酸性半纖維素降解細(xì)菌的篩選與鑒定

徐有權(quán)，顧文杰，張發(fā)寶，徐培智，解開(kāi)治，王立群*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030;2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，廣東廣州510640)

農(nóng)作物秸稈是自然界中蘊(yùn)藏十分豐富的可再生資源，我國(guó)每年秸稈產(chǎn)量可達(dá)7億多噸［1］。近些年來(lái)，科學(xué)家們不斷探索有效利用秸稈廢棄物的方式。其中，將秸稈還田或用于堆制肥料，不但充分利用了資源、減少了污染，還能增加土壤有機(jī)質(zhì)，使土壤肥力提高，利于作物生長(zhǎng)，因此備受關(guān)注。但秸稈直接還田后在土壤中分解轉(zhuǎn)化的周期長(zhǎng)，難以作為當(dāng)季作物的肥源。而制約秸稈分解的關(guān)鍵問(wèn)題是由于秸稈含有大量難以分解的木質(zhì)素、纖維素和半纖維素，其中半纖維素占植物干重的35%［2］，在自然界中含量?jī)H次于纖維素。半纖維素通過(guò)化學(xué)鍵與木質(zhì)素連接，包裹在纖維之外，將木質(zhì)素和纖維素緊緊拉在一起，形成難分解的木質(zhì)纖維素［3］。半纖維素的快速分解是整個(gè)秸稈分解進(jìn)程中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，但目前研究的熱點(diǎn)主要集中在纖維素和木質(zhì)素降解菌的篩選［4］，而對(duì)半纖維素降解菌研究卻較少。本試驗(yàn)篩選出高效半纖維素降解土著微生物，保證其在土壤中具有較好的定植能力，并且能夠適應(yīng)我國(guó)南方酸性土壤環(huán)境，產(chǎn)酶能力穩(wěn)定。對(duì)所篩菌株進(jìn)行了鑒定以確保菌株的安全性，為半纖維素降解菌在今后的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品采自廣東省增城市周邊水稻土及田間富含腐爛稻稈的泥土。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L)初篩培養(yǎng)基:NH4NO32.0，K2HPO40.5，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.3，CaCl2·2H2O 0.2，K2SO40.1，NaCl 0.2，半纖維素15.0，瓊脂20.0，pH 5.0～6.0，121℃滅菌20 min;牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，瓊脂20.0，pH 5.0～6.0，121℃滅菌20 min，用于菌種的純化保藏;復(fù)篩培養(yǎng)基:K2HPO41.0，KH2PO41.0，NH4NO32.0，MgSO4·7H2O 0.2，酵母膏5.0，半纖維素20.0，pH 5.0～6.0，121℃滅菌20 min，倒雙層平板，下層為2%水瓊脂;液體發(fā)酵培養(yǎng)基:成分同復(fù)篩培養(yǎng)基，去除瓊脂即可。

1.1.3 主要儀器與試劑冷凍恒溫振蕩器(太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠);臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Sigma);電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);7200型可見(jiàn)分光光度計(jì)(尤尼柯(上海)儀器有限公司);人工氣候箱(寧波江南儀器廠);PCR儀(BIO-RAD);凝膠成像儀(BIO-RAD)。Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR和16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit購(gòu)自TaKaRa公司。Tris，Na2EDTA·2H2O，瓊脂糖及其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 半纖維素的制備將脫粒后的稻稈烘干，粉碎后加5倍體積水浸泡，135℃蒸煮0.5 h預(yù)處理，洗去灰分并破壞半纖維素-木質(zhì)素復(fù)合結(jié)構(gòu)［5］。過(guò)濾得濾渣，加10%NaOH(固液比為1 g∶15 mL)90℃處理2 h。冷卻后離心得濾液，用濃鹽酸調(diào)pH 4.5～5.0。加入與濾液等體積的95%乙醇沉淀半纖維素，離心收集沉淀，用無(wú)水乙醇洗滌2次，60℃烘干，研磨后過(guò)80目篩［6］。

1.2.2 菌種的初篩稱(chēng)取10 g樣品加入含90 mL無(wú)菌水的250 mL三角瓶中，200 r/min振蕩30 min后逐級(jí)稀釋?zhuān)∠♂尪葹?04～106倍樣品0.1 mL涂布初篩培養(yǎng)基平板，30℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)。挑取初篩平板上具有水解圈的菌落在牛肉膏蛋白胨平板上分離、純化。

1.2.3 菌種的復(fù)篩將初篩菌株點(diǎn)種于復(fù)篩培養(yǎng)基平板，每株點(diǎn)3個(gè)重復(fù)，以未點(diǎn)菌平板為對(duì)照，30℃培養(yǎng)，72 h后測(cè)量水解圈的直徑D(mm)及菌落的直徑d(mm)，并計(jì)算D/d值。將復(fù)篩菌株在牛肉膏蛋白胨斜面上連續(xù)傳代7次(每代間隔7 d)，測(cè)量各代水解圈直徑D與菌落直徑d，選擇D/d無(wú)明顯變化的菌株接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基測(cè)定半纖維素酶活力。

1.2.4 半纖維素酶活力測(cè)定刮取斜面菌種接入液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)接種子于含100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，接種量5%，同樣條件下發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵液經(jīng)離心(5 000 r/min，10 min)、過(guò)濾后液體即為待測(cè)酶液。移取酶液0.5 mL于20 mL刻度試管，加入pH 5.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液1.0 mL和1%半纖維素底物0.5 mL，50℃水浴中保溫10 min，取出立即按DNS法測(cè)定還原糖含量，以煮沸酶液為對(duì)照［2］。半纖維素酶活力(U/mL):在1 min內(nèi)水解半纖維素底物，產(chǎn)生1 μg木糖的酶量為1個(gè)酶活力單位(U)。酶活的計(jì)算公式如下:

X:半纖維素酶活力，U/mL;A:根據(jù)吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的木糖生成量，μg;N:樣品的稀釋倍數(shù);0.5:參與反應(yīng)的酶量，mL;10:反應(yīng)時(shí)間，min。

1.2.5 菌種鑒定①培養(yǎng)特征及生理生化試驗(yàn)參照伯杰氏手冊(cè)和常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［7-8］;②

16S rDNA序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育分析［9］:平板劃線得到待測(cè)菌單菌落，用滅菌槍頭挑取適量菌體，置于含有50 μL裂解液的滅菌EP管中。80℃熱變性15 min，低速離心，取5 μL上清液做為PCR反應(yīng)模板。用試劑盒擴(kuò)增基因組DNA。50 μL反應(yīng)體系:模板DNA 5 μL，PCR Premix 25 μL，F(xiàn)orward Primer 0.5 μL，Reverse Primer2 0.5 μL，dH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件:94℃5 min;94℃1 min，50℃1 min，72℃2 min，30個(gè)循環(huán);72℃5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物純化及測(cè)序由寶生物工程(大連)有限公司完成。將測(cè)序結(jié)果提交至NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)中進(jìn)行序列比對(duì)，獲得相關(guān)序列，利用ClustalX(Version 2.1)軟件進(jìn)行多序列匹配排列，以MEGA5.05軟件計(jì)算進(jìn)化距離，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

培養(yǎng)2 d即可在初篩平板上看到菌落，并且部分菌落周?chē)兴馊Τ霈F(xiàn)。隨著菌體的生長(zhǎng)，一些開(kāi)始沒(méi)有產(chǎn)生水解圈的菌落周?chē)渤霈F(xiàn)水解圈，通過(guò)初篩共有16株細(xì)菌可在以半纖維素為唯一碳源的初篩培養(yǎng)基上產(chǎn)生水解圈，命名為NB1～NB16。將它們點(diǎn)接到復(fù)篩培養(yǎng)基，結(jié)果表明:16株菌產(chǎn)生水解圈的早晚、大小及清晰度各不相同。NB13和NB16點(diǎn)種未產(chǎn)生水解圈，NB14和NB15水解圈微弱無(wú)法測(cè)量，點(diǎn)種結(jié)果詳見(jiàn)表1。對(duì)復(fù)篩菌種進(jìn)行傳代，淘汰不再生長(zhǎng)和生長(zhǎng)緩慢的菌株，最終選擇D/d值無(wú)明顯變化且比值較高的4株菌測(cè)定酶活。

表1 水解圈測(cè)定結(jié)果Table 1 The diameter of hydrolyzed circle of different strains

2.2 半纖維素酶活力測(cè)定

所篩菌株的半纖維素酶活測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，各菌株除NB6只有在第168 h酶活略有升高外，其余菌株均出現(xiàn)2個(gè)高峰。NB9在第48 h達(dá)到1個(gè)小高峰，酶活為51.12 U/mL;NB8和NB10第1個(gè)峰值分別在第72 h和第96 h，酶活為85.12 U/mL和84.57 U/mL。各菌株的第2個(gè)產(chǎn)酶高峰均為第168 h，其中NB8的酶活為105.73 U/mL，明顯高于其他菌株，差異極顯著(P＜0.01)。因此，從產(chǎn)酶時(shí)間和酶活兩方面綜合考慮，最終確定菌株NB8為進(jìn)一步研究對(duì)象。

圖1 半纖維素酶活力變化曲線Fig.1 Activition curve of hemicellulase

2.3 菌種鑒定

2.3.1 培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)特征菌株NB8在液體培養(yǎng)基表面形成網(wǎng)狀菌膜。在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上菌落形態(tài)為乳白色不透明、圓形凸起、邊緣整齊、表面褶皺、較濕潤(rùn)。染色結(jié)果為革蘭陽(yáng)性、桿狀、端生或側(cè)生鞭毛1至數(shù)根、無(wú)莢膜。

2.3.2 生理生化測(cè)定結(jié)果菌株NB8的主要生理生化指標(biāo)見(jiàn)表2。

表2 生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The physiological and biochemical characteristics

根據(jù)測(cè)得結(jié)果查閱菌種鑒定手冊(cè)，結(jié)合以上培養(yǎng)及形態(tài)特征可以判斷該菌與芽胞桿菌屬最為相近。

2.3.3 16S rDNA序列分析PCR產(chǎn)物測(cè)序后得到1 495 bp大小堿基序列。將測(cè)得序列提交至NCBI網(wǎng)站進(jìn)行序列比對(duì)(收錄號(hào):JQ038150)，與NB8同源性較高的均為芽胞桿菌屬，選取典型菌株，用ClustalX軟件進(jìn)行多序列匹配，以MEGA 5.05軟件計(jì)算進(jìn)化距離并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)。從圖中可以看到NB8與Bacillus pumilus聚于同一分支，親緣關(guān)系最近。綜合以上形態(tài)及生理生化特征，可以初步確定NB8為短小芽胞桿菌(Bacillus pumilus)。

圖2 菌株NB8的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 The phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain NB8

3 討論

從特定環(huán)境中篩選到的菌株，往往具有適合在這種環(huán)境中生存的能力。從水稻田及周邊腐爛稻稈中篩選的菌株，來(lái)源于田間，理論上認(rèn)為它們更適合作為發(fā)酵菌劑用于秸稈還田。

在菌株篩選中，有些菌株雖然初篩時(shí)水解圈較大或D/d值較高，然而經(jīng)過(guò)傳代后卻表現(xiàn)出不同程度的退化。D/d值最大的NB7在連續(xù)傳代后幾乎不再生長(zhǎng)，NB1、NB2和NB3也出現(xiàn)相同現(xiàn)象。而后將降解效果較穩(wěn)定的菌株進(jìn)行酶活測(cè)定，從產(chǎn)酶時(shí)間及酶活高低等方面綜合考慮，NB8效果最好，但NB8在復(fù)篩培養(yǎng)基上測(cè)得的D/d值卻并非最高。這說(shuō)明，對(duì)于高效半纖維素降解菌的篩選要綜合水解圈大小、D/d值、傳代穩(wěn)定性、產(chǎn)酶時(shí)間以及酶活力等多方面的數(shù)據(jù)進(jìn)行考慮。

從酶活測(cè)定結(jié)果可以看出，216 h里出現(xiàn)2次產(chǎn)酶高峰，這與孫迅等［6］研究結(jié)果相似。并且第2次酶活明顯高于第1次，總體呈上升趨勢(shì)。分析其原因，一方面半纖維素酶為誘導(dǎo)酶，在本實(shí)驗(yàn)中可能誘導(dǎo)產(chǎn)生了2種主要半纖維素酶組分，一種酶先作用于半纖維素高級(jí)結(jié)構(gòu)，暴露出部分亞基后誘導(dǎo)另一種酶的合成。另一方面，可能與菌株的產(chǎn)酶周期有關(guān)，在底物誘導(dǎo)下產(chǎn)生相應(yīng)的酶分解底物生成小分子的產(chǎn)物，產(chǎn)物積累到一定量后反過(guò)來(lái)抑制酶的合成，關(guān)于酶的產(chǎn)生及作用機(jī)制的研究還有待進(jìn)一步深入。

本試驗(yàn)中篩選的菌株經(jīng)生理生化和分子生物學(xué)方法鑒定為短小芽胞桿菌，該菌種可用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，安全可靠，72 h半纖維素酶活可達(dá)85.12 U/mL，這要高于孫迅等［6］在pH 6.5～8.5篩得短小芽胞桿菌(Bacillus pumilus)H-101半纖維素酶活(47.20 U/mL)和秦玉花［5］篩選的短小芽胞桿菌(B.pumilus)L2-19木聚糖酶活(1.68 U/mL)。慕娟等［10］篩選的短小芽胞桿菌(B.pumilus)M-26木聚糖酶最適作用pH為8.0，酶活為620 IU/mL。以上所篩選得到的芽胞桿菌均在中性偏堿條件下產(chǎn)酶活性較高。而本試驗(yàn)是在pH 5.0～6.0條件下篩選半纖維素分解菌，與同樣是酸性條件下篩選的菌株相比也具有較高的酶活力。秦玉花［5］篩選的枯草芽胞桿菌(B.sublitis)Y25最適反應(yīng)pH為6.0，酶活為1.87 U/mL。陳叢瑾［11］分離的1株木聚糖酶產(chǎn)生菌，初始pH為5.0時(shí)，木聚糖酶活為13.68 U/mL。

本試驗(yàn)篩選的具有高效降解半纖維素能力的細(xì)菌，其在酸性環(huán)境中生長(zhǎng)狀態(tài)良好，酶活較高，

后續(xù)應(yīng)對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)一步研究，尋找其最適的產(chǎn)酶條件，進(jìn)一步提高其產(chǎn)酶能力。另外，半纖維素降解菌降解半纖維素的能力不能簡(jiǎn)單通過(guò)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定D/d值和酶活加以反映，而是需要結(jié)合對(duì)秸稈的實(shí)際降解效果來(lái)綜合評(píng)定。

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