肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)喉返神經(jīng)損傷后再生的作用*

李孟 陳世彩 陳東輝 夏思文 李曉雨 鄭宏良

喉返神經(jīng)損傷后，再生的軸突數(shù)目不足及功能恢復(fù)不佳是影響喉功能恢復(fù)的重要原因。應(yīng)用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等生物活性因子促進(jìn)神經(jīng)軸突的再生，近年來已成為周圍神經(jīng)損傷修復(fù)研究中的一項(xiàng)重要突破。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)廣泛分布于全身各組織器官，是一種多效性細(xì)胞因子，具有多種功能。已有研究證實(shí)HGF對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有保護(hù)作用[1]，在坐骨神經(jīng)[2]、舌下神經(jīng)[3]及面神經(jīng)[4]等周圍神經(jīng)損傷后，局部給予外源性HGF對(duì)神經(jīng)元有保護(hù)作用并對(duì)軸突再生和誘向生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。HGF對(duì)喉返神經(jīng)損傷后修復(fù)的作用尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究通過制造犬單側(cè)喉返神經(jīng)損傷動(dòng)物模型后，用聚乳酸聚羥基乙酸共聚物[Poly(DL lactide co glycolide)，PLGA]管橋接喉返神經(jīng)斷端，并在局部應(yīng)用外源性HGF，觀察其對(duì)受損喉返神經(jīng)再生及功能恢復(fù)的作用，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康成年雜種犬20只，體重8.0～15.0 kg，雌雄不拘，購(gòu)于第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。首先制作單側(cè)喉返神經(jīng)損傷動(dòng)物模型：于第4氣管環(huán)水平、相當(dāng)于環(huán)狀軟骨下緣下2 cm處切斷實(shí)驗(yàn)犬左側(cè)喉返神經(jīng)并切除一段長(zhǎng)約5 mm的神經(jīng)，用11-0無創(chuàng)縫線套接神經(jīng)斷端入8 mm長(zhǎng)的PLGA管中，神經(jīng)斷端間距約5 mm；頸部皮瓣縫合前，測(cè)量橋接管與體表的距離；然后，將實(shí)驗(yàn)犬分為HGF組和對(duì)照組，每組10只。HGF組術(shù)中用微量注射器將HGF (50 ng/μl)10 μl注入PLGA管內(nèi),對(duì)照組同法注射等量的生理鹽水。HGF組和對(duì)照組術(shù)后隔日分別在相當(dāng)于神經(jīng)橋接處經(jīng)皮局部注射HGF 0.1 ml或等量生理鹽水1次，共1個(gè)月，注射深度以術(shù)中測(cè)量的結(jié)果為依據(jù)。所有動(dòng)物的右側(cè)喉返神經(jīng)不予處理，作為正常對(duì)照。

1.2電子喉鏡觀察聲帶運(yùn)動(dòng) 分別于兩組動(dòng)物術(shù)前、術(shù)后即刻、術(shù)后2、3、4個(gè)月時(shí)行電子喉鏡檢查，在平靜呼吸及麻醉變淺時(shí)，捏鼻刺激誘犬發(fā)聲，觀察雙側(cè)聲帶的形態(tài)、運(yùn)動(dòng)及聲門閉合情況。

1.3喉返神經(jīng)及喉肌的電生理檢查 每次喉鏡檢查后，按先前報(bào)告的方法[5]，以四導(dǎo)同心針電極記錄動(dòng)物雙側(cè)環(huán)杓后肌及甲杓肌在發(fā)音及呼吸狀態(tài)下的自發(fā)肌電位，并以波寬0.1 ms、電流強(qiáng)度為40～80 mA的電流在犬胸骨上窩、氣管食管溝間經(jīng)皮膚刺激左側(cè)喉返神經(jīng)橋接處近心端神經(jīng)及對(duì)側(cè)喉返神經(jīng)相同平面，記錄雙側(cè)甲杓肌的自發(fā)肌電位幅度、最大誘發(fā)電位幅度及其潛伏期，術(shù)側(cè)的自發(fā)肌電位幅度、最大誘發(fā)電位幅度及其潛伏期以其占該動(dòng)物健側(cè)的比例即恢復(fù)率(%)表示。

1.4再生的喉返神經(jīng)光鏡及超微結(jié)構(gòu)觀察 完成最后一次神經(jīng)電生理檢查后，即刻處死動(dòng)物。取神經(jīng)橋接處遠(yuǎn)端神經(jīng)干1 cm, 常規(guī)戊二醛固定，1%鋨酸后固定，梯度脫水，Epon812包埋，半薄切片，1%甲苯胺藍(lán)染色，在顯微鏡下用圖像分析系統(tǒng)計(jì)算再生有髓神經(jīng)纖維軸突數(shù)目、直徑及髓鞘厚度[6]。超薄切片，H-800透射電鏡下觀察再生神經(jīng)干的形態(tài)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS13.0軟件對(duì)兩組上述結(jié)果進(jìn)行兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)過程中因?yàn)榧膊　⒙樽淼仍?只犬死亡，其中HGF組死亡2只，對(duì)照組死亡3只。

2.1電子喉鏡觀察 術(shù)后2個(gè)月時(shí)兩組動(dòng)物術(shù)側(cè)聲帶均明顯縮短、固定于旁正中位，發(fā)聲時(shí)聲門有明顯裂隙。術(shù)后3個(gè)月時(shí)HGF組有4只犬聲帶恢復(fù)內(nèi)收及外展運(yùn)動(dòng)，但幅度較??；而對(duì)照組動(dòng)物仍未恢復(fù)運(yùn)動(dòng)。術(shù)后4個(gè)月時(shí)，HGF組存活的8只犬中有7只術(shù)側(cè)聲帶恢復(fù)內(nèi)收、外展運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)幅度均較大，1只犬術(shù)側(cè)聲帶仍固定于旁正中位；對(duì)照組存活的7只犬中5只犬術(shù)側(cè)聲帶恢復(fù)內(nèi)收及外展運(yùn)動(dòng)，但幅度小于HGF組，另2只犬術(shù)側(cè)聲帶固定于旁正中位。除3只未恢復(fù)運(yùn)動(dòng)的犬發(fā)聲時(shí)聲門后聯(lián)合有裂隙外，其余犬聲門裂隙不明顯，兩組犬健側(cè)聲帶活動(dòng)均正常。

2.2神經(jīng)電生理學(xué)檢查結(jié)果 術(shù)后2個(gè)月時(shí)兩組犬即可記錄到喉肌的自發(fā)與誘發(fā)電位，且HGF組的自發(fā)及誘發(fā)電位均明顯大于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后3個(gè)月時(shí)，二組犬的喉肌自發(fā)及誘發(fā)電位均明顯增強(qiáng)，潛伏期明顯縮短，與同組術(shù)后2個(gè)月時(shí)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HGF組三項(xiàng)觀察指標(biāo)均明顯優(yōu)于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后4個(gè)月時(shí)兩組的自發(fā)及誘發(fā)肌電位均進(jìn)一步增大，但與同組3個(gè)月時(shí)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，潛伏期進(jìn)一步縮短，與同組的3個(gè)月比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。盡管如此，術(shù)后4個(gè)月時(shí)HGF組的三項(xiàng)神經(jīng)電生理學(xué)觀察指標(biāo)均明顯優(yōu)于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

2.3再生神經(jīng)纖維形態(tài)學(xué)觀察 HGF組神經(jīng)橋接處遠(yuǎn)端的神經(jīng)干內(nèi)再生神經(jīng)纖維數(shù)量明顯多于對(duì)照組，有髓神經(jīng)纖維的直徑、髓鞘厚度均明顯大于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，但再生的神經(jīng)纖維數(shù)量仍然明顯少于健側(cè)喉返神經(jīng)，有髓神經(jīng)纖維的直徑、髓鞘厚度均明顯小于正常喉返神經(jīng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。透射電鏡下顯示HGF組再生神經(jīng)纖維直徑、髓鞘厚度以及同一放大倍數(shù)視野下神經(jīng)纖維數(shù)量均明顯大于對(duì)照組，形態(tài)結(jié)構(gòu)接近正常，而對(duì)照組形態(tài)結(jié)構(gòu)與健側(cè)神經(jīng)比較差異較大，可見較多的無髓神經(jīng)纖維(表2，圖1)。

表1 兩組動(dòng)物術(shù)后不同時(shí)間神經(jīng)肌電圖檢查結(jié)果

圖1 神經(jīng)干電鏡圖

組別動(dòng)物只數(shù)(只)神經(jīng)纖維數(shù)(根)神經(jīng)纖維直徑(nm)髓鞘厚度(nm)HGF組8211±27521±37148±25對(duì)照組7172±25438±42112±23二組健側(cè)15253±21593±33181±19

3 討論

喉返神經(jīng)損傷致聲帶麻痹是臨床上常見的疾病之一，盡管喉返神經(jīng)修復(fù)治療單側(cè)聲帶麻痹已取得令人鼓舞的效果[7]，但長(zhǎng)期損傷修復(fù)后的神經(jīng)功能恢復(fù)仍不理想。神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)能力主要依賴于軸突周圍的微環(huán)境而非其內(nèi)在特性，而神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)趨化生長(zhǎng)因子等是構(gòu)成周圍微環(huán)境的主要來源[8]。研究證實(shí)，應(yīng)用外源性生物因子，如睫狀神經(jīng)生長(zhǎng)因子(CTNF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)等，可促進(jìn)神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)，并有助于維持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的功能[9～11]。但上述生物活性因子對(duì)神經(jīng)軸突和神經(jīng)元保護(hù)作用的局限性導(dǎo)致其單獨(dú)應(yīng)用不能取得理想的效果，因?yàn)殚L(zhǎng)期失神經(jīng)后的肌肉萎縮和纖維化使得神經(jīng)、肌肉再生的微環(huán)境不理想，從而阻礙了神經(jīng)功能的理想恢復(fù)。

HGF最早于1984年從肝切除術(shù)后的殘余肝組織中發(fā)現(xiàn)，因其可刺激肝細(xì)胞合成DNA而命名為肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子。近來發(fā)現(xiàn)，HGF還是一種多效性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，在全身多處均有表達(dá)[12]，在神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)發(fā)育過程中有促進(jìn)作用[13]，并對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的發(fā)育、存活、軸突的生長(zhǎng)和導(dǎo)向、肌肉的營(yíng)養(yǎng)均有重要作用[14～16]。在外周神經(jīng)系統(tǒng)損傷或被切斷后，內(nèi)源性HGF及其受體c-Met 表達(dá)均增加，對(duì)神經(jīng)元有保護(hù)作用，對(duì)軸突有促生長(zhǎng)作用，并能促進(jìn)神經(jīng)纖維的修復(fù)[17]。Hashimoto等[2]發(fā)現(xiàn)大鼠坐骨神經(jīng)切斷模型中有HGF及其受體的表達(dá)，認(rèn)為HGF/c-Met參與調(diào)節(jié)坐骨神經(jīng)損傷后的再生修復(fù)過程；馮凱等[18]發(fā)現(xiàn)HGF能促進(jìn)大鼠坐骨神經(jīng)損傷后的有髓纖維再生，并促進(jìn)感覺、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維恢復(fù)。還有研究證實(shí)外源性應(yīng)用HGF對(duì)面神經(jīng)損傷后神經(jīng)干、神經(jīng)元及肌運(yùn)動(dòng)終板都有保護(hù)作用，同時(shí)HGF對(duì)面肌還有營(yíng)養(yǎng)作用[4，19]。唐金樹等[20]研究認(rèn)為HGF可以促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末梢在肌肉縫合界面的穿行，在失神經(jīng)支配后的肌肉中形成更多的運(yùn)動(dòng)終板結(jié)構(gòu)，因此應(yīng)用外源性HGF能促進(jìn)肌肉神經(jīng)再生。

有研究表明，周圍神經(jīng)軸突切斷后，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元上的HGFmRNA表達(dá)水平并不升高，因此其產(chǎn)生的內(nèi)源性HGF不足以維持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的功能[20]。提示在外周神經(jīng)損傷時(shí)，應(yīng)用外源性HGF甚為重要[21]。本研究通過切斷犬一側(cè)喉返神經(jīng)，用PLGA管將兩斷端橋接，HGF組局部應(yīng)用外源性HGF，術(shù)后2個(gè)月，盡管兩組的聲帶運(yùn)動(dòng)恢復(fù)情況不明顯，但電生理學(xué)檢查結(jié)果顯示HGF組均明顯優(yōu)于生理鹽水對(duì)照組。而術(shù)后4個(gè)月，HGF組的聲帶運(yùn)動(dòng)恢復(fù)情況明顯優(yōu)于生理鹽水對(duì)照組，且喉返神經(jīng)肌電圖自發(fā)電位與誘發(fā)電位幅度、潛伏期、再生神經(jīng)軸突計(jì)數(shù)、神經(jīng)纖維直徑及髓鞘厚度方面均優(yōu)于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此證明，喉返神經(jīng)切斷后局部給予HGF對(duì)喉返神經(jīng)再生修復(fù)具有促進(jìn)作用。另外，骨骼肌的營(yíng)養(yǎng)與再生是喉返神經(jīng)損傷后神經(jīng)修復(fù)治療效果的重要決定因素之一。失神經(jīng)支配使骨骼肌發(fā)生萎縮和纖維化，必需要有足夠的再生種子細(xì)胞和良好的再生微環(huán)境才能保證肌肉再生并獲得滿意的功能恢復(fù)。研究表明，損傷骨骼肌細(xì)胞的表面均有HGF及其受體c-Met的表達(dá)[2]，說明應(yīng)用外源性HGF不僅能促進(jìn)肌細(xì)胞的增殖及分化，同時(shí)能改善肌肉再生微環(huán)境(促進(jìn)血供、抗凋亡、肌萎縮、肌纖維化)，從而發(fā)揮協(xié)同作用，以促進(jìn)失神經(jīng)骨骼肌的再生，達(dá)到喉肌功能的良好恢復(fù)的效果。

外源性營(yíng)養(yǎng)因子的給藥途徑和方法研究甚多。有效的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子濃度及持續(xù)作用時(shí)間可以更有效的維持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突的再生[22]。為了在再生神經(jīng)軸突周圍的微環(huán)境中維持有效的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子濃度，有研究者將營(yíng)養(yǎng)因子直接注入橋接神經(jīng)的硅膠管內(nèi)[23]，但注入的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子有效的作用時(shí)間較短。也有研究者將營(yíng)養(yǎng)因子注射至皮下、肌肉、腹腔等, 通過局部吸收，經(jīng)過全身血液循環(huán)作用于局部的神經(jīng)元、再生的神經(jīng)軸突[24]，但不足之處是易引起全身的藥物不良反應(yīng)。本研究在上述研究的基礎(chǔ)上，通過橋接管內(nèi)注入HGF, 同時(shí)隔日在橋接管周圍注射HGF， 通過藥物的彌散作用，達(dá)到營(yíng)養(yǎng)因子直接作用于再生神經(jīng)軸突，并通過軸突的吸收，作用于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。此種方法HGF也可能被局部組織吸收，通過全身血循環(huán)作用到再生的神經(jīng)元、軸突及肌肉，從而進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)肌肉的再生，但全身吸收的副作用難以避免。因此，如何在局部通過HGF緩釋作用于神經(jīng)損傷部位，既保持局部穩(wěn)定的藥物濃度，又避免因藥物全身吸收所帶來的不良反應(yīng)，有待于進(jìn)一步研究。

4 參考文獻(xiàn)

1 Tsuzuki N, Miyazawa T, Matsumoto K，et al. Hepatocyte growth factor reduces infarct volume after transient focal cerebral ischemia in rats[J]. Acta Neurochir Suppl, 2000，76: 311.

2 Hashimoto N, Yamanaka H, Fukuoka T, et al. Expression of HGF and cMet in the peripheral nervous system of adult rats following sciatic nerve injury[J]. Neuroreport, 2001，12:1 403.

3 Okura Y, Arimoto H, Tanuma N, et al. Analysis of neurotrophic effects of hepatocyte growth factor in the adult hypoglossal nerve axotomy model[J]. Eur J Neurosci, 1999，11: 4 139.

4 周翠英，駱文龍. 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)面神經(jīng)損傷修復(fù)作用的實(shí)驗(yàn)初探[J].重慶醫(yī)學(xué),2003,32:299.

5 Zheng H, Zhou S, Chen S，et al. An experimental comparison of different kinds of laryngeal muscle reinnervation[J]. Otolaryngol Head Neck Surg, 1998,119: 540.

6 鄭宏良，周水淼，李兆基，等. 睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在喉返神經(jīng)再生過程中的表達(dá)及分布[J].中華耳鼻咽喉科雜志,1999,34:289.

7 Zheng H, Li Z, Zhou S，et al. Update: laryngeal reinnervation for unilateral vocal cord paralysis with the ansa cervicalis[J]. Laryngoscope, 1996,106: 1 522.

8 易聲禹，張劍寧. 神經(jīng)組織移植與神經(jīng)再生的歷史回顧[M].北京: 人民衛(wèi)生出版社, 1993.43～62.

9 鄭宏良，何成，周水淼，等. 外源性睫狀神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)喉神經(jīng)再生的趨向作用[J]. 中華耳鼻咽喉科雜志, 2002,37:333.

10 黃立，洪光祥，王發(fā)斌.神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)周圍神經(jīng)端側(cè)吻合靶器官功能恢復(fù)影響的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)臨床康復(fù),2004,8:1 254.

11 宮可同，闞世廉，魯毅軍. 白細(xì)胞介素-1在周圍神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生中的作用[J]. 中華手外科雜志，2003,19:124.

12 Wolf HK, Zarnegar R, Michalopoulos GK. Localization of hepatocyte growth factor in human and rat tissues: an immunohistochemical study[J]. Hepatology, 1991. 14: 488.

13 Gutierrez H, Dolcet X, Tolcos M, et al. HGF regulates the development of cortical pyramidal dendrites[J]. Development, 2004. 131: 3 717.

14 Koyama J, Yokouchi K, Fukushima N, et al. Neurotrophic effect of hepatocyte growth factor on neonatal facial motor neurons[J]. Neurol Res, 2003. 25: 701.

15 Caton A, Hacker A, Naeem A, et al. The branchial arches and HGF are growth-promoting and chemoattractant for cranial motor axons[J]. Development, 2000. 127: 1 751.

16 Krull CE, Koblar SA. Motor axon pathfinding in the peripheral nervous system[J]. Brain Res Bull, 2000,53: 479.

17 周翠英，駱文龍. 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)周圍神經(jīng)再生的作用研究[J].藥學(xué)專論,2002,11:42.

18 馮凱，林世和，呂憲民，等. 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志,2005,12:122.

19 劉陽(yáng)，蘇俊波，駱文龍. 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)面神經(jīng)損傷后運(yùn)動(dòng)終板及肌纖維修復(fù)作用的研究[J]. 重慶醫(yī)學(xué),2004,33：1 231.

20 唐金樹，劉鄭生，趙斌，等. 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)肌肉水平神經(jīng)再生影響的初步研究[J].中國(guó)臨床康復(fù),2004,8:4 448.

21 Boros P, Miller CM. Hepatocyte growth factor: a multifunctional cytokine[J]. Lancet, 1995,345: 293.

22 于雯雯,蔣欣泉,張志愿. 周圍神經(jīng)導(dǎo)管修復(fù)中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的應(yīng)用方式進(jìn)展[J]. 中國(guó)口腔頜面外科雜志,2009, 1:77.

23 Gillespie LN. Regulation of axonal growth and guidance by the neurotrophin family of neurotrophic factors[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2003,30: 724.

24 劉鴻飛, 徐勇忠. CNTF 對(duì)端側(cè)吻合后面神經(jīng)再生作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].口腔醫(yī)學(xué)研究,2002,18: 251.