黑暗條件下干露對孔石莼生理生化指標(biāo)的影響

楊帆，李世國，佟少明，侯和勝

（遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院；遼寧省植物生物技術(shù)重點實驗室：遼寧 大連116081）

黑暗條件下干露對孔石莼生理生化指標(biāo)的影響

楊帆，李世國，佟少明，侯和勝＊

（遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院；遼寧省植物生物技術(shù)重點實驗室：遼寧 大連116081）

在黑暗條件下干露脅迫處理孔石莼的葉狀體，測定其葉綠素a、脯氨酸、可溶性糖、丙二醛的含量以及過氧化物酶（POD）的活性隨不同處理時間段（0、0.5、1、2、4、6 h）的變化.實驗結(jié)果顯示：孔石莼的各項生理指標(biāo)與對照組（未經(jīng)干露處理）相比，除葉綠素a的含量逐漸下降外，其余各項生理指標(biāo)均出現(xiàn)上升的趨勢，其中脯氨酸的含量和POD活性均在4 h后急劇升高；經(jīng)6 h脅迫后復(fù)水，各指標(biāo)均有不同程度的恢復(fù).這說明孔石莼對黑暗條件下的干露有一定的適應(yīng)性，該結(jié)果可為孔石莼干露適應(yīng)的生理機制提供參考.

孔石莼；黑暗；干旱脅迫；生理指標(biāo)

0 引言

孔石莼（Ulvapertusa）屬于大型底棲海洋綠藻，其結(jié)構(gòu)較為簡單，由2層細(xì)胞組成，廣泛生長在太平洋沿岸海域的中、低潮帶的巖石和石沼上，具有食用、藥用和工業(yè)生產(chǎn)等多種應(yīng)用價值［1－2］.干露下的孔石莼是組成海岸帶生態(tài)系統(tǒng)中的重要海藻物種，它對于漲潮時的海水淹沒和退潮時的水面露出具有很強的適應(yīng)性，同時也是開展海藻抗逆機理研究的理想實驗材料.由于潮間帶大型海藻同時受鹽度、溫度、各種離子濃度及光照等因素的影響，因此，它們干露下的響應(yīng)機制較為復(fù)雜.目前，關(guān)于羊棲菜（Sargassumfusiforme）、石莼（Ulvalactuca）、壇紫菜（Porphyrahaitanensis）等海藻在干露狀態(tài)下的生長、發(fā)育、光合作用等生理生化的研究已有報道［3－5］，而在干露條件下關(guān)于孔石莼的生理生化指標(biāo)變化的報道較少.劉力等［6］對石莼和孔石莼在干露失水條件下的光合速率及呼吸速率進行了測定，發(fā)現(xiàn)藻體隨晾干時間的增加其光合速率逐步下降，且不同程度的晾干失水對藻體的呼吸均有一定的促進作用；吳倩倩等［7］以光照條件下的干露脅迫對孔石莼的生理影響進行了初步研究，發(fā)現(xiàn)其各種生理指標(biāo)也有不同程度的上升和下降.研究發(fā)現(xiàn)，黑暗條件對藻類的生理也具有重要影響.蔡卓平等［8］發(fā)現(xiàn)，黑暗環(huán)境明顯抑制了三角褐指藻體內(nèi)生化物質(zhì)的合成與積累，其葉綠素a和可溶性糖的含量與對照組相比分別降低了約89%和87%，說明三角褐指藻在黑暗環(huán)境中具有一定的適應(yīng)忍耐力；李杰等［9］在對微囊藻衰亡的生理機制的研究中發(fā)現(xiàn)，在黑暗條件下葉綠素a的含量呈下降趨勢，而其抗氧化酶系統(tǒng)的一些相關(guān)生理指標(biāo)則呈顯著上升的趨勢.本研究以孔石莼的葉狀體為材料，將其在黑暗條件下干露脅迫處理（不同時間段），測定其藻體的葉綠素a、脯氨酸、丙二醛、可溶性糖的含量和POD活性的變化，探討黑暗與光照下的干露脅迫對孔石莼某些生理、生化指標(biāo)的影響，為深入研究孔石莼適應(yīng)干露脅迫的生理機制提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 孔石莼的采集、預(yù)培養(yǎng)及脅迫處理

孔石莼于大潮時采集自大連付家莊海域的礁石上.采集時取個體完整并淹沒于海水中的藻體，采集后立即盛于采集箱中運至實驗室.采集地點的海水表面溫度為（5±1）℃，鹽度為（35±1）mg／L.按照下述培養(yǎng)條件在光照培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)10 d，即光照強度為100μmol／m2·s，溫度為（5±1）℃，鹽度初始值為（35±1）mg／L，光周期為12∶12（L∶D），然后用滅菌的海水通氣保存?zhèn)溆茫颐刻烊扛鼡Q海水.實驗時用滅菌的海水清洗藻體表面以去除雜質(zhì)，然后將其平鋪在直徑為90 mm的滅菌培養(yǎng)皿中，置于光照培養(yǎng)箱（暗箱）中進行黑暗條件下的干露脅迫處理，溫度為（15±1）℃，光周期為12∶12.

孔石莼在自然條件下平均每天暴露于空氣中的時間大約在6 h左右［10］，所以以黑暗條件下經(jīng)干露處理0、0.5、1、2、4、6 h為收集材料時間點.以新鮮藻體作為未處理的對照組（未經(jīng)干露處理），并且每個處理組和對照組都設(shè)置3個平行實驗，以此最終測定各項生理指標(biāo)的變化.按照上述方法在光照培養(yǎng)箱中將干露處理6 h后的藻體放入海水中恢復(fù)，然后每隔0.5 h測定各生理指標(biāo)（共5次），最后以各指標(biāo)的含量來判斷恢復(fù)的程度.

1.2 生理指標(biāo)的測定方法

依據(jù)文獻［11］，葉綠素a的含量測定采用乙醇法，脯氨酸的含量測定采用酸性茚三酮法，可溶性糖和丙二醛的含量測定采用三氯乙酸一硫代巴比妥酸法，過氧化物酶（POD）的活性測定采用愈創(chuàng)木酚法.

2 實驗結(jié)果

2.1 葉綠素a含量的變化

如圖1所示，與對照組相比，在同樣的溫度（15℃）條件下，處理時間為0.5 h和1 h時，孔石莼中葉綠素a的含量略有下降，變化并不顯著；當(dāng)處理時間為2 h時，葉綠素a含量的下降程度較之前稍有明顯；當(dāng)處理時間為4 h時，葉綠素a的含量下降顯著，與對照組相比呈顯著差異（0.01＜P＜0.05）；當(dāng)處理6 h后，葉綠素a的含量下降呈極顯著差異（P＜0.01）.

圖1 葉綠素a含量隨不同干露時間的變化

把經(jīng)過6 h脅迫處理后的孔石莼放入海水中做恢復(fù)實驗，實驗結(jié)果如圖2所示.由圖2可以看出，葉綠素a的含量隨恢復(fù)時間略呈上升趨勢，但并不明顯，在3 h時恢復(fù)得最多（58.1%）.可見，在黑暗條件下，隨著干露處理時間的延長，孔石莼中葉綠素a的含量呈逐漸下降的趨勢，并且時間越長，下降趨勢越顯著；經(jīng)脅迫后的補水恢復(fù)實驗仍未達到對照組的程度，說明孔石莼中的葉綠素a受脅迫影響較大.

圖2 脅迫6 h后葉綠素a含量隨不同恢復(fù)時間的變化

2.2 脯氨酸含量的變化

孔石莼中脯氨酸含量的變化如圖3所示.由圖3可以看出，隨著脅迫處理時間的延長，脯氨酸的含量呈明顯的上升趨勢；當(dāng)處理時間為1 h時，脯氨酸含量呈極顯著差異（P＜0.01）；當(dāng)處理時間為2 h時呈顯著差異（0.01＜P＜0.05）；當(dāng)處理時間為4 h和6 h時呈極顯著差異（P＜0.01）.脅迫6 h后的補水恢復(fù)實驗結(jié)果如圖4所示.由圖4可以看出，在1.5 h時脯氨酸的含量呈明顯下降趨勢，在3 h時其含量為對照組含量的324%.此結(jié)果表明，當(dāng)脅迫處理4 h后，脯氨酸的含量開始急劇上升，再經(jīng)補水恢復(fù)其含量呈下降趨勢，由此可推斷脯氨酸可能是參與孔石莼滲透調(diào)節(jié)的主要物質(zhì)之一.

圖3 脯氨酸含量隨不同干露時間的變化

圖4 脅迫6 h后脯氨酸含量隨不同恢復(fù)時間的變化

2.3 可溶性糖含量的變化

孔石莼中可溶性糖含量的變化如圖5所示.與對照組相比，黑暗條件下經(jīng)干露處理后可溶性糖的含量均呈逐漸上升趨勢，其中處理時間在2～6 h時，可溶性糖的含量均呈明顯的上升趨勢，且均呈極顯著差異（P＜0.01）.圖6為脅迫6 h后可溶性糖含量隨不同恢復(fù)時間的變化.圖6顯示，恢復(fù)時間為0.5 h時，可溶性糖的含量呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢，在3 h時達到對照組含量的1.24%.這表明，隨著脅迫時間的延長，可溶性糖的含量大量積累，這與體內(nèi)脯氨酸含量的變化趨勢相似.從隨后的補水恢復(fù)實驗可以看出，可溶性糖的含量有緩慢恢復(fù)的趨勢，這表明可溶性糖也可能是參與藻體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)的主要物質(zhì)之一.

圖5 可溶性糖含量隨不同干露時間的變化

圖6 脅迫6 h后可溶性糖含量隨不同恢復(fù)時間的變化

2.4 丙二醛（MDA）含量的變化

從圖7可看出，黑暗條件下的干露脅迫會導(dǎo)致孔石莼體內(nèi)MDA含量的逐漸上升，且隨著處理時間的延長，MDA的積累量不斷增加.與對照組相比，隨著脅迫時間的延長及膜質(zhì)過氧化的出現(xiàn)，使得在處理時間為0.5 h時MDA的含量呈極顯著差異（P＜0.01）；在處理時間為2 h和4 h時呈顯著差異（0.01＜P＜0.05）；在處理時間為6 h時其含量達到最大值，而且呈極顯著差異（P＜0.01）.脅迫6 h后的補水恢復(fù)實驗結(jié)果如圖8所示.圖8顯示，當(dāng)恢復(fù)時間為1 h時MDA的含量呈顯著下降趨勢，在2 h時達到最低點，此時MDA的含量為對照組的104%.

圖7 丙二醛含量隨不同干露時間的變化

圖8 脅迫6 h后丙二醛含量隨不同恢復(fù)時間的變化

2.5 POD活性的變化

由圖9可以看出，隨著干露脅迫時間的延長，孔石莼的POD活性呈上升趨勢.與對照組相比，在處理時間為0～1 h時，POD活性呈緩慢上升，差異并不顯著；當(dāng)處理時間超過2 h后，POD活性呈明顯上升趨勢，呈極顯著差異（P＜0.01）.脅迫處理6 h后的補水恢復(fù)實驗結(jié)果如圖10所示.由圖10可以看出，隨著恢復(fù)時間的延長，POD活性呈下降趨勢，在3h時達到最低，此時POD活性為對照組的415%.

圖9 POD活性隨不同干露時間的變化

圖10 脅迫6 h后POD活性隨不同恢復(fù)時間的變化

3 討論

葉綠素是光合作用中最重要和最有效的色素，它能影響植物的生長，其含量在一定程度上能反映植物同化物質(zhì)的能力［12］.在黑暗條件下干露脅迫處理孔石莼并測定其葉綠素a的含量發(fā)現(xiàn)，隨著脅迫處理時間的延長，葉綠素a的含量隨之下降，這主要是由于缺水而造成的［13］：一方面，隨著脅迫時間的延長，葉綠素a的破壞程度逐漸增加；另一方面，在黑暗環(huán)境下，葉綠素a的合成受阻，這也會導(dǎo)致葉綠素a含量低于對照組，而且隨時間的延長其差異越顯著.

在干露缺水條件下，增強細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)能力的關(guān)鍵是需要主動積累細(xì)胞中滲透調(diào)節(jié)的物質(zhì)，脯氨酸和可溶性糖是植物中理想的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)［14－15］.在黑暗條件下經(jīng)干露脅迫處理后的孔石莼，其脯氨酸和可溶性糖的含量均呈上升趨勢，這與趙素達等［16］報道的鹽脅迫對孔石莼中脯氨酸含量的影響相似.細(xì)胞內(nèi)滲透勢的大小取決于溶質(zhì)的濃度，脯氨酸和可溶性糖的變化有利于對藻體細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)，從而可以使藻類適應(yīng)潮間帶環(huán)境的劇烈變化.

MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量的高低可反映細(xì)胞膜脂過氧化的程度［17］.有研究［18］表明，MDA含量會隨著干露處理程度的加深而升高，在脅迫初期其含量的上升較慢，但達到一定程度后就會迅速上升.本研究中，MDA含量在處理前期時上升較為緩慢，但處理2 h后呈現(xiàn)顯著的上升趨勢，這說明經(jīng)脅迫處理后的孔石莼，其藻體細(xì)胞膜可能會遭到不同程度的傷害，并且隨著處理時間的延長其傷害會越大；但經(jīng)復(fù)水處理后，可以緩解由脅迫造成的膜的傷害與膜脂過氧化作用的影響，從而使 MDA積累量降低［19］.當(dāng)植物體受到水分脅迫時，可誘導(dǎo)體內(nèi)POD活性增加，從而起到保護生物膜的作用［20］；盡管POD活性顯著增加，但在逆境條件下藻體內(nèi)生成的活性氧仍超過POD等抗氧化酶系的清除能力，使得部分未能清除的活性氧引起膜脂過氧化，表現(xiàn)為MDA含量增加，從而導(dǎo)致一定程度膜系統(tǒng)受到傷害［21］.有研究［22］報道，高等植物中 POD 活性在黑暗條件下出現(xiàn)下降，但關(guān)于其在藻類中的變化規(guī)律及其生理機制還有待進一步研究.

本研究中的孔石莼具有很強的滲透調(diào)節(jié)能力，在干露脅迫條件下，其藻體細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了一系列適應(yīng)生理機制的變化，使其能夠降低由脅迫所帶來的傷害，從而適應(yīng)潮間帶劇烈的環(huán)境變化；各指標(biāo)在復(fù)水后均有不同程度的恢復(fù)，但都高于對照組，這可能是因為一定的脅迫會對細(xì)胞造成部分不可逆的傷害，即使正常的復(fù)水條件也不能完全恢復(fù).在直接光照［9］和黑暗處理的兩種不同環(huán)境條件下，即使是同樣的脅迫處理程度，孔石莼體內(nèi)的生理變化也表現(xiàn)出一定的差異，但各指標(biāo)的上升和下降趨勢都基本一致，其中黑暗條件所產(chǎn)生的變化更加明顯，這對于繼續(xù)探明潮間帶藻類適宜各種環(huán)境的生理機制具有重要的意義.

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Effects of drought exposure on the physiology index of Ulva pertusa in the dark

YANG Fan，LI Shi－guo，TONG Shao－ming，HOU He－sheng＊
（CollegeofLifeSciences，LiaoningNormalUniversity；KeyLaboratoryofPlantBiotechnologyof LiaoningProvince，Dalian116081，China）

Some physiological indices including the contents of chlorophyll a，proline，soluble sugar，MDA and the activity of POD ofUlvapertusain the dark under drought exposure stress at different times（0，0.5，1，2，4，6 h）are measured and recorded.The results showed that all the physiological indices measured ascended except for the chlorophyll a by contrast with controling untreatedUlvapertusa，the content of proline and the activity of POD are both ascended sharply after 4 hours treatment among them；all the indexes are recovered in different degrees after stress for 6 hours recovering.It shows that the algae has an ability to adapt drought exposure stress in the dark physiologically and biochemically，and the results provid some references for researchers who study the mechanism of drought exposure resistance.

Ulvapertusa；dark；drought stress；physiological indice

Q954.78

A

1004－4353（2012）01－0054－05

2011－12－17＊通信作者：侯和勝（1955—），男，教授，研究方向為海藻發(fā)育與分子生物學(xué).

中國科學(xué)院實驗海洋生物學(xué)重點實驗室開放基金資助項目（kf－2008023）