香菇雜交菌株遼香1號的初步鑒定

張海濤，李莉，陳飛，冀寶營，敖靜，柴林山，郝捷

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧沈陽110161;2.遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧朝陽122000)

香菇屬于真菌門，擔(dān)子菌綱，傘蘑目，口蘑科，學(xué)名Lentinus edodes，是世界上著名的食用菌之一，約占食用菌總產(chǎn)量的15%。其味道鮮美，香味宜人，并具有一定的食療價(jià)值，是一種重要的商品菇類［1］。香菇品質(zhì)的好壞與品種有很大的關(guān)系，所以優(yōu)良品種的選育尤為重要。本實(shí)驗(yàn)以香菇申香4號、L26菌株為親本，利用原生質(zhì)體單核化技術(shù)，采用對稱雜交和非對稱雜交方法進(jìn)行雜交，通過數(shù)年栽培試驗(yàn)篩選獲得1株高產(chǎn)、高抗、短柄的新菌株—Liao1。形態(tài)學(xué)鑒定、同工酶實(shí)驗(yàn)、ITS序列分析等是較常見且簡單實(shí)用的菌株鑒定方法［2］。本文采用上述方法對香菇菌株Liao1進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源本實(shí)驗(yàn)室雜交選育的菌株Liao1，實(shí)驗(yàn)室保藏香菇菌15株，共16株。

1.1.2 培養(yǎng)基①PDA綜合培養(yǎng)基:土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，MgSO40.5 g，KH2PO42 g，維生素B10.04 g;②液體培養(yǎng)基:未加瓊脂的PDA綜合培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定①子實(shí)體形態(tài)觀察:通過觀察子實(shí)體的菌蓋、鱗片、子實(shí)層、菌柄等形態(tài)特征對此香菇品種有初步的了解;②菌絲體形態(tài)觀察:制作菌絲玻片，于光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲特征［3］。

1.2.2 菌種活化將分離的菌株及實(shí)驗(yàn)室保藏的菌株在PDA綜合培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)10 d，活化后的菌種直接用于拮抗實(shí)驗(yàn)、粗酶液的提取以及DNA的提取。

1.2.3 拮抗試驗(yàn)將活化后的菌種用打孔器取菌落邊緣生長旺盛的同齡菌絲體接種于PDA綜合培養(yǎng)基平板上，并做好標(biāo)記(接種情況:每個(gè)平皿接一分離菌株和2個(gè)各不相同的實(shí)驗(yàn)室保藏菌株，共計(jì)7組，每組做2個(gè)重復(fù))。25℃靜置培養(yǎng)，2周后觀察菌株生長交界處的拮抗反應(yīng)情況。1.2.4同工酶實(shí)驗(yàn)①聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑(汪家政，2002)［4］:A液—丙烯酰胺儲存液(30%(質(zhì)量體積比)丙烯酰胺，0.8%(質(zhì)量體積比)雙丙烯酰胺);B液—4×分離膠緩沖液(1.5 mmol/L Tris-HCl，pH 8.8);C液—4×濃縮膠緩沖液(0.5 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8);AP液—過硫酸銨溶液(1%(質(zhì)量體積比);電極Buffer—10×(50 mmol/L Tris，284 mmol/L Gly，pH 8.8);提取Buffer—1×(0.125 mmol/L Tris-HCl，20%(質(zhì)量體積比)甘油，pH 6.0);指示劑—100×(1%(質(zhì)量體積比)溴酚蘭);②菌絲體培養(yǎng)及粗酶液提取:將菌種活化后接種于液體培養(yǎng)基中，放25℃，170 r/min搖床上震蕩培養(yǎng)1周左右。取培養(yǎng)好的菌絲，用無菌水洗去培養(yǎng)基，用無菌濾紙吸取水分。然后稱取0.3 g放入研缽中，液氮研磨，將研磨產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管中，加0.6 mL提取緩沖液，混勻，10 000 r/min，4℃離心7 min，上清液即為粗酶液，放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫?］;③電泳:采用垂直聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，1.5 mm凝膠，7.5%分離膠，3%濃縮膠。電極緩沖液pH 8.8，溴酚蘭為指示劑，每孔點(diǎn)樣40 μL，穩(wěn)流電泳，濃縮膠電流為20 mA，待指示劑進(jìn)入分離膠，電流變?yōu)?5 mA，當(dāng)指示劑距膠板底部1 cm時(shí)停止電泳［6］;④染色:α-蔡醋乙酸25 mg，β-蔡醋乙酸25 mg，固蘭RR鹽50 mg，用3 mL丙酮溶解后，加入0.2 mol/L、pH 6.5的磷酸緩沖液72 mL，過濾。注意酯酶同工酶染色液要隨用隨配。電泳后將凝膠小心剝離，先用蒸餾水漂洗1次，轉(zhuǎn)移到染色液中，25℃染色10 min，待條帶清晰顯色后，蒸餾水漂洗幾次，用凝膠成像儀和相機(jī)拍照。注意在操作過程中要戴手套，以免污染。

1.2.5 菌株分子鑒定①ITS-5.8S rDNA序列擴(kuò)增與測序:以SDS法提取菌株DNA，以引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'20 bp)和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'19 bp)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性98℃，5 min;變性95℃，35 s;延伸72℃，40 s;35個(gè)循環(huán)，最終72℃，充分延伸8 min。由PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果切割所需DNA目的條帶，交由上海生物工程有限公司完成測序;②系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建:將菌株的ITS-5.8S rDNA測序結(jié)果提交GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，使用Bioedit將與之同源性較高的序列進(jìn)行Clustalw比對，通過MEGA軟件采用鄰位相鄰法作出系統(tǒng)發(fā)育樹［7］。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

2.1.1 子實(shí)體形態(tài)觀察①菌蓋形態(tài):平面為圓形，側(cè)面為圓凸形，縱切面為拱形;直徑7.0 cm左右，上表皮褐色，厚度2 cm左右，肉質(zhì)肥而厚;②鱗片形態(tài):鱗片分布于菌柄與子實(shí)層之間，覆在子實(shí)層上;約0.3 cm寬，2.5 cm長，0.08 cm厚，顏色透明;③子實(shí)層形態(tài):圓餅狀，棉絮狀排列;寬2.0 cm左右，密度大，乳白色;④菌柄形態(tài):圓柱形(上粗下細(xì))，長4.0 cm左右。菌蓋直徑與菌柄長度比例為325∶100，菌柄粗細(xì)為1.5 cm左右;菌蓋直徑與菌柄直徑的比例為43∶10;菌柄表面淺褐色，有毛，以纖維狀肉質(zhì)為主。Liao1子實(shí)體形態(tài)如圖1所示。

2.1.2 菌絲體形態(tài)觀察活化后的菌株用打孔器打孔接種于PDA綜合培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)7 d觀察菌落，Liao1菌絲白色絨狀。1 000倍光學(xué)顯微鏡下觀察，Liao1菌絲形態(tài)見圖2。其菌絲有橫隔，較多分枝，有明顯的索狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)。

圖1 Liao1子實(shí)體形態(tài)Fig.1 Fruiting body morphology of Liao1

圖2 顯微鏡下Liao1菌絲形態(tài)(1 000×)Fig.2 Hyphal morphology of Liao1 under microscope(1 000×)

2.2 拮抗實(shí)驗(yàn)

拮抗結(jié)果見表1，供試菌株拮抗反應(yīng)見圖3。

表1 供試菌株間的拮抗反應(yīng)結(jié)果Table 1 The results of antagonist reaction between the strains

圖3 供試不同菌株間的拮抗Fig.3 For the antagonism between the different strains tested

由圖3可見，Liao1與L26、087、申香4沒有產(chǎn)生拮抗，親緣關(guān)系較近［2］。Chiu(1999)、代江紅(2001)分別在研究野生香菇遺傳多樣性和品種鑒定中使用拮抗試驗(yàn)，日本的香菇新品種登記制度也把拮抗反應(yīng)作為一個(gè)品種鑒定的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)拮抗反應(yīng)可以區(qū)分一定數(shù)量的菌株。

2.3 同工酶實(shí)驗(yàn)

供試菌株的酯酶同工酶圖譜見圖4。

圖4 供試菌株的酯酶同工酶圖譜Fig.4 Ester isoenzyme patterns of the strains tested

表2 供試菌株間酯酶同工酶相對遷移率Table 2 Used in the experiment strains esterase relative transfer rate

表3 保藏菌株與分離菌株的聯(lián)合系數(shù)(S)Table 3 Preservation strains and separation of the strains of the joint coefficient(S)

從香菇酯酶同工酶電泳結(jié)果顯示(圖4、表2)，香菇共出現(xiàn)14條酯酶同工酶條帶，其遷移率(R)均在0.426～0.792之間，除R=0.792的是所有菌株所共有的條帶外，其他13條均為多態(tài)性條帶。根據(jù)2個(gè)菌株之間酯酶同工酶酶譜相似值的估算，可算出2個(gè)菌株之間的聯(lián)合系數(shù)(S)［4］:

供試的13株菌株與Liao1間的聯(lián)合系數(shù)見表3。S在0～1之間，聯(lián)合系數(shù)越小說明2菌株間親緣關(guān)系越遠(yuǎn);反之，聯(lián)合系數(shù)越大說明2菌株間親緣關(guān)系越近［2］。由表3可以看出Liao1與L26 2菌株間的親緣關(guān)系最近(S=0.800);Liao1與L241 2菌株間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(S=0.125)。從結(jié)果上看，Liao1與親本L26親緣關(guān)系最近，但與申香4親緣關(guān)系也比較接近(S=0.667)。

2.4 菌株分子鑒定結(jié)果

菌株Liao1的ITS-5.8S rDNA序列分析:菌株Liao1的ITS-5.8S rDNA序列測定片段長度為649bp，序列提交GenBank，登錄號為JQ797413。將Liao1菌株的ITS-5.8S rDNA序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果顯示Liao1的ITS-5.8S rDNA序列與香菇屬的同源性最高，相似性大于99%，利用MEGA5.0的Maximum Likelihood進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，見圖5。從系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出菌株Liao1與JQ797416、FJ379267.1聚在同一分支，其置信度為66%，遺傳距離顯示菌株Liao1與JQ797416、FJ379267.1的遺傳距離最近，達(dá)到99.8%。遺傳距離顯示Liao1菌株與香菇屬的遺傳距離相近。結(jié)合形態(tài)觀察，參照《真菌鑒定手冊》，初步確定Liao1菌株屬于Lentinus edodes，但不同于其親本L26及申香4。

圖5 以ITS-5.8S rDNA序列同源性為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on the homology of ITS-5.8S rDNA sequences

3 討論

香菇菌種鑒定方法主要有形態(tài)學(xué)鑒定、拮抗、同工酶、核糖體DNA、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)等。就本實(shí)驗(yàn)而言:①形態(tài)學(xué)鑒定:形態(tài)學(xué)特征在真菌分類中占據(jù)重要的地位，特別適用于大型真菌類。但是真菌的某些形態(tài)特征容易受發(fā)育階段和環(huán)境因素的影響，如空氣濕度、溫度、通風(fēng)、培養(yǎng)基種類等因素都有可能影響其子實(shí)體的形態(tài)特征。因此單純利用形態(tài)特征進(jìn)行真菌菌株分類鑒別容易產(chǎn)生分歧。雖然不能單純用形態(tài)學(xué)進(jìn)行品種鑒別，但仍可以作為食用菌品種鑒別的一個(gè)指標(biāo)，用于食用菌品種鑒別的形態(tài)特征主要是子實(shí)體的形態(tài)特征。日本實(shí)行的香菇品種登記中把形態(tài)特征作為重要的鑒定指標(biāo);②拮抗雖被廣泛用于香菇的品種鑒定，但對于遺傳關(guān)系比較近的菌株來說，拮抗的分辨率不如DNA指紋圖譜高，一般在品種鑒定中和DNA指紋圖譜結(jié)合使用。如本實(shí)驗(yàn)中Liao1與其親本L26和申香4號就無拮抗反應(yīng);③在真菌的生化標(biāo)記中，酯酶同工酶的穩(wěn)定性最好，是目前菌種鑒定的常用方法。同工酶技術(shù)也有缺點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)材料的采集時(shí)間、采集部位和實(shí)驗(yàn)材料的培養(yǎng)條件都可能對同工酶譜產(chǎn)生影響(Micales，1986)［8］。故實(shí)驗(yàn)條件保持一致性很重要;④分子生物學(xué)方法能直接從DNA序列水平上反映真菌的遺傳關(guān)系，較形態(tài)學(xué)和生理生化指標(biāo)更客觀準(zhǔn)確，并且操作簡單，準(zhǔn)確性可靠，特異性高。因此應(yīng)用分子生物學(xué)方法從遺傳進(jìn)化角度闡明真菌種群之間和種群內(nèi)的分類關(guān)系是目前真菌分類研究的熱點(diǎn)。

通過本實(shí)驗(yàn)可以得出的初步結(jié)論為Liao1屬于Lentinus edodes，但有別于其親本申香4號、L26以及其他所供試菌株的，可以初步認(rèn)定為新菌株。

［1］ Shu-Tibng Chang.Mushroon Biology and Mushroon Products［M］.Chinese University press，1997:1-10.

［2］ 張瑞穎.香菇菌株多相鑒定鑒別技術(shù)研究［J］.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，5:18-23.

［3］ 劉士旺.真菌形態(tài)的幾種觀察方法［J］.生物學(xué)通報(bào)，1998，33(10):45.

［4］ 汪家政，范明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊［J］.北京:科學(xué)出版社，2002.

［5］ 張慶華，趙新海，鐘麗娟，等.酯酶同工酶分析鑒別生產(chǎn)用平菇菌種真實(shí)性研究［J］.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，41(6):10-12，26.

［6］ Toyomasu T，Zenyozi A.同工酶電泳法鑒別香菇菌株(湯衛(wèi)真譯)［J］.國外食用菌，1985，2:4-6.

［7］ 關(guān)艷麗，李莉，陳飛，等.1株產(chǎn)漆酶白腐真菌的篩選和鑒定［J］.微生物學(xué)雜志，2010，30(3):74-77.

［8］ 葉明，葉生梅，潘迎捷.香菇雙單雜交后代不同發(fā)育階段酯酶同工酶研究［J］.微生物學(xué)雜志，2005，25(1):54-56.