利用沼澤紅假單胞菌降低地下巖溶水中硫酸鹽含量的研究

王蘭，李佳月

（山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

利用沼澤紅假單胞菌降低地下巖溶水中硫酸鹽含量的研究

王蘭，李佳月

（山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

地下巖溶水中含有大量Ca2＋、Mg2＋、Na＋、K＋、SO2－4離子，具有高礦化度、高硬度、高硫酸鹽含量的特質(zhì)，不能直接使用;利用微生物降解處理巖溶水有益于保護(hù)環(huán)境.實驗選用沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudanonaspalustris），分別采用單獨使用沼澤紅假單胞菌處理、加入沼澤紅假單胞菌生長所需營養(yǎng)成分處理、用聚合氯化鋁絮凝沼澤紅假單胞菌處理等三種方法，對小店區(qū)地下巖溶水中的硫酸鹽進(jìn)行處理，旨在降低硫酸鹽含量，達(dá)到飲用水標(biāo)準(zhǔn)，有效利用山西省太原市小店區(qū)的水資源.結(jié)果顯示，沼澤紅假單胞菌可以降解巖溶水的硫酸鹽，且用聚合氯化鋁絮凝沼澤紅假單胞菌后在厭氧光照條件下處理效果更好，可以使硫酸鹽含量由原來的1 996.91 mg／L降為720.24 mg／L.單獨使用沼澤紅假單胞菌處理時，當(dāng)菌液體積比巖溶水體積為1∶3，處理4 d時，巖溶水中硫酸鹽含量降到最低，且菌密度呈下降趨勢;加入沼澤紅假單胞菌生長所需的營養(yǎng)成分后，其菌密度隨處理時間的延長而增大，水中硫酸鹽含量呈降低趨勢;用濃度為0.01 mol／L的聚合氯化鋁絮凝沼澤紅假單胞菌，60 min菌體絮凝效果最佳，同時用其處理巖溶水中的硫酸鹽效果更好.

沼澤紅假單胞菌;巖溶水;硫酸鹽

巖溶水是一類具有高礦化度、高硬度、高硫酸鹽含量的特殊水質(zhì)，其中主要含有Ca2＋、Mg2＋、Na＋、K＋、SO2－4等離子，可溶性固體總含量大于1 g／L，多呈中性或偏堿性，且?guī)Э酀?如果高礦化度、高硬度及高硫酸鹽含量的地下巖溶水不經(jīng)過處理直接排放，就會給生態(tài)環(huán)境帶來一定的危害.主要表現(xiàn)為河流水含鹽量上升、淺層地下水位抬高、土壤滋生鹽堿化、不耐鹽堿類林木種勢削弱、農(nóng)作物減產(chǎn)等［1－3］;同時，因為許多工業(yè)生產(chǎn)用水不能用高含鹽量的水，因此影響分布地區(qū)的工業(yè)生產(chǎn)，故應(yīng)該先降低水中的含鹽量，但這會增加成本.為了避免地下水資源的浪費，影響地區(qū)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，必須要處理巖溶水以達(dá)到用水要求.

小店區(qū)位于山西省太原市的南部，水資源嚴(yán)重缺乏，其地下水質(zhì)屬于巖溶水.近年來，由于工業(yè)化和城市化的加速發(fā)展，致使污水和廢水的排放量日趨增多，也造成地表及地下水資源嚴(yán)重污染.因此，開發(fā)新的水資源并對已有水資源的處理再利用，不僅能夠解決小店區(qū)用水問題，而且可以改善小店區(qū)生態(tài)環(huán)境.目前，我國降低巖溶水含鹽量的方法主要有投加化學(xué)藥劑法、離子交換法、電滲析法、反滲透法等.但無論用哪種方法脫鹽，面臨的成本問題都比較嚴(yán)重.利用微生物降解處理巖溶水，不僅能夠降低成本，而且處理過程無大量有機污染物排放，有益于環(huán)境的保護(hù)，是巖溶水處理方面的新突破.沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudanonaspalustris）是近年來水質(zhì)凈化常用的光合細(xì)菌［4－5］，可用于水質(zhì)凈化、污水處理、飼料和微生物添加劑等［6－7］.鑒于此，本實驗選用沼澤紅假單胞菌對太原市小店區(qū)地下巖溶水中的硫酸鹽進(jìn)行處理，降低硫酸鹽含量，達(dá)到凈化水質(zhì)的目的，最終達(dá)到飲用水標(biāo)準(zhǔn)（250～900 mg／L）.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種與材料

菌種：沼澤紅假單胞菌PSB-J030323：由山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院光合細(xì)菌研究室提供;巖溶水：采于山西省太原市小店區(qū)水井中;基礎(chǔ)培養(yǎng)基（g／L）［8］：K2HPO40.9 g，KH2PO40.6 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NH4Cl 1.0 g，CaCl2·2H2O 0.05 g，酵母膏0.4 g，D.L蘋果酸2.0 g，p H＝6.7超純水1 000 m L.

1.1.2 藥品及試劑

聚合氯化鋁（PAC），購于怡清凈水材料公司;鉻酸鋇溶液：稱取鉻酸鋇（AR）2.5 g溶于1.0 mol／L鹽酸溶液中并定容至100 m L，每5 m L該溶液作用于50 m L水樣中可沉淀48 mg S;硫酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液：S標(biāo)液（濃度為1 000μg／m L）;2.5 mol／L鹽酸溶液;氨水.

1.1.3 主要儀器

Spectra Max M5多功能酶標(biāo)儀（美國），Thermo MR23i高速冷凍離心機（美國）.

1.2 實驗方法

1.2.1 沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)和菌密度測定

在無菌條件下，將20 m L沼澤紅假單胞菌菌液接入100 m L已配好的培養(yǎng)基中，30℃厭氧靜置培養(yǎng)，光照（2 000 Lx）6 d后備用.

取2 m L沼澤紅假單胞菌菌液于離心管中，6 000 r／min離心15 min后，棄上清液.蒸餾水洗滌1次，將洗滌后的沉淀再加2 m L蒸餾水搖勻，吸取200μL加入酶標(biāo)板中，酶標(biāo)儀測其OD值（A＝375 nm）.

1.2.2 沼澤紅假單胞菌絮凝

聚合氯化鋁（PAC）絮凝劑絮凝［9］：在4個200 m L燒杯中各加入100 m L沼澤紅假單胞菌液后，再加入濃度分別為0、0.006、0.008、0.010 mol／L聚合氯化鋁絮凝劑，每個濃度設(shè)3個平行.100 r／min攪拌13 min后，分別靜置5、30和60 min，在距液面下3 cm處取2 m L樣品，離心去上清，加蒸餾水稀釋至2 m L，測定在500 nm下的光密度值（OD500），由OD500的變化量確定沼澤紅假單胞菌細(xì)胞的絮凝效果.

1.2.3 沼澤紅假單胞菌厭氧和絮凝處理巖溶水

將20、40、60、80 m L不同體積的沼澤紅假單胞菌菌液離心（6 000 r／min，15 min），棄上清，蒸餾水洗滌一次，分離沉淀、無菌操作、接入裝有120 m L巖溶水的厭氧瓶中，每組分別處理0、1、2、3、4、5和6 d，30℃厭氧靜置光照（2 000 Lx）培養(yǎng)，每天隨機取樣，并測定硫酸鹽含量.

將40 m L的沼澤紅假單胞菌菌液離心（6 000 r／min，15 min），棄上清，加入0.01 mol／L聚合氯化鋁絮凝劑絮凝，100 r／min攪拌60 min后，將絮凝沼澤紅假單胞菌菌體無菌操作接入裝有120 m L巖溶水的厭氧瓶中，30℃，光照（2000 Lx），厭氧靜置，處理0、1、2、3、4、5和6 d，隨機取樣并測定巖溶水中硫酸鹽含量.

1.2.4 巖溶水中硫酸鹽含量測定

取水樣5 m L，超純水稀釋至50 m L，置于150 m L錐形瓶中.另取10個150 m L錐形瓶，分別加入0、0.25、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、8.00、10.00 m L硫酸鹽標(biāo)準(zhǔn)液加超純水至50 m L.再分別各加1 m L 2.5 mol／L鹽酸溶液，加熱煮沸5 min后各加2.5 m L鉻酸鋇溶液，再煮沸5 min.待冷卻后，向各瓶逐滴加入氨水至呈檸檬黃色.用慢速定性濾紙過濾，濾液收集于50 m L比色管內(nèi)，用超純水洗滌錐形瓶及濾紙2次，收集于比色管中，加超純水至刻度，混勻，于酶標(biāo)儀420 nm測定其吸光度，超純水為空白對照，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并用（1）式計算巖溶水樣中S的濃度［10－11］：

2 結(jié)果

2.1 沼澤紅假單胞菌厭氧處理巖溶水

2.1.1 巖溶水中硫酸鹽含量測定

由圖1-A、1-B得知，與對照組相比，用沼澤紅假單胞菌在厭氧條件下處理巖溶水，其硫酸鹽含量均呈現(xiàn)下降的趨勢.同一菌液體積處理1－6 d，巖溶水中硫酸鹽含量除80 m L菌液體積之外基本表現(xiàn)出先降后升;隨著接入菌液的體積增大，巖溶水中硫酸鹽含量表現(xiàn)出下降的趨勢，在2 d、6 d的時間段中，隨著菌液體積的增加，其硫酸鹽含量逐漸下降，且在第4天、40 m L菌液體積條件下，硫酸鹽含量明顯下降并降到最低值.

由圖1知，用圖標(biāo)法（即鉻酸鋇分光光度法）測企巖溶水中硫酸鹽含量，得出：未處理的巖溶水水樣中硫酸鹽含量為1 996.91 mg／L，經(jīng)降解可以達(dá)到720.24 mg／L.

圖1-A 沼澤紅假單胞菌不同菌液體積處理巖溶水中硫酸鹽OD值Fig.1-A Sulphate content in the karst water after adding the different volume of Rhodopseudanonaspalustris

圖1-B 沼澤紅假單胞菌處理不同時間巖溶水中硫酸鹽OD值Fig.1-B Sulphate content in the karst water with Rhodopseudanonaspalustris for the different treatment time

2.1.2 巖溶水中沼澤紅假單胞菌的菌密度

觀察圖2-A、2-B發(fā)現(xiàn)，用沼澤紅假單胞菌厭氧處理巖溶水，在同一菌液體積下，隨著處理時間的延長，巖溶水中沼澤紅假單胞菌菌密度逐漸下降.與對照組相比，用沼澤紅假單胞菌處理1－6 d，其菌密度呈下降趨勢.選取相同的處理時間段，隨著接入菌液的體積增大，巖溶水中沼澤紅假單胞菌菌密度呈上升趨勢.

圖2-A 不同菌液體積下巖溶水中沼澤紅假單胞菌的菌密度OD值Fig.2-A Density of Rhodopseudanonaspalustris in the karst water in the different volume

圖2-B 不同處理時間巖溶水中沼澤紅假單胞菌的菌密度OD值Fig.2-B Density of Rhodopseudanonaspalustris for the karst water for the different treatment time

2.1.3 在巖溶水中加入沼澤紅假單胞菌所需營養(yǎng)成分

圖3（P391）顯示，與對照組相比，在巖溶水中加入沼澤紅假單胞菌所需營養(yǎng)成分后，沼澤紅假單胞菌的菌密度均呈現(xiàn)上升趨勢.同一菌液體積處理0－6 d，巖溶水中沼澤紅假單胞菌的菌密度不斷增大.同一處理時間，巖溶水中沼澤紅假單胞菌的菌密度也隨著接入菌液體積的增加而增加.在1－3 d時間段，沼澤紅假單胞菌的菌密度變化最為明顯;而4－6 d，雖然沼澤紅假單胞菌的菌密度依然在增大，但是增幅不明顯.

觀察圖4（P391），與對照組相比，用不同體積的沼澤紅假單胞菌處理巖溶水，同時加入沼澤紅假單胞菌所需營養(yǎng)成分，在1－6 d的處理時間段，結(jié)果發(fā)現(xiàn)巖溶水中硫酸鹽OD值均呈下降趨勢（即硫酸鹽含量均呈下降趨勢）.

在20、40 m L沼澤紅假單胞菌菌液體積中，處理1－6 d，巖溶水中硫酸鹽含量呈逐漸降低趨勢.而在10、30 m L菌液體積處理組中，1－5 d巖溶水中硫酸鹽含量在漸漸下降，但第6天時，硫酸鹽含量略有升高.

圖3 在巖溶水中加入沼澤紅假單胞菌營養(yǎng)成分后不同菌液體積下的菌密度OD值Fig.3 Density of Rhodopseudanonaspalustris in the karst water in the different volume by adding nutrients

圖4 加入營養(yǎng)成分后不同沼澤紅假單胞菌菌液體積下巖溶水中硫酸鹽含量變化Fig.4 Sulphate content in the karst water in the different volume of Rhodopseudanonaspalustris after adding nutrients

圖5-A 不同濃度聚合氯化鋁絮凝效果Fig.5-A Effects of PAC flocculation for the different concentration

圖5-B 不同時間聚合氯化鋁絮凝效果Fig.5-B Effects of PAC flocculation for the different treatment time

2.2 沼澤紅假單胞菌的固定化

由圖5-A、5-B可知，和對照組相比，用聚合氯化鋁（PAC）絮凝劑處理沼澤紅假單胞菌菌液后，各處理組中沼澤紅假單胞菌的菌密度均高于對照組，且同一濃度的聚合氯化鋁作用時間越長，菌體聚合效果越好.在0.01 mol／L處理組，沼澤紅假單胞菌的絮凝效果隨時間的延長效果越明顯，而0.008 mol／L和0.006 mol／L處理組，絮凝效果變化較為緩慢，但在60 min時絮凝效果最好.同一作用時間，聚合氯化鋁濃度越高，菌體絮凝效果相對較好，5 min和30 min處理組沼澤紅假單胞菌的絮凝效果變化趨勢盡管沒有60 min明顯，但是在聚合氯化鋁濃度為0.010 mol／L時絮凝效果最佳.

2.3 絮凝沼澤紅假單胞菌處理巖溶水中的硫酸鹽

由圖6顯示，利用0.010 mol／L的聚合氯化鋁絮凝沼澤紅假單胞菌60 min后處理巖溶水發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，絮凝后處理巖溶水中硫酸鹽的含量較不絮凝的要低.處理1－3 d，絮凝組中巖溶水中硫酸鹽含量明顯下降.

圖6 絮凝和不絮凝沼澤紅假單胞菌處理巖溶水中硫酸鹽的含量比較Fig.6 Contrast of sulfate content in the karst water by flocculation and not flocculation Rhodopseudanonaspalustris

3 討論

微生物法凈化水以其高效率、低成本、見效快的特點備受關(guān)注.在應(yīng)用于凈水的微生物中主要有光合細(xì)菌、芽孢桿菌、硝化細(xì)菌、硫酸鹽還原菌等.傳統(tǒng)的微生物法降低水中高濃度硫酸鹽即為硫酸鹽還原菌法，但有缺點，主要表現(xiàn)為：①硫被還原成為H2S，而H2S有惡臭且有毒，若不能妥善處理，將造成二次污染.②H2S對反應(yīng)系統(tǒng)中菌群有一定的抑制作用，從而影響凈水效果.光合細(xì)菌可以利用多種有機物作為碳源，利用光能進(jìn)行高產(chǎn)的能量代謝，其前期投資小、可操作性強、本身無毒無害，不會在處理水域?qū)θ?、畜造成危害，是處理有機廢水常用的微生物之一，應(yīng)用前景非常廣闊［12－14］.

沼澤紅假單胞菌是近年來水質(zhì)凈化研究中最常用的光合細(xì)菌［15－19］.它以光作為能源、在厭氧光照或好氧黑暗條件下利用各種有機物作為電子供體使硫酸鹽作為最終電子受體并還原為硫化物，硫化物作為供氫體兼碳源進(jìn)行光合作用，通過光合磷酸化獲得能量.沼澤紅假單胞菌在水中光照條件下可直接利用降解有機質(zhì)和硫化氫并使自身得以增殖，同時達(dá)到凈化水體、降解巖溶水中硫酸鹽的作用.

沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)的條件為：①光照：室內(nèi)用25～60 W白熾燈作光源，光強度一般為2000 Lx.②p H值：生長的酸堿度范圍為微酸性到中性，即6.5～7.5.③溫度：適宜溫度10～40℃，最適溫度28～30℃.因此在上述基礎(chǔ)上，選擇改變沼澤紅假單胞菌菌液接入體積和處理巖溶水的時間來觀察巖溶水中硫酸鹽含量的變化趨勢.

經(jīng)沼澤紅假單胞菌處理后的巖溶水中硫酸鹽含量有明顯降低趨勢.由本實驗結(jié)果結(jié)合沼澤紅假單胞菌生長曲線［4］分析可知，處理1－4 d，雖然巖溶水中沼澤紅假單胞菌的菌密度呈下降趨勢，但趨勢不明顯，且1－4 d沼澤紅假單胞菌的生長處于延滯期和對數(shù)生長期，菌體各種成分均勻，菌體活力旺盛，酶系代謝活躍，故對巖溶水中硫酸鹽降解效果明顯，即巖溶水中硫酸鹽含量下降明顯.處理5－6 d，由于沼澤紅假單胞菌的菌密度呈明顯下降趨勢，且5－7 d菌體處于穩(wěn)定期，表明該期的菌體正生長與負(fù)生長平衡.但是隨著處理時間的延長，菌體中酶系活力整體下降，巖溶水中供菌體生長的營養(yǎng)物質(zhì)減少且比例失調(diào)，有害代謝產(chǎn)物積累，p H、氧化還原勢等物理化學(xué)條件越來越不適宜，導(dǎo)致菌體活力減?。?0－21］，從而用以處理巖溶水中硫酸鹽的作用力下降，巖溶水中硫酸鹽含量略有回升.同時硫酸根也不能作為沼澤紅假單胞菌生長的唯一碳源和能源.當(dāng)有大量的硫酸根存在，超過了菌生長所需，將不會促進(jìn)沼澤紅假單胞菌菌生長，需要補充一定量的碳源.因此，在巖溶水處理中應(yīng)加入一定的營養(yǎng)成分，以保障沼澤紅假單胞菌的正常生長，進(jìn)而保持沼澤紅假單胞菌對巖溶水中硫酸鹽的降解作用力.

在流水條件下游離態(tài)的光合細(xì)菌易被水流沖走，在靜水條件下又易被其他生物所食［22］.將光合細(xì)菌同載體結(jié)合并絮凝固定化，經(jīng)固定化后的光合細(xì)菌，能有效地阻隔氧氣與菌體的接觸［23］，從而形成厭氧環(huán)境;同時，光合細(xì)菌能夠保持活力，也能夠自動更替菌膜［24］，大大提高了菌體的作用時效，使其能穩(wěn)定發(fā)揮降解效能［25－28］.另外，光合細(xì)菌固定化易形成優(yōu)勢菌種，更加有利于硫酸鹽的降解.而投放菌液，則由于曝氣作用，不利于光合細(xì)菌的繁殖.因此只有少部分微生物起降解作用［29－30］，所以應(yīng)將沼澤紅假單胞菌絮凝固定化之后，再處理巖溶水中的硫酸鹽，以求達(dá)到更好的降解效果.

4 結(jié)論

（1）在添加沼澤紅假單胞菌菌液體積的選取上，當(dāng)菌液體積為40 m L、巖溶水體積為120 m L（即菌液體積∶巖溶水體積＝1∶3）時，巖溶水中硫酸鹽含量明顯下降.整體而言，在相同待測巖溶水體積條件下，伴隨著添加菌液體積的增大，巖溶水中硫酸鹽含量呈下降趨勢.

（2）同一體積沼澤紅假單胞菌處理巖溶水，隨著作用時間的延長，沼澤紅假單胞菌菌密度呈下降趨勢.

（3）加入沼澤紅假單胞菌生長所需的營養(yǎng)成分后，其菌密度隨處理時間的延長而增大，同時利用其處理巖溶水，水中硫酸鹽含量呈降低趨勢，但在處理5 d時硫酸鹽含量基本不發(fā)生變化.

（4）由本實驗結(jié)果得出，當(dāng)聚合氯化鋁濃度為0.01 mol／L、絮凝時間60 min時，沼澤紅假單胞菌菌體絮凝效果最佳，用該條件下絮凝的菌體處理巖溶水中的硫酸鹽效果更好.

（5）太原市小店區(qū)巖溶水中硫酸鹽的含量為1 996.91 mg／L，經(jīng)光合細(xì)菌沼澤紅假單胞菌降解處理后其硫酸鹽的含量可以達(dá)到飲用水的標(biāo)準(zhǔn)，即720.24 mg／L.

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Effects of Photosynthetic BacteriumRhodopseudanonas palustrison Reduction Sulphate Contents in the Karst Water

WANG Lan，LI Jia-yue
（SchoolofLifeScience，ShanxiUniversity，Taiyuan030006，China）

Underground karst water contains large amounts ions of Ca2＋，Mg2＋，Na＋，K＋and SO2－4，with the characteristics of higher salinity，higher hardness，higher sulphate content，and it could not be used directly.It is beneficial to protect the environment by using of microbial degradation to deal with the karst water.The authors choosed photosynthetic bacterium，Rhodopseudanonaspalustris，to handle the karst water with three kinds of methods in order to reduce the sulphate content in Xiaodian，Taiyuan，Shanxi province and to meet drinking water standards.One way is only use ofR.palustris.Two way is adding growth nutrients ofR.palustrisrequired.The last way is polymerization aluminium chlorination（PAC）flocculationR.palustris.The results showed thatR.palustrisnot only could decrease the sulfate of the karst water under anaerobic light conditions，but also could reduce the sulfate content from 1 996.91 mg／L to 720.24 mg／L.Meanwhile，it is better with the treatment effect of PAC flocculationR.palustris.The sulfate content of the karst water was down to the lowest when usedR.palustristo process the karst water for four days with theR.palustrisratio the karst water 1∶3，and bacterial density showed a downward trend.The sulfate content in the krast water was reduced when added the nutrients needed ofR.palustrisgrowth，and bacterial density increased with treatment time.It is better effect to deal with karst water of sulfate when using 0.01 mol／L PAC flocculationR.palustrisfor 60 min.

Rhodopseudanonaspalustris;karst water;sulphate

X820.4

A

0253-2395（2012）02-0388-07＊

2012-01- 09;

2012-03-24

山西省煤炭地質(zhì)水文勘查研究院－山西大學(xué)合作項目（20090508）

王蘭（1960－），女，山西太原人，博士，教授，主要研究方向：典型環(huán)境污染物的生物學(xué)效應(yīng)與分子機制.Email：Lanwang＠sxu.edu.cn