(bào)告的序列設(shè)計(jì)引物，β-actin上游引物為：5’-ATCATGTTTGAGACCTTCAA-3’； 下游引物為：5’-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3’，vWF 上游引物為：5’-CAGTGGTGTGAACGGGCATCT-3’；下游引物為：5’-CCCTGCGTAAGTCCATTCC-3’。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以（x±s）表示，組間比較采用 t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 倒置相差顯微鏡觀察

原代毛囊干細(xì)胞剛貼壁時(shí)仍保持其原有的特性（圖1）。4～5 d后，細(xì)胞逐漸伸展，在誘導(dǎo)液的作用下，細(xì)胞形態(tài)逐步由小圓形向鋪路石樣轉(zhuǎn)變。至第4代，內(nèi)皮樣形態(tài)更加明顯（圖2），呈良好的分化狀態(tài)；未誘導(dǎo)組細(xì)胞形態(tài)改變不明顯。

圖1 原代毛囊干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察（100×）Fig.1 Morphological observation of FSCs P0(100×)

2.2 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)

對(duì)體外誘導(dǎo)至第4代的毛囊干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)vWF與CD31（圖3、4），可見(jiàn)細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光表達(dá)，即毛囊干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后已產(chǎn)生內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)，而為對(duì)照組胞漿熒光表達(dá)不顯著。

圖3 誘導(dǎo)后毛囊干細(xì)胞表達(dá)vWF（200×）Fig.3 Induced FSCs expressed vWF(200×)

圖4 誘導(dǎo)后毛囊干細(xì)胞表達(dá)CD31（200×）Fig.4 Induced FSCs expressed CD31(200×)

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

vWF與CD31在原代接種時(shí)的表達(dá)陽(yáng)性率分別為（3.25±0.45）%和（2.83±0.36）%，經(jīng)誘導(dǎo)與傳代至第4代，實(shí)驗(yàn)組中陽(yáng)性率分別為（78.16±2.51）%和（81.58±3.73）%，明顯高于誘導(dǎo)培養(yǎng)前（P<0.05）；對(duì)照組中陽(yáng)性率分別為（4.82±0.74）%和（3.28±0.62）%，明顯低于實(shí)驗(yàn)組（P<0.05）?？梢?jiàn)兩種標(biāo)記在不同組有相似的表達(dá)趨勢(shì)，即實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞陽(yáng)性率明顯高于培養(yǎng)前和對(duì)照組（P<0.05）（表1）。

表1 各組流式細(xì)胞儀檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率(x±s，n=8)Table 1 Posive cells expressed in each group by FACS(x±s,n=8)

2.4 RT-PCR檢測(cè)vWF表達(dá)

誘導(dǎo)組和陽(yáng)性對(duì)照（正常血管內(nèi)皮細(xì)胞）在180 bp有明顯條帶，說(shuō)明有vWF表達(dá)（圖5），對(duì)照組和陰性對(duì)照（軟骨細(xì)胞）則無(wú)表達(dá)，且各組均有內(nèi)參照物β-actin在318 bp的表達(dá)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組表達(dá)了內(nèi)皮細(xì)胞vWF的指標(biāo)。

圖5 RT-PCR結(jié)果Fig.5 The results of RT-PCR

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管內(nèi)膜的主要成分，隨血流呈單層縱向排列，細(xì)胞長(zhǎng)軸與血流方向平行。內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)維持血流的穩(wěn)定，維護(hù)血管壁的完整，穩(wěn)定物質(zhì)交換平衡，參與凝血與抗凝血活動(dòng)，分泌血管舒縮物質(zhì)等方面都具有至關(guān)重要的作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞一般可從大中型的動(dòng)靜脈中用灌注消化法獲取，自Jaffe等[11]首創(chuàng)從新生嬰兒臍帶培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后，內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法得到了不斷改進(jìn)。我們發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用終末成熟分化的血管內(nèi)皮細(xì)胞為種子細(xì)胞體外培養(yǎng)易老化，擴(kuò)增效率降低，直接影響到構(gòu)建血管的力學(xué)性能和組織結(jié)構(gòu)。

毛囊組織來(lái)源豐富，利用它進(jìn)行組織工程研究有以下優(yōu)勢(shì)：①微創(chuàng)取材，方便且對(duì)機(jī)體無(wú)害；②取自自體，來(lái)源充足，誘導(dǎo)的組織不存在組織配型及免疫排斥問(wèn)題；③分化的組織類型廣泛，有多向分化潛能。毛囊干細(xì)胞可在體外大量擴(kuò)增，若能分化為血管壁細(xì)胞，可提供充足的細(xì)胞量，從而解決心血管組織工程中的細(xì)胞來(lái)源問(wèn)題。

培養(yǎng)液的選擇也直接影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)采用的是EGM-2培養(yǎng)液，添加物中含有血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、氫化可的松、肝素、血清與抗生素等，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)極為有益。其中，各種生長(zhǎng)因子配合激素使用，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有高效特異的促有絲分裂作用和促增殖作用；肝素可顯著增強(qiáng)生長(zhǎng)因子對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖作用，配合母液的使用，能使體外培養(yǎng)的細(xì)胞較好維持內(nèi)皮細(xì)胞的表型及功能，同時(shí)避免了尋求添加物與具體用量選擇的不便，節(jié)省了工作時(shí)間，提高了工作效率。

在鑒定毛囊干細(xì)胞是否誘導(dǎo)為血管內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，本實(shí)驗(yàn)選擇了vWF與CD31。前者是內(nèi)皮細(xì)胞特有的超微結(jié)構(gòu)，CD31即血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子－1廣泛存在與內(nèi)皮細(xì)胞表面，兩者是判別干細(xì)胞是否誘導(dǎo)分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的重要指標(biāo)。觀察結(jié)果顯示，經(jīng)誘導(dǎo)的毛囊干細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)逐漸轉(zhuǎn)化為鋪路石樣的內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)照組則形態(tài)改變不明顯。熒光檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光表達(dá)，可見(jiàn)干細(xì)胞已表現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的類似結(jié)構(gòu)，而對(duì)照組細(xì)胞的熒光較弱；RT-PCR從基因水平進(jìn)一步證實(shí)了這點(diǎn)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞有明顯的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)，誘導(dǎo)率近80%，明顯高于對(duì)照組表達(dá)（近5%），證明本實(shí)驗(yàn)的誘導(dǎo)體系有較高的誘導(dǎo)效率。

本實(shí)驗(yàn)建立了一個(gè)較為有效的誘導(dǎo)體系，同時(shí)摸索出一套較為完整的毛囊干細(xì)胞分離純化培養(yǎng)和表型檢測(cè)的方法，誘導(dǎo)后已表達(dá)有血管內(nèi)皮細(xì)胞的表型，為進(jìn)一步進(jìn)行血管構(gòu)建與血管缺損的修復(fù)研究奠定了基礎(chǔ)，也為血管疾病的治療提供了新的思路與選擇。

[1]曹誼林.組織工程學(xué)理論與實(shí)踐[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2004,271.

[2]Badylak SF,Nerem RM.Progress in tissue engineering and regenerative medicine[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(8):3285-3286.

[3]Lasala GP,Minguell JJ.Vascular disease and stem cell therapies[J].Br Med Bull,2011,98:187-197.

[4]Amoh Y,Li L,Campillo R,et al.Implanted hair follle stem cells form Schwann cells that support repair of severed peripheral nerves[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2005,102(49):17734-17738.

[5]Blazejewska EA,Schlotzer-Schrehardt U,Zenkel M,et al.Corneal limbal microenvironment can induce transdifferentiation of hair follicle stem cells into corneal epithelial-like cells[J].Stem Cells,2008,27(3):642-652.

[6]Amoh Y,Kanoh M,Niiyama S,et al.Human hair follicle pluripotent stem(hfPS)cells promote regeneration of peripheral-nerve injury:an advantageous alternative to ES and iPS cells[J].J Cell Biochem,2009,107(5):1016-1020.

[7]Amoh Y,Li L,Yang M,et al.Nascent blood vessels in the skin arise from nestin-expressing hair-follicle cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2004,101(36):13291-13295.

[8]Liu JY,Peng HF,Andreadis ST.Contractile smooth muscle cells derived from hair-follicle stem cells[J].Cardiovasc Res,2008,79(1):24-33.

[9]張群,楊光輝,叢笑倩,等.人毛囊外根鞘細(xì)胞的分離及培養(yǎng)明[J].組織工程與重建外科,2006,2(2):79-82.

[10]張群,楊光輝,叢笑倩,等.差速貼壁法分選人毛囊干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2006,23(6):755-757.

[11]Jaffe EA,Nachman RL,Becker CG,et al.Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins:identification by morphologic and immunologic criteria[J].J Clin Invest,1973,52(11):2745-2756.

Preliminary Study on Inducing Hair Follicle Stem Cells into Vascular Endothelial Cells in Vitro

XU Zhicheng1,LI Hong2,ZHANG Qun1.1 Department of Plastic&Reconstructive Surgery，The Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.2 Hangzhou Electronic Science and Technology University,Hangzhou 310018,China.

XU Zhicheng(E-mail:xuzhichengmd@163.com).

ObjectiveTo investigate the feasibility of inducing human hair FSCs(follicle stem cells)into VECs(vascular endothelial cells)in vitro.MethodsThe dispase was used to isolate the stem cells and stem cells were cultured in EGM-2 plus 10 ng/mL VEGF and 2 ng/mL bFGF as long as 4thpassage as a experimental group,the control group was cultured in EGM-2 without growth factor.The morphological change of each passage was observed and vWF(von Willebrand factor)and CD31 were tested 4 passages later.ResultsThe morphological change to VECs was obviously found in the increasing passage of the induced FSCs,but the phenomenon was not distinct in the control group.Induced FSCs of 4thpassage expressed vWF and CD31 in immunocytochemical staining,while little expression was observed in the control groups.FCM showed nearly 80%of induced FSCs expressed vWF and CD31,much higher than the control ones which were lower 5%.RT-PCR further confirmed the experimental group expressed vWF,but not obvious expression in the control group.ConclusionFSCs can be induced to VECs in vitro by EGM-2 plus 10 ng/mL VEGF and 2 ng/mL bFGF.

Follicle stem cells;Vascular endothelial cells;Tissue engineering

Q813.1+1

A

1673－0364（2012）05－0241－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.05.001

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金(81000842)。

200011 上海市 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科(許志成，張群)；310018 浙江省杭州市 杭州電子科技大學(xué)（李宏）。

許志成（E-mail:xuzhichengmd@163.com）。

2012年7月22日；

2012年8月16日）