秸稈降解菌劑對(duì)秸稈還田土壤中細(xì)菌種群數(shù)量的影響

吳紅艷，王智學(xué)，陳飛，郭玲玲，修翠娟

(遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧朝陽(yáng)122000)

我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，秸稈資源十分豐富。秸稈是農(nóng)作物的主要副產(chǎn)物，也是一種重要的生物資源。目前對(duì)于如何將秸稈合理利用的研究主要集中在以下3個(gè)方面:①直接將秸稈還田以增加土壤肥力;②利用微生物發(fā)酵農(nóng)作物秸稈生產(chǎn)蛋白飼料;③用秸稈纖維素生產(chǎn)酒精和甲烷。隨著農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化的迅猛發(fā)展，秸稈還田特別是直接還田越來(lái)越受到重視。一方面是大規(guī)模的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，秸稈需要就近處理，以節(jié)省勞力;另一方面，長(zhǎng)期單純施用化肥不利于土壤肥力的發(fā)育。秸稈還田技術(shù)的效應(yīng)主要表現(xiàn)在以下5個(gè)方面［1-2］:養(yǎng)分效應(yīng)、改土效應(yīng)、微生物學(xué)效應(yīng)、經(jīng)濟(jì)效應(yīng)和環(huán)境效應(yīng)。其中微生物學(xué)效應(yīng)是十分重要的。土壤微生物是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中重要的一員，具有分解有機(jī)物和凈化土壤的作用，土壤酶活是微生物活動(dòng)的基本反應(yīng)，秸稈還田激發(fā)了土壤微生物的生長(zhǎng)［3］，改變了土壤微生物的生長(zhǎng)狀況，提高了土壤有益微生物類(lèi)群的數(shù)量，顯著地提高了土壤中脲酶、轉(zhuǎn)化酶和過(guò)氧化氫酶活性，加速了有機(jī)物質(zhì)的分解和營(yíng)養(yǎng)元素的礦化。整個(gè)過(guò)程中，土壤微生物量都處于動(dòng)態(tài)的變化中［4］。研究秸稈降解專(zhuān)用菌種施用后耕層土壤微生物群落的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，并總結(jié)這些變化規(guī)律與相關(guān)酶活性、地上植物生長(zhǎng)情況和產(chǎn)量之間的關(guān)系具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品實(shí)驗(yàn)用土壤樣品為秸稈降解菌劑施用后定期取得。

1.1.2 土壤樣品采集時(shí)間秸稈降解菌劑施用后每15 d收取1次。

1.1.3 試劑DV805膠回收試劑盒、溶菌酶、Taq酶、丙烯酰胺、甲酰胺。

1.1.4 儀器高速冷凍離心機(jī)、恒溫水浴鍋、PCR儀、DGGE電泳系統(tǒng)(TV400)。

1.2 方法

1.2.1 采樣方法去除表層土壤于秸稈上0～20 cm處采集。

1.2.2 土壤粗基因組DNA的提?。?］將1 g土壤加2 mL PBS(0.12 mol/L磷酸鈉緩沖液pH 8.0)，置于30℃搖床150 r/min振蕩15 min，5 000 r/min離心15 min，重復(fù)1次，取沉淀加溶解液1(0.15 mol/L NaCl，0.1 mol/L EDTA)1.5 mL、50 mg/mL溶菌酶0.5 mL，37℃水浴2～3 h后，加溶解液2(0.1 mol/L NaCl，0.5 mol/L Tris，10%SDS)2 mL，-20℃冰浴、65℃水浴循環(huán)3次，5 000 r/min離心15 min，取上清與等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)混合物抽提2次，異丙醇沉淀，雙蒸水溶解。

1.2.3 土壤粗基因組DNA純化將1.2.2所提取的土壤基因組DNA進(jìn)行低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖濃度為0.9%，在紫外燈下切取目的條帶置于EP管中，并利用DV805A膠回收試劑盒，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純化回收。

1.2.4 土壤細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增引物為16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增的通用引物并在其中加入GC夾子，序列為:W357:CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGGCCTACG GAGGCAGCAG，W518:ATTACCGCGGCTGCTGG。擴(kuò)增體系見(jiàn)表1。

表1 擴(kuò)增體系(20 μL)Table 1 System of amplification

擴(kuò)增條件:采用降落式PCR，每個(gè)循環(huán)溫度降低0.5℃。

1.2.5 DGGE電泳分離土壤細(xì)菌16S rDNA V3擴(kuò)增片段［6］①聚丙烯酰胺凝膠組成見(jiàn)表2;②DGGE電泳條件［7］:變性劑濃度為35%～55%，電壓為200 V，溫度60℃，蠕動(dòng)泵流速為5 mL/min。

表2 聚丙烯酰胺凝膠組成Table 2 Composition of gel of polyacrglamide

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤粗基因組DNA的提取結(jié)果

從土壤粗基因組DNA的提取結(jié)果可以看出，在片段大小為23 kb附近有1條濃度較高的DNA條帶，說(shuō)明土壤中細(xì)菌豐度較高，可以進(jìn)行純化、回收，并進(jìn)行下一步相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 土壤粗基因組DNA純化結(jié)果

從土壤粗基因組DNA純化結(jié)果可以看出20 kb附近有1條濃度較高的DNA帶，濃度可以進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2.3 土壤細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增結(jié)果

從土壤細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增結(jié)果可以看出，在250 bp附近有1條濃度很高的DNA條帶，濃度大概在300 ng左右，純度為較單一條帶，即PCR產(chǎn)物完全可以用于DGGE電泳進(jìn)一步分離，同時(shí)進(jìn)行分析。

圖3 土壤細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增Fig.3 Results of amplification for 16S rDNA V3

2.4 DGGE電泳分離土壤細(xì)菌16S rDNA V3擴(kuò)增片段結(jié)果

從DGGE電泳結(jié)果可以看出，在作物整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中，中期條帶較亮，表明濃度較高，后期逐漸變淡，說(shuō)明菌落數(shù)量呈現(xiàn)前期上升、中期最高、后期逐漸降低的趨勢(shì)。同時(shí)秸稈降解菌劑施用后土壤樣品條帶與基質(zhì)和空白對(duì)照相比條帶明顯明亮，條帶較粗，說(shuō)明種群豐度較高。

圖4 DGGE電泳分離土壤細(xì)菌16S rDNA V3擴(kuò)增片段Fig.4 Results of amplification for 16S rDNA V3 by DGGE

3 結(jié)論與討論

從本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果并結(jié)合作物整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中纖維素酶、半纖維素酶、漆酶等相關(guān)活性定期檢測(cè)(酶活性與種群數(shù)量的關(guān)系另文敘述)結(jié)果可以得出初步結(jié)論，秸稈還田或者秸稈降解劑施入后土壤中種群數(shù)量有所增加，考慮原因可能是由于秸稈還田或者秸稈降解劑的施入對(duì)土壤中細(xì)菌種群起到了很好的激活作用［8］，使其總菌群數(shù)量增加，同時(shí)使土壤中的纖維素酶、半纖維素酶、漆酶等相關(guān)酶活性明顯提高，達(dá)到更好的降解秸稈的效果，并明顯提高了土壤的肥力，更好地促進(jìn)了作物生長(zhǎng)，從而起到增產(chǎn)的作用。

目前，雖然對(duì)秸稈還田在分解速度、增加土壤養(yǎng)分、改良土壤理化性質(zhì)、降解秸稈的微生物種類(lèi)和微生物產(chǎn)生的分解秸稈的主要酶等方面已進(jìn)行了較深入的研究，但在微生物作用的不同階段優(yōu)勢(shì)菌群的種類(lèi)、秸稈全部還田后如何加速其降解以及菌落的演替規(guī)律等仍有許多方面需要利用分子生物學(xué)如DGGE電泳后進(jìn)行切膠回收、序列測(cè)定、BLAST比對(duì)等手段進(jìn)行相關(guān)研究。

研究表明，秸稈生物降解菌種能夠快速腐解秸稈，并能改良土壤，從而達(dá)到增產(chǎn)的效果，因而在秸稈還田同時(shí)按比例施入秸稈生物降解菌種，使秸稈快速腐熟，達(dá)到省工、省時(shí)的目的，此技術(shù)具有廣闊的發(fā)展前景。

［1］ 劉娣，范丙全，龔明波.秸稈還田技術(shù)在中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展中的作用［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，24(6):404-407.

［2］ 宮曼麗，任南琪，邢德峰.DGGE/TGGE技術(shù)及其在微生物分子生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用［J］.微生物學(xué)報(bào)，2004，44(6):845-848.

［3］ 周琳，張曉君，李國(guó)勛，等.DGGE/TGGE技術(shù)在土壤微生物分子生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2006，(5):67-71.

［4］ 沈洪，汪虹，趙永昌，等.采用變性梯度凝膠電泳研究羊肚菌土壤真菌群落結(jié)構(gòu)［J］.食用菌通報(bào)，2009，16(2):6-9.

［5］ 杜濤，黃小毛，侯明生，等.從土壤中提取DNA用于PCR擴(kuò)增［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2003，30(6):1-5.

［6］ 黃進(jìn)勇，岳彩鵬，周偉.麥田土壤細(xì)菌群落16S rDNA V3片段PCR產(chǎn)物的DGGE分析［J］.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，41(4):396-400.

［7］ 卜元卿，黃為一.稻秸對(duì)土壤細(xì)菌群落分子多態(tài)性的影響［J］.土壤學(xué)報(bào)，2005，42(2):270-276.

［8］ 尹淑麗，張麗萍，張根偉，等.復(fù)合微生態(tài)菌劑對(duì)黃瓜根際土壤微生物數(shù)量及酶活的影響［J］.微生物學(xué)雜志，2012，32(1):23-27.