超濾技術(shù)在蛋白質(zhì)分離純化中的應(yīng)用

王 健， 葉波平

(中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇南京210009)

超濾技術(shù)是一種以超濾膜作為分離介質(zhì)，以膜兩側(cè)的壓力差為驅(qū)動(dòng)力，利用料液中各組分在高分子膜中傳質(zhì)的差異，對(duì)其進(jìn)行分離、分級(jí)、純化和濃縮的方法。在超濾過程中，所用超濾膜的孔徑約為1～100 nm，截留相對(duì)分子質(zhì)量(molecular weight cut off，MWCO)為3×105～1×106，能用于蛋白質(zhì)、細(xì)菌、膠體、病毒、熱原、多糖等的分離［1-2］。

超濾技術(shù)的核心部件是超濾膜，其結(jié)構(gòu)及所用材料性質(zhì)對(duì)膜的分離性能起著決定性作用。超濾膜大多數(shù)是由兩層不同結(jié)構(gòu)的薄層組成的非對(duì)稱膜，其中，上層很薄，厚度為0.1～1.0μm，稱作活化層，其孔徑較小，起截留粒子的作用，決定膜的分離性能;下層較厚，厚度為100～200μm，孔徑較大，稱為支撐層，起增加膜強(qiáng)度的作用［3］。

根據(jù)材料的不同，超濾膜可分為有機(jī)膜和無機(jī)膜。一般而言，膜材料應(yīng)具備良好的成膜性、機(jī)械穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性以及耐酸堿和耐微生物浸蝕等性能［4］，理想的膜材料還應(yīng)具有親水性［5］及不對(duì)蛋白質(zhì)等生物大分子產(chǎn)生非特異性吸附作用［6］。常用的有機(jī)膜包括聚醚砜(PES)膜、聚丙烯(PAN)膜、再生纖維素(RC)膜、醋酸纖維素(CA)膜、聚砜(PS)膜、聚偏氟乙烯(PVDF)膜等，其中PES膜以高剛性、抗蠕變性、化學(xué)穩(wěn)定性和生物穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，常用作超濾的首選膜材料［7-8］。除有機(jī)膜外，無機(jī)陶瓷超濾膜也以耐高溫、易清洗、耐酸堿、抗生物腐蝕等特點(diǎn)而開始被應(yīng)用于制藥工業(yè)和生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)，這種膜是以氧化鋁、氧化鋯、氧化鈦等為材料、采用特殊工藝制成的多孔非對(duì)稱膜［6］。隨著高分子材料以及成型加工工藝學(xué)的不斷發(fā)展，不同形式的超濾膜組件應(yīng)運(yùn)而生，主要有中空纖維式、圓管式、板框式、卷式和毛細(xì)管式。

蛋白質(zhì)分離純化是一項(xiàng)富有挑戰(zhàn)性的工作。由于蛋白質(zhì)存在于復(fù)雜的生物體系中，且自身不穩(wěn)定，遇熱或遇某些溶劑易變性失活［9］，故傳統(tǒng)的蒸餾、溶劑萃取等分離技術(shù)并不適用于其分離純化，而色譜法用于蛋白質(zhì)的分離純化，雖具有高分辨率的特點(diǎn)，但操作繁瑣、難放大、成本高，在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用受到限制。與上述方法相比，超濾技術(shù)作為一種典型的膜分離技術(shù)，則具有高效率、低能耗、無相變、無需添加任何化學(xué)試劑、操作簡便、條件溫和等諸多優(yōu)點(diǎn)，在蛋白質(zhì)脫鹽、脫醇、濃縮、分級(jí)分離及內(nèi)毒素去除等過程中具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 超濾技術(shù)的應(yīng)用研究

1.1 用于蛋白質(zhì)的脫鹽、脫醇及濃縮

超濾技術(shù)現(xiàn)已逐漸替代空間排阻色譜，成為蛋白質(zhì)脫鹽、脫醇和濃縮富集的首選方法(Kurnik等，Biotechnol Bioeng，1995年)。近年來，該項(xiàng)技術(shù)已成功應(yīng)用于干酪乳清和大豆乳清中高營養(yǎng)價(jià)值蛋白的脫鹽和回收［10-14］。如:首先將干酪乳清用熱鈣法預(yù)處理，致使CaCl2與料液中的脂類物質(zhì)形成絮狀沉淀，以降低乳清渾濁度，提高膜的通透量［15］;然后將乳清和水按2∶1體積比稀釋，再利用MWCO為1×104的板框式超濾裝置，在操作壓力為0.21 MPa、料液pH為6.0的條件下，有效脫除了乳清中的乳糖和鹽類等小分子雜質(zhì)(乳糖脫除率達(dá)93.13%)，并回收了α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、免疫球蛋白、牛血清白蛋白和乳鐵蛋白等營養(yǎng)價(jià)值高的蛋白質(zhì)(蛋白截留率達(dá)94.65%)［11］。

Chay Pak Ting等［16］分別利用 MWCO為1×104和3×104的PES膜，在操作壓力0.14 MPa、料液pH為8.0及溫度為50℃的條件下，對(duì)卵高磷蛋白(Mr=3.5×104)進(jìn)行濃縮和脫鹽，結(jié)果，目的蛋白分別濃縮了6.25和5.92倍，其粗提物得率分別為84.7%和84.4%。

利用超濾技術(shù)也可實(shí)現(xiàn)對(duì)血清中免疫球蛋白(Ig)的有效濃縮。IgG(Mr=1.6×105)的基本結(jié)構(gòu)由兩條輕鏈(Mr=2.4×104)和兩條重鏈(Mr= 5.5×104)共4條肽鏈組成，羅磊等［17］選用MWCO為1×104的PES膜和螺旋卷式超濾設(shè)備，在操作壓力為0.1 MPa、料液pH為7.5及溫度為50℃的條件下，以截留液全循環(huán)錯(cuò)流方式對(duì)預(yù)處理豬血清中的IgG進(jìn)行超濾濃縮，結(jié)果，料液中IgG的質(zhì)量濃度從1.4 g·L-1濃縮至14.2 g·L-1。在超濾濃縮蛋白質(zhì)的過程中，為保證目的蛋白的收率，一般建議選用MWCO小于目的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量的1/3的膜。

1.2 用于蛋白質(zhì)的分級(jí)分離

蛋白質(zhì)的分級(jí)分離是指根據(jù)料液中各蛋白質(zhì)組分理化性質(zhì)(如相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、疏水性等)的差異而將其逐段分開的過程。凝膠色譜是常用的生物大分子(尤其是蛋白質(zhì))分級(jí)分離方法之一，而與傳統(tǒng)的色譜技術(shù)相比，超濾分離技術(shù)因具有低成本、易放大的特點(diǎn)，在一些具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的蛋白和酶類的分級(jí)分離及工業(yè)化生產(chǎn)中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

雞蛋蛋清是獲得溶菌酶和卵清蛋白最廉價(jià)的原料，近來人們常采用超濾法從雞蛋蛋清中分離卵清蛋白和溶菌酶［18-19］。如:用200 mmol·L-1的NaCl溶液將雞蛋蛋清適當(dāng)稀釋后，采用配有MWCO分別為3×104和5×104的PES膜的渦旋裝置，對(duì)其中蛋白進(jìn)行兩步分離純化:先用MWCO為3×104的PES膜去除小分子蛋白(Mr為1.27×104～2.80×104)，如卵類黏蛋白、溶菌酶、卵糖蛋白等，將大分子蛋白截留;再用MWCO為5×104的PES膜處理截留的大分子蛋白，將相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白(Mr為5×104～9×105)，如卵白素、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵黏蛋白、G3卵球蛋白等截留，而相對(duì)分子質(zhì)量較小的卵清蛋白則透過膜，得以分離。期間，通過優(yōu)化工藝條件:操作壓力為0.44 MPa、攪拌轉(zhuǎn)速為200 r·min-1、料液pH為2.5以及蛋清和水的體積比為1∶1，成功獲得純度為98.7%、得率為45%的卵清蛋白［18］。

Wang等［20］從大蒜中提取超氧化物歧化酶(SOD，Mr=2.7×104)時(shí)，發(fā)現(xiàn)粗酶液中主要存在6種蛋白質(zhì)，隨后選取與SOD分子質(zhì)量最接近且對(duì)其純度影響較大的兩種雜蛋白作為研究對(duì)象，使用MWCO分別為1×105和5×104的RC膜和PES膜對(duì)粗酶液中蛋白質(zhì)進(jìn)行兩步超濾分離，即首先采用RC膜將其中的大分子雜蛋白(IPA，Mr=1.53×105)截留，獲得含SOD、小分子雜蛋白(IPB，Mr= 1.50×104)和另外3種雜蛋白的料液;然后調(diào)節(jié)料液pH、離子強(qiáng)度、流速和攪拌速度，用PES膜截留SOD而使IPB和其余小分子蛋白透過膜。結(jié)果，通過優(yōu)化工藝條件:料液pH為8.0、不加NaCl、流速為26.5 L·m-2·h-1及攪拌速率為1 200 r·min-1，獲得純度為98%、得率為90%、比活力為3 011 U·mg-1的SOD。與傳統(tǒng)的分步鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法提取SOD工藝［21-22］相比，該工藝操作步驟簡單、條件溫和、無需添加化學(xué)試劑，且SOD得率分別提高了49%和37%，其比活力也較鹽析法提高了3.1倍，但較有機(jī)溶劑法有所降低。

盡管超濾技術(shù)已成功應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離純化，但值得注意的是:傳統(tǒng)超濾技術(shù)的分離精度尚不高，要使蛋白質(zhì)達(dá)到較好的分離效果，一般要求雜蛋白與目標(biāo)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量相差10倍以上［23］。

1.3 用于內(nèi)毒素的去除

利用原核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的藥用蛋白常易混入由細(xì)菌細(xì)胞壁破壁后產(chǎn)生的內(nèi)毒素，而內(nèi)毒素又稱熱原，是一種脂多糖(LPS)，進(jìn)入人體后可引起發(fā)熱、微循環(huán)障礙、內(nèi)毒素性休克等癥狀［24］，因而必須將其除去。

內(nèi)毒素具有耐熱性和化學(xué)穩(wěn)定性，不易被滅除。早期用于去除重組蛋白藥物中內(nèi)毒素的方法主要有非離子型去垢劑Triton X-114萃取法(Liu等，Clin Biochem，1997年)、離子交換色譜法(Neidhardt等，JChromatogr A，1992年)和活性炭吸附法(Nagaki等，Int J Artif Organs，1991年)，其中，Triton X-114萃取法雖可有效去除蛋白質(zhì)溶液中的內(nèi)毒素，但殘留的Triton X-114對(duì)人體有毒害;離子交換色譜法是通過陰離子交換劑的吸附作用而除去生理?xiàng)l件下帶負(fù)電荷的內(nèi)毒素，故不適用于處理帶負(fù)電荷的蛋白;活性炭吸附法則易發(fā)生蛋白質(zhì)的非特異性吸附，導(dǎo)致目標(biāo)蛋白得率降低。超濾技術(shù)的發(fā)展則為重組蛋白藥物中內(nèi)毒素的去除提供了新的有效途徑。內(nèi)毒素單體(Mr為1×104～2×104)在水溶液中會(huì)形成聚集體(Mr為3×105～106)，且兩者維持一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡［25］。Jang等［26］采用MWCO為1×105的超濾膜研究了料液中蛋白質(zhì)量濃度對(duì)內(nèi)毒素濾除效率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)量濃度為8.8 g·L-1時(shí)，內(nèi)毒素去除率為37.9%，而隨著蛋白質(zhì)量濃度的降低，內(nèi)毒素去除率逐漸升高，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)量濃度降至2 g·L-1時(shí)，內(nèi)毒素去除率高達(dá)99.6%。這可能是由于在高質(zhì)量濃度的蛋白質(zhì)溶液中，內(nèi)毒素與蛋白質(zhì)的相互作用增強(qiáng)，導(dǎo)致其難以去除，而在低質(zhì)量濃度的蛋白質(zhì)溶液中，這種相互作用減弱，內(nèi)毒素也就易于去除。

2 超濾技術(shù)應(yīng)用中面臨的問題及解決方法

超濾技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)分離純化，雖具有其獨(dú)特優(yōu)勢，但超濾膜缺乏選擇性以及在超濾過程中易產(chǎn)生濃差極化與膜污染等，已成為該項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用中亟待解決的難題。

2.1 超濾膜的選擇性

已有研究顯示，超濾膜缺乏選擇性，即對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量相近的蛋白質(zhì)組分不能進(jìn)行有效的分離，可通過調(diào)節(jié)料液的理化參數(shù)(如pH和離子強(qiáng)度)以優(yōu)化目的蛋白的理化性質(zhì)、改進(jìn)膜的組合形式及引入親和技術(shù)以提高膜的分離性能而加以改善。

2.1.1 調(diào)節(jié)料液的理化參數(shù) 適當(dāng)調(diào)節(jié)料液的pH值和離子強(qiáng)度，可改善目的蛋白的理化性質(zhì)，致使其與其他組分的膜通透性產(chǎn)生差異，從而達(dá)到將其有效分離的目的。Wan等［27］使用MWCO為1×105的PES膜考察了料液pH和離子強(qiáng)度對(duì)人血清蛋白和Ig的膜通透性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)料液pH為4.7(即血清蛋白的等電點(diǎn))時(shí)，血清蛋白的膜透過率達(dá)最大值79.50%，而Ig的膜透過率則較低，僅為27.68%;當(dāng)料液中NaCl濃度較低(1.0～3.0 mmol·L-1)時(shí)，血清蛋白相對(duì)于Ig的篩分系數(shù)(即血清蛋白與Ig的透膜量比值)大于50，且NaCl濃度為1.5mmol·L-1時(shí)，二者篩分系數(shù)達(dá)330，獲得最佳分離效果。據(jù)此，確定這兩種蛋白的最佳分離條件:料液pH為4.7及NaCl濃度為1.5 mmol·L-1。

2.1.2 改進(jìn)膜的組合形式 通過改進(jìn)超濾膜的空間組合形式，可大大提高膜超濾分離時(shí)的分辨率。Yunos等［28］以單層超濾膜為參照，考察了兩種“三明治”形式的超濾膜裝置——兩層PES膜的活化層均朝上的Sirkar裝置和兩層PES膜的活化層朝向相反且均朝外的Zydney裝置對(duì)溶菌酶(Mr=1.43×104)和肌紅蛋白(Mr=1.74×104)的分離效果。結(jié)果顯示，與單層超濾膜相比，這種膜的“三明治”組合形式的優(yōu)點(diǎn)在于，膜與膜貼緊，掩蓋了膜上不均勻的大孔，優(yōu)化了膜的孔徑分布，致使膜超濾時(shí)的選擇性大大提高，且膜污染也有所減輕;在pH 11.0的100 mmol·L-1Tris緩沖液中，采用Sarkar裝置成功實(shí)現(xiàn)了相對(duì)分子質(zhì)量相近的溶菌酶和肌紅蛋白的分離;但是，Zydney裝置易造成下層膜的破壞。

Mayani等［29］則評(píng)價(jià)了串聯(lián)組合的連續(xù)多級(jí)超濾系統(tǒng)用于分離純化雞蛋蛋清中溶菌酶的可行性，期間，首先考察了連續(xù)三級(jí)串聯(lián)超濾系統(tǒng)的分離純化效率，將蛋清料液先經(jīng)MWCO為5×104的一級(jí)超濾膜組件處理，分別獲得含溶菌酶的滲出液和含大分子雜蛋白的殘留液，前者再進(jìn)入MWCO為3×103的二級(jí)超濾膜組件，即可從其殘留液中獲得純化的溶菌酶，而后者則與經(jīng)二級(jí)超濾膜組件處理所獲滲出液一起進(jìn)入MWCO為5×104的三級(jí)超濾膜組件，截留大分子蛋白混合物，滲出液進(jìn)入一級(jí)超濾膜組件，回收其中少量的溶菌酶。結(jié)果，采用連續(xù)三級(jí)串聯(lián)超濾系統(tǒng)獲得的溶菌酶純度為96%、得率為75%，分離純化效果明顯。但經(jīng)此三級(jí)串聯(lián)超濾系統(tǒng)處理所獲溶菌酶稀釋嚴(yán)重，致使緩沖液未能得到充分利用，于是該研究小組考慮在此系統(tǒng)基礎(chǔ)上添加一級(jí)濃縮步驟，從而建立了連續(xù)四級(jí)串聯(lián)超濾系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)顯示，采用該四級(jí)串聯(lián)超濾系統(tǒng)處理蛋清料液，不但可獲得高純度(97%)的溶菌酶，而且使酶濃度提高了2倍，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了溶菌酶的純化和濃縮，簡化了后續(xù)操作工藝，縮短了生產(chǎn)周期，并可循環(huán)利用緩沖液，降低了生產(chǎn)成本。因此，連續(xù)四級(jí)串聯(lián)超濾系統(tǒng)在蛋白質(zhì)大規(guī)模分離純化中更具應(yīng)用前景。

2.1.3 引入親和技術(shù) 將親和技術(shù)的高選擇性與超濾技術(shù)的高分離能力相結(jié)合而形成的新型親和超濾技術(shù)(affinity ultrafiltration)可提高超濾膜對(duì)特定蛋白分離的選擇性而將目的蛋白純度提高1 000倍［30］。親和超濾技術(shù)的基本原理是:將可特異性結(jié)合目的蛋白的配基與載體(如葡聚糖、殼聚糖、聚丙烯酰胺、瓊脂糖、脂質(zhì)體、聚苯乙烯等)偶聯(lián)，再與目的蛋白粗提液混合，致使配基偶聯(lián)體特異性地與目的蛋白給合，形成體積和相對(duì)分子質(zhì)量遠(yuǎn)大于雜蛋白的復(fù)合物;于是，在后續(xù)的超濾過程中，復(fù)合物被濾膜截留，雜質(zhì)則透過膜而被除去;最后，選用合適的洗脫液將截留的復(fù)合物上結(jié)合的目的蛋白洗脫下來，從而獲得分離純化的蛋白產(chǎn)品。

親和超濾的成敗取決于大分子配基的制備以及洗脫液把目的蛋白從復(fù)合物上洗脫下來的能力。若配基與目的蛋白的結(jié)合力太弱，會(huì)影響分離純化效率，而二者結(jié)合力太強(qiáng)，則不易將目的蛋白從復(fù)合物上洗脫下來，所以在應(yīng)用親和超濾技術(shù)時(shí)一般選用具中度親和力的配基為宜。目前，親和超濾技術(shù)已成功應(yīng)用于磷脂酶A2(PLA2)、胰蛋白酶、凝血酶等多種酶的分離純化。

PLA2是一種 Ca2+依賴型脂肪水解酶，可在Ca2+的存在下，與磷酸甘油類物質(zhì)(如磷脂酰乙醇胺)的sn-2位點(diǎn)結(jié)合而發(fā)揮水解作用。Teke等［30］將大分子水溶性殼聚糖與磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)，制得親和載體，再將親和載體和PLA2粗提液混合，并在4℃下用10 mmol·L-1CaCl2溶液預(yù)處理2 h，用MWCO為1×105的超濾膜將未結(jié)合蛋白質(zhì)去除，而截留PLA2與大分子親和載體結(jié)合所形成的復(fù)合物;然后，用50 mmol·L-1EDTA溶液處理復(fù)合物，將Ca2+螯合，致使PLA2從復(fù)合物上洗脫下來，在4℃下經(jīng)透析除鹽及MWCO為3×104的超濾膜超濾濃縮，最終獲得濃縮79倍、得率為76.3%的PLA2;經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測顯示，所獲PLA2的Mr為1.6×104。

胰蛋白酶是一種源于動(dòng)物、專一性水解賴氨酸與精氨酸羧基形成的肽鍵的蛋白水解酶，廣泛用于生物制藥和食品行業(yè)。Luong等(Biotechnol Bioeng，1988年)用N-丙烯酰-間-氨基苯甲脒和丙烯酰胺共聚物制成水溶性大分子親和載體，再將親和載體和胰蛋白酶粗提液混合，并在4℃下孵育2 h，致使親和載體上N-丙烯酰-間-氨基苯甲脒與胰蛋白酶特異性結(jié)合而形成大分子復(fù)合物，用MWCO為1×105的超濾膜截留復(fù)合物而除去其他雜質(zhì);然后，使用精氨酸或間-氨基苯甲脒將胰蛋白酶從復(fù)合物上洗脫下來，通過超濾將載體和酶分開，經(jīng)濃縮除鹽后獲得得率達(dá)90%以上、純度為98%的胰蛋白酶。

凝血酶是一種催化血液中纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白、加速血液凝固而發(fā)揮止血作用的蛋白水解酶，臨床上廣泛用于局部止血和術(shù)后傷口愈合。Wang等［31］在PES膜上偶聯(lián)肝素和導(dǎo)電聚合物多吡咯，制得用于分離純化凝血酶的導(dǎo)電親和膜(affinity electromembrane)。該膜的特點(diǎn)是，膜上肝素配基被多吡咯的側(cè)鏈包裹，防止了配基的丟失，提高了膜的穩(wěn)定性，且加以適當(dāng)?shù)碾妷嚎稍徽{(diào)節(jié)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)性質(zhì)。實(shí)驗(yàn)顯示，該膜對(duì)凝血酶的吸附率高達(dá)93.1%;使用2 mol·L-1NaSCN溶液將凝血酶從膜上洗脫下來，再通過超濾去除洗脫劑，可獲得純度達(dá)98%以上的凝血酶;該膜的非特異性吸附少，穩(wěn)定性高，重現(xiàn)性好;此外，利用該膜的截留作用還可有效去除原料藥中可能存在的病毒。

基于抗體-抗原反應(yīng)而發(fā)展起來的免疫親和超濾技術(shù)則是將抗體或抗原固定到膜表面，利用抗原和抗體之間的特異性結(jié)合而實(shí)現(xiàn)目的蛋白高效分離的一種新技術(shù)。目前，該技術(shù)已成功應(yīng)用于IgG的分離純化［32］，但由于抗體的制備耗時(shí)、成本高以及抗體與膜的結(jié)合率低、易失活等，尚未見有關(guān)其工業(yè)化應(yīng)用的報(bào)道。

2.2 濃差極化與膜污染

濃差極化是一種在超濾過程中，因料液中溶劑透過膜，使膜表面的溶質(zhì)濃度增加，致膜表面形成“凝膠層”，從而對(duì)溶劑透過起著阻礙作用，導(dǎo)致傳質(zhì)推動(dòng)力下降的現(xiàn)象(Matthiasson等，Desalination，1980年)。膜污染則是一種在超濾過程中，由于料液中膠體物質(zhì)、微粒、微生物、溶質(zhì)分子等吸附于膜表面或沉積在膜孔中，使膜孔堵塞或變小，導(dǎo)致膜阻力增大和膜的滲透速率下降的現(xiàn)象(Reihanian等，JMembr Sci，1983年)。研究表明，濃差極化和膜污染可通過優(yōu)化膜表面的流體力學(xué)條件、外加物理場及選擇合適的操作條件等措施以強(qiáng)化超濾過程而得到改善。

2.2.1 優(yōu)化膜表面的流體力學(xué)條件 優(yōu)化超濾膜表面的流體力學(xué)條件，包括提高料液流速、采用切向流過濾和設(shè)計(jì)合理的膜組件流道結(jié)構(gòu)等。實(shí)驗(yàn)顯示，在超濾過程中，料液流速越大，其在膜表面的剪切力越大，大分子組分?jǐn)U散越快，膜表面沉積層厚度減小，從而有效減輕濃差極化［33］;切向流過濾是指料液的流動(dòng)方向與過濾方向成垂直的過濾方式，此時(shí)，料液在膜表面產(chǎn)生剪切力，加快了其在膜表面的流速，避免了濃差極化的形成［34］;此外，設(shè)計(jì)合理的膜組件流道結(jié)構(gòu)，可避免流道產(chǎn)生死角，使被截留物質(zhì)及時(shí)被帶走，也保證了流體處于湍流狀態(tài)，從而防止膜表面“凝膠層”的產(chǎn)生，也減輕了膜污染。

2.2.2 外加物理場 外加物理場(如電場、超聲場等)強(qiáng)化超濾的原理是:在電場作用下，料液中帶電荷粒子發(fā)生垂直于膜表面并與介質(zhì)滲透方向相反的電泳遷移，使膜表面邊界層厚度降低，同時(shí)，溶劑發(fā)生電滲效應(yīng)，促進(jìn)其加速透過膜，從而減輕濃差極化和膜污染，提高膜通量;在超聲波作用下，可產(chǎn)生聲沖流、空化和熱效應(yīng)，從而減輕濃差極化，增加膜通量。

肖凱軍等［35］以牛血清蛋白(BSA，Mr=6.7×104)為分離對(duì)象及膜通量、截留率、膜通量衰減程度和恢復(fù)率等參數(shù)為指標(biāo)，考察了在操作壓力為0.2 MPa、料液pH為6.8及溫度為25℃的條件下，外加直流電場對(duì)γ-Al2O3陶瓷超濾膜分離性能的影響。結(jié)果顯示，無外加電場超濾時(shí)，膜通量在40 min內(nèi)衰減至原始值的59.4%，膜阻力明顯增加;而外加正電場(20 V·cm-1)后，膜通量在20 min內(nèi)逐漸升高并達(dá)到一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的高值，較無外加電場時(shí)提高了1.67倍，且維持60 min未見衰減，同時(shí)截留率也從28.7%提高到46.8%，超濾強(qiáng)化效果明顯;但外加負(fù)電場時(shí)，則由于濃差極化和膜污染的加劇，導(dǎo)致膜通量降低(見圖1);另外，采用外加電場技術(shù)，可使受污染的陶瓷膜的膜通量在短時(shí)間內(nèi)(20 min)恢復(fù)至原始值的95%以上。

圖1 外加不同電場時(shí)超濾膜的膜通量－時(shí)間曲線Figure 1 Membrane flux-time curves ofultrafiltrationmembrane in different electric fields

Cai等［36］以葡聚糖(Mr為105～2×105)為分離對(duì)象，采用MWCO為3×104的PES膜考察了不同超聲頻率和操作壓力對(duì)超濾的強(qiáng)化作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在操作壓力為0.4 MPa、溫度為25℃的條件下，當(dāng)超聲頻率為28和45 kHz時(shí)，膜通量顯著提高，膜污染明顯減輕，而超聲頻率達(dá)100 kHz時(shí)，則無明顯超濾強(qiáng)化效應(yīng)，這可能是由于高超聲頻率在料液中產(chǎn)生的空化作用減弱所致;在操作壓力為0.4 MPa時(shí)，28 kHz超聲頻率產(chǎn)生的超濾強(qiáng)化作用明顯強(qiáng)于45 kHz(見圖2)，而當(dāng)操作壓力增加至1.2 MPa時(shí)，這兩個(gè)超聲頻率產(chǎn)生的超濾強(qiáng)化效果基本相同。然而，超聲場雖能顯著提高超濾效率，其產(chǎn)生的熱效應(yīng)卻會(huì)導(dǎo)致料液溫度過快升高，從而造成蛋白生物活性損失。

圖2 外加不同超聲頻率時(shí)超濾膜的膜通量－時(shí)間曲線Figure 2 Membrane flux-time curves ofultrafiltrationmembrane using different ultrasonic frequencies

2.2.3 選擇合適的操作條件 采用超濾技術(shù)分離純化蛋白質(zhì)時(shí)，選擇適當(dāng)?shù)牟僮鲏毫?、料液pH值及溫度，有助于減輕濃差極化和膜污染。實(shí)驗(yàn)顯示，在超濾過程中，綜合考慮目的蛋白和膜材料的熱穩(wěn)定性，適當(dāng)提高料液溫度，降低其黏度，可增大其擴(kuò)散系數(shù)，提高膜通量［19］;而適當(dāng)調(diào)節(jié)料液pH值，使其遠(yuǎn)離目的蛋白等電點(diǎn)，可避免蛋白形成沉淀，減少蛋白在膜上的吸附，或使目的蛋白與膜所帶電荷相同，利用同種電荷相斥的原理而減弱膜對(duì)蛋白的吸附作用［19，27］;適當(dāng)提高操作壓力則可致料液流速增加，從而增加膜通量，但當(dāng)膜表面蛋白濃度達(dá)到飽和時(shí)，若繼續(xù)增加壓力，將加劇濃差極化，導(dǎo)致膜表面形成“凝膠層”，從而使膜的通透性降低，影響其分離性能，因此，通常選用在膜表面“凝膠層”剛開始形成時(shí)所對(duì)應(yīng)的操作壓力為宜(Reihanian等，J Membr Sci，1983年)。

3 展望

隨著生物工程產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，超濾技術(shù)將以其獨(dú)特優(yōu)勢而逐漸取代傳統(tǒng)的濃縮、透析、離心、沉淀等方法，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離純化。但是，在用于蛋白質(zhì)分離純化以及工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)，該項(xiàng)技術(shù)尚有不夠完善之處，因此對(duì)其的研究將會(huì)集中在以下幾個(gè)方面:1)加強(qiáng)對(duì)超濾膜的研究，開發(fā)性能好、穩(wěn)定性高和耐污染的膜材料;2)研發(fā)自動(dòng)化和集成化程度高的超濾設(shè)備，以縮短生產(chǎn)周期和降低生產(chǎn)成本;3)通過安裝輔助部件或改進(jìn)流道結(jié)構(gòu)，開發(fā)低能耗、低污染的膜組件;4)進(jìn)一步開展超濾工藝優(yōu)化研究，提高超濾的效率和分辨率;5)深化超濾技術(shù)與其他新技術(shù)(如親和技術(shù)、物理場技術(shù)等)整合應(yīng)用的研究，開拓超濾技術(shù)的應(yīng)用空間。

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