生物電化學(xué)法轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1，3－二羥基丙酮

張雨薇， 楊雪鵬， 魏東芝， 艾志錄

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.鄭州輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002）

生物電化學(xué)法轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1，3－二羥基丙酮

張雨薇1，2， 楊雪鵬2， 魏東芝2， 艾志錄＊1

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.鄭州輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002）

氧化葡萄糖酸桿菌中依賴輔基吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline Quinone，PQQ）的膜結(jié)合甘油脫氫酶（Glycerol dehydrogenase，GDH）是酶法轉(zhuǎn)化甘油生成 1，3－二羥基丙酮（1，3－Dihydroxyacetone，DHA）的關(guān)鍵酶。以鐵氰化鉀為電子媒介體，采用生物電化學(xué)法，再生甘油脫氫酶的輔基PQQ，從而實現(xiàn)酶法循環(huán)轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)DHA。設(shè)計電耦聯(lián)反應(yīng)裝置，在（28±2）℃，370 m V電壓下反應(yīng)18 h，DHA質(zhì)量濃度達到27.21 g／L，甘油轉(zhuǎn)化率為52.93%。

1－3二羥丙酮；甘油脫氫酶；生物電化學(xué)法；氧化葡萄糖酸桿菌

二羥基丙酮或1，3－二羥基丙酮，英文名為1，3－dihydroxyacetone 或 dihydroxyactone， 簡 寫 為DHA［1］，是一種重要的醫(yī)藥中間體和功能添加劑，在國外已得到廣泛應(yīng)用。作為生產(chǎn)DHA的原料——甘油隨著近年來生物柴油的迅速發(fā)展而大量產(chǎn)生。因此，生物法轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)DHA的研究對于延伸石化產(chǎn)品生產(chǎn)鏈，創(chuàng)造更好的經(jīng)濟和社會效益，提升行業(yè)競爭力具有積極作用。

生物法生產(chǎn)DHA可以分為微生物法和酶法兩種。其中酶法生產(chǎn)過程中需要大量輔酶，而輔酶價格昂貴，因此在酶法生產(chǎn)中有必要對輔酶進行循環(huán)再生。目前，報道的輔酶再生的方法主要集中在雙酶耦聯(lián)反應(yīng)［2－3］。

作者針對氧化葡糖酸桿菌膜結(jié)合甘油脫氫酶（GDH）（EC1.1.99.22）［4］，設(shè)計生物電化學(xué)法再生甘油脫氫酶輔基PQQ，從而實現(xiàn)甘油到二羥基丙酮的持續(xù)轉(zhuǎn)化，進而提高產(chǎn)品得率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter oxy dans）：作者所在實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基：8 g／d L 山梨醇，2 g／d L酵母粉，1 g／d L 氯化鈉，2 g／d L 瓊脂，自然p H。

種子培養(yǎng)、基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：8 g／d L山梨醇，2 g／d L酵母粉，1 g／d L氯化鈉，自然p H。

1.1.3 主要試劑二羥丙酮顯色液：二苯胺4.8 g，濃硫酸48 m L，冰醋酸432 m L，混勻，避光保藏；吩嗪 硫 酸 甲 酯 （PMS）、2，6－二 氯 酚 吲 哚 酚 納（DCIP）：美國Sigma公司；酵母粉：Oxoid公司；D－山梨醇：北京Solarbio公司；甘油、鐵氰化鉀等試劑均為分析純。

1.1.4 主要儀器UV2300紫外可見分光光度儀：上海光譜儀器有限公司；HZQ－F160全溫振蕩培養(yǎng)箱：上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；Cs350電化學(xué)工作站：武漢科思特儀器有限公司；DS65A高速冷凍離心機：美國Beckman公司；ZF－3恒電位儀：上海正方電子電器有限公司；甘油含量測定試劑盒：北京五洲原業(yè)科貿(mào)公司。

1.2 方法

1.2.1 氧化葡萄糖酸桿菌的培養(yǎng)將保藏斜面菌種轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)周期2～3 d。挑取一環(huán)斜面菌種，接種于裝有50 m L種子培養(yǎng)基的150 m L搖瓶中，28℃、200 r／min搖床培養(yǎng)24 h。

按體積分?jǐn)?shù)10%接種量將種子培養(yǎng)液接入1 L發(fā)酵培養(yǎng)基中，200 r／min、28℃培養(yǎng)至對數(shù)后期（約36 h）。

1.2.2 細(xì)胞膜組分的制備離心收集菌體，收集的菌體用蒸餾水洗滌兩次后重懸于50 mmol／L醋酸鈉（p H 5.0）緩沖液中，通過勻漿機破碎細(xì)胞，利用超速離心機100 000g離心60 min，上清液為細(xì)胞質(zhì)組分，沉淀為細(xì)胞膜組分，用相同的緩沖液懸?。?－6］。

1.2.3 膜結(jié)合甘油脫氫酶的制備將膜組分重新重懸于含體積分?jǐn)?shù)1%Triton X－100的40 mmol／L、p H 5.0的醋酸鈉緩沖液中，于4℃緩慢攪伴60 min。1 000 r／min離心30 min去沉淀，上清液作為待純化的樣品。

經(jīng)過CM－Cellulose（1×10）柱和Sephacryl HR 400（1×120）凝膠層析柱得到分離純化的氧化葡萄糖酸桿菌膜結(jié)合甘油脫氫酶［7－8］。

1.2.4 甘油脫氫酶活性測定以PMS為電子受體，在催化反應(yīng)過程中檢測600 nm吸收值的變化。酶活力測定的反應(yīng)體系組成為：0.325 mmol／L PMS 0.45 m L、0.25 mmol／L DCIP 0.45 m L、100 mmol／L pH 6.0磷酸緩沖液3 m L和水4.5 m L，即配即用。首先向比色皿里加入基本反應(yīng)液0.4 m L、200 mmol／L甘油0.1 m L置于1 cm的比色皿中，30℃ 預(yù)熱5 min，600 nm下吸收值平衡，然后加入酶液10μL立即進行時間掃描。在p H 6.0下DCIP的消光系數(shù)為10.8 L／mmol，一個酶活力單位（U）定義為1分鐘還原1μmol的DCIP的酶量。

1.2.5 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測定采用Lowry法［9］測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品。稱取牛血清白蛋白10 mg，用0.15 mol／L NaCl溶液溶解，并定容至10 mL，最終質(zhì)量濃度為1 mg／mL。

1.2.6 線性循環(huán)伏安曲線線性循環(huán)伏安曲線的測定在Cs350電化學(xué)分析系統(tǒng)上進行，鉑盤電極為工作電極，鉑絲電極為對電極，飽和甘汞電極（SCE）為參比電極。所有實驗均在（28±2）℃、含0.5 mmol／L K3［Fe（CN）6］，0.1 mol／L KNO3，60 g／L甘油的電解液中進行。掃描速率為16 m V／s，掃描范圍為－200～＋500 m V。

1.2.7 生物電化學(xué)耦聯(lián)反應(yīng)生物電化學(xué)反應(yīng)的裝置見圖1。鉑盤電極為工作電極，鉑電極為對電極，飽和甘汞電極（SCE）為參比電極，向反應(yīng)容器中加入55 m L反應(yīng)液，加入5 m L（約5 U）純化后的甘油脫氫酶酶液通電后反應(yīng)開始，電壓為370 m V，反應(yīng)18 h。所有反應(yīng)均在在（28±2）℃進行。每隔2 h取1 m L反應(yīng)液，測定反應(yīng)液中甘油和二羥丙酮的含量。

圖1 生物電化學(xué)反應(yīng)裝置示意圖Fig.1 Experimental setup of bio－electrochemical preparation of 1，3－Dihydroxyacetone using GDH

1.2.8 DHA定量分析方法將反應(yīng)液離心（5 000 r／min，10 min），取0.5 m L上清液稀釋至5 m L，取0.5 m L十倍稀釋液與4.5 m L顯色液在試管中混勻，置于沸水浴中反應(yīng)15 min，流動水冷卻15 min后于分光光度計測量620 nm處的吸光值。這一方法可在甘油存在下，定量檢測出發(fā)酵液中質(zhì)量濃度為0～3.5 mg／m L的DHA［10］。

1.2.9 甘油定量分析方法使用甘油含量測定試劑盒（北京五洲原業(yè)科貿(mào)公司）測定反應(yīng)液中甘油殘余量。

2 結(jié)果與分析

2.1 膜結(jié)合甘油脫氫酶的制備

氧化葡萄糖酸桿菌膜結(jié)合甘油脫氫酶的制備主要經(jīng)過3個步驟：1）細(xì)胞膜組分的分離；2）表面活性劑溶解膜蛋白；3）CM－纖維素柱和Sephacryl HR 400（1×120）凝膠柱層析。氧化葡萄糖酸桿菌中膜結(jié)合甘油脫氫酶的蛋白質(zhì)分離純化過程見表1。

表1 膜結(jié)合蛋白的純化總表Tab.1 Purification of membrane－bound glycerol dehydrogenase from G.oxydans

氧化葡萄糖酸桿菌中存在著兩種形式的甘油脫氫酶，其中膜結(jié)合脫氫酶（EC1.1.99.22）代謝途徑是不需要ATP和輔酶因子NAD＋，甘油可被細(xì)胞膜上的甘油脫氫酶一步直接氧化成DHA，這一過程的電子傳遞鏈由泛醌、細(xì)胞色素O和細(xì)胞色素O還原性酶組成［11］。因此通過分離純化的膜結(jié)合甘油脫氫酶無法連續(xù)利用甘油催化生成DHA。

2.2 循環(huán)伏安曲線

分別向含有0.5 mmol／L K3［Fe（CN）6］，0.1 mol／L KNO3，60 g／L甘油的電解液中添加2、4、6、8 U的甘油脫氫酶，得到的循環(huán)伏安曲線見圖2。隨著甘油脫氫酶濃度的增加，還原電流響應(yīng)降低。

隨著甘油脫氫酶的加入，一部分［Fe（CN）6］3－與PQQH2反應(yīng)，見圖3。電極表面的［Fe（CN）6］3－濃度降低，還原電流相應(yīng)降低。反應(yīng)方程式為：

圖2 不同GDH濃度下鐵氰化鉀循環(huán)伏安曲線Fig.2 Cyclic Voltammogram of K3［Fe（CN）6］in the presence of GDH

通過循環(huán)伏安曲線，可以確定生物電化學(xué)法可以催化甘油脫氫酶輔基PQQ的再生，使膜結(jié)合甘油脫氫酶可以在只有電子媒介體存在而不添加任何輔酶的情況下連續(xù)催化甘油生成二羥基丙酮。

圖3 生物電化學(xué)法催化甘油生成二羥基丙酮原理Fig.3 Bio－electrochemical preparation of DHA from glycerol using GDH

2.3 生物電化學(xué)反應(yīng)

在生物電化學(xué)反應(yīng)裝置中加入含有10 mmol／L K3［Fe（CN）6］，60 g／L甘油的電化學(xué)反應(yīng)液55 m L，加入5 m L（約5 U）純化后的甘油脫氫酶，在（28±2）℃，370 m V電壓下反應(yīng)18 h。甘油脫氫酶催化甘油生成DHA反應(yīng)曲線見圖4。

圖4 生物電化學(xué)法生產(chǎn)DHA曲線Fig.4 Time courses of bio－electrochemical conversion of DHA using GDH

由圖4可見，在電化學(xué)的作用下，膜結(jié)合甘油脫氫酶可以持續(xù)催化甘油生成DHA，反應(yīng)18 h后，DHA質(zhì)量濃度達27.21 g／L，甘油轉(zhuǎn)化率達到52.93%，電耦聯(lián)反應(yīng)速率1.51 g／（L·h）。

3 結(jié) 語

通過實驗證明，生物電化學(xué)法可以持續(xù)利用氧化葡萄糖酸桿菌膜結(jié)合甘油脫氫酶制備1，3－二羥基丙酮，而不需要添加其他輔酶。18 h內(nèi)DHA的質(zhì)量濃度達到27.21 g／L，甘油轉(zhuǎn)化率為52.93%。

與傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵法和酶法相比，電耦聯(lián)法生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物較少，有利于DHA分離和純化；且操作簡單不需要添加大量輔酶，有利于節(jié)約成本。

作者只針對生物電化學(xué)法催化甘油生成DHA可行性進行了初步研究，生物電化學(xué)法應(yīng)用于生產(chǎn)中仍需要對膜結(jié)合甘油脫氫酶的分離純化以及反應(yīng)條件進一步研究和優(yōu)化。

（References）：

［1］宋如，錢仁淵，仝艷.等.二羥基丙酮生產(chǎn)研究進展［J］.化工技術(shù)與開發(fā)，2009，38（7）：25－30.

SONG Ru，QIANG Ren－yuan，TONG Yan，et al.Research advances in Dihydroxyace－tone production［J］.Technology and Development of Chemical Industry，2009，38（7）；25－30.（in Chinese）

［2］方柏山，陳宏文.一種由生物催化轉(zhuǎn)化甘油制備1，3－丙二醇和二羥基丙酮的方法：CN1840668 A［P］，2006－01－27.

［3］Nemeth A，Balassy A，Sevella B.Difficulties and solutions for the assays of the key enzymes of a new enzymatic glycerol bioconversion［J］.Period Polytech Chem Eng，2008，52（1）：17－22.

［4］劉耀平，徐明愷，金玉蘭，等 .氧化葡萄糖酸桿菌酶學(xué)和分子生物學(xué)研究［J］.微生物學(xué)雜志，2003，23（3）：39－47.

LIU Yao－ping，XU Ming－kai，JIN Yu－lan，et al.Effect of antibiotics on pathogenic microbes［J］.Journal of Microbiology，2003，23（3）：39－47.（in Chinese）

［5］Yang X P，Wei L J，Lin J P，et al.Membrane－bound pyroloquinoline quinone－dependent dehydrogenase inGluconobacteroxydansM5，responsible for production of 6－（2－h(huán)ydroxyethyl）Amino－6－deoxy－L－sorbose［J］.Applied and Environmental Microbiology，2008，74（16）：5250－5253.

［6］韋柳靜，林金萍，楊雪鵬，等.氧化葡萄糖酸桿菌DSM 2003膜結(jié)合乙醇脫氫酶的純化鑒定和性質(zhì)研究［J］.食品科學(xué)，2010，34（13）：164－168.

WEI Liu－Jin，LIN Jin－Ping，YANG Xue－peng，et al.Purification，identification and characterization of membrane－bound alcohol dehydrogenase fronGluconobacteroxydansDSM 2003［J］.Food Science，2010，34（13）：164－168.（in Chinese）

［7］Ameyama M，Shinafawa E，Matsushita K，et al.Solubilization，purification and properties of membrane－bound glycerol dehydrogenase fromGluconobacterindustrius［J］.Agric Biol Chem，1985，49（4）：1001－1010.

［8］陳宏，吳雅紅，吳振華，等.克雷伯桿菌甘油脫氫酶的分離純化及性質(zhì)［J］.無錫輕工大學(xué)學(xué)報，2005，24（1）：1－5.

CHEN Hong，WU Ya－h(huán)ong，WU Zhen－h(huán)ua，et al.Purification and characterization of glycerol dehydrogenase fromKlebsiellapneumoniae［J］.Journal of Wuxi University of Light Indusrty，2005，24（1）：1－5.（in Chinese）

［9］Lowry O，Rosebrough N，F(xiàn)arr A，et al.Protein measurement with the Folin phenol reagent［J］.Journal of Biological Chemistry，1951，193（1）：265－275.

［10］鄭裕國，張霞，沈寅初 .微生物轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1，3二羥基丙酮的菌株篩選［J］.浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2001，9（2）：124－127.

ZHENG Yu－guo，ZHANG Xia，SHEN Yan－chu.Screening of 1，3－dihydroxyacet on producing strain using glycerol as bioconversion substrate［J］.Journal of Zhejiang University of technology，2001，9（2）：124－127.（in Chinese）

［11］孫麗慧，胡忠策，鄭裕國，等.微生物法生產(chǎn)1，3－二羥基丙酮代謝工程研究進展［J］.生物工程學(xué)報，2010，26（9）：1218－1224.

SUN Li－h(huán)ui，HU Zhong－che，ZHENG Yu－guo，et al.progress in metabolic engineering of microbial production of 1，3－dihydroxyacetone［J］.Chinese Journal of Biotechnology，2010，26（9）：1218－1224.（in Chinese）

Bio－Electrochemical Synthesis of 1，3－Dihydroxyacetone from Glycerol

ZHANGYu－wei1，2，YANGXue－peng2，WEIDong－zhi2，AIZhi－lu＊1

（1.College of Food Science and Technology，He＇nan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China；2，College of Food and Biological Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，China）

The membrane－bound glycerol dehydrogenase（GDH）was the key enzyme of biocon version of glycerol to 1，3－dihydroxyacetone byGluconobacteroxydans.The membrane fraction ofGluconobacteroxydanswas collected by ultra－centrifugation，and GDH was isolated from the membrane fraction and purified by CM－cellulose column and Sephacryl HR 400 column chromatography.The electrochemical regeneration of the membrane－bound glycerol dehydro genase was studied by cyclic voltammetry.Using this system，the bio－electrochemical preparation of 1，3－dihydroxyacetone（DHA）from glycerol without coenzyme was investigated.When the temperature was 28±2℃，during 18 h，the DHA production reached at 27.21g／L and the conversion rate of glycerol was 52.93%.

1，3－dihydroxyacetone，glycerol dehydrogenase，bio－electrochemistry，Gluconobacteroxydans

Q 815

A

1673－1689（2012）03－0266－05

2011－03－04

國家自然科學(xué)基金項目（20976053）；鄭州輕工業(yè)學(xué)院博士科研基金項目。

＊

艾志錄（1965－），男，河南輝縣人，工學(xué)博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事農(nóng)產(chǎn)品精深加工方面的研究。E－mail：zhila＠163.com