頭孢噻肟對人外周血淋巴細胞鈣信號轉(zhuǎn)導作用的研究

董川，蘆冬濤，喬曉娜，慕麗曉，雙少敏

（山西大學 環(huán)境科學與工程中心，山西 太原 030006）

頭孢噻肟對人外周血淋巴細胞鈣信號轉(zhuǎn)導作用的研究

董川，蘆冬濤，喬曉娜，慕麗曉，雙少敏

（山西大學 環(huán)境科學與工程中心，山西 太原 030006）

以人外周血淋巴細胞為模型，利用穩(wěn)態(tài)熒光法研究該模型在外源藥物頭孢噻肟刺激下，細胞鈣穩(wěn)態(tài)的變化，同時考察了鈣-ATP酶活性與鈣穩(wěn)態(tài)之間的關(guān)系.研究發(fā)現(xiàn)，在低濃度組的頭孢噻肟鈉（0.005 g／L）刺激下，淋巴細胞內(nèi)鈣離子濃度略有增加，而胞外的鈣離子濃度幾乎沒有發(fā)生變化.當藥物濃度繼續(xù)增加，胞內(nèi)鈣離子濃度逐漸減少，藥物濃度與胞內(nèi)鈣離子濃度呈現(xiàn)出一定的劑量－效應關(guān)系.不同藥物處理組的鈣-ATP酶活性與對照組相比均降低，呈現(xiàn)出一定的劑量－效應關(guān)系.

淋巴細胞;鈣信號轉(zhuǎn)導;Fura-2 AM

Ca2＋作為細胞內(nèi)第二信使，行使著一系列復雜的生理功能，參與神經(jīng)、肌肉的活動和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，調(diào)節(jié)心律、降低心血管的通透性等［1－2］.近年來，人體內(nèi)鈣離子信號轉(zhuǎn)導的研究已成為化學及生物醫(yī)學等領(lǐng)域的研究熱點.以熒光探針法檢測細胞內(nèi)鈣離子是一種靈敏的檢測手段［3－4］.Fura-2是一種比率型熒光探針，與鈣離子結(jié)合后其熒光顯著增強，激發(fā)光譜發(fā)生位移，360 nm處存在一個等吸收點，采用340 nm和380 nm處的兩個熒光比值來檢測細胞內(nèi)的鈣離子濃度，可以消除由細胞厚度和探針數(shù)量等可變因素所造成的影響［5］.

頭孢噻肟（Cefotaxime，CTX）作為臨床中廣泛使用的抗生素藥物具有良好的抗菌效果，然而，臨床病原菌對頭孢噻肟逐漸產(chǎn)生耐藥性，對于頭孢噻肟介導的細胞信號網(wǎng)絡研究逐漸引起重視［6－7］.本文利用Fura-2作為熒光探針研究了頭孢噻肟刺激下人外周血淋巴細胞鈣穩(wěn)態(tài)的變化，同時對與鈣穩(wěn)態(tài)相關(guān)的鈣-ATP酶活性進行了研究，探討了頭孢噻肟刺激下，淋巴細胞鈣信號的轉(zhuǎn)導作用.

圖1 頭孢噻肟的結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of Cefotaxime

1 實驗方法

1.1 主要儀器和試劑

Varian Cary Eclipse熒光分光光度計（美國Varian公司），Spectra Max M5酶標儀（美國分子儀器公司），L-600型離心機（湖南湘儀儀器有限公司）.Fura-2，F(xiàn)ura-2 AM，HEPES，均為Sigma公司產(chǎn)品，注射用頭孢噻肟鈉為珠海聯(lián)邦制藥公司產(chǎn)品，人淋巴細胞分離液為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品，鈣-ATPase測定試劑盒，考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒均購于南京建成生物公司.實驗用水均為超純水（電阻達18.25 MΩ），其它試劑均為國產(chǎn)分析純.

Na＋緩沖生理液的配制：稱取NaCl 0.409 5 g，KCl 0.018 4 g，MgCl2·6H2O 0.010 2 g，葡萄糖0.049 5 g，HEPES 0.119 1 g，在燒杯中充分溶解后，轉(zhuǎn)移至50 m L的容量瓶中定容，搖勻得含140 mmol／L NaCl，5 mmol／L KCl，1 mmol／L MgCl2，5.5 mmol／L葡萄糖，10 mmol／L HEPES的緩沖液，用氫氧化鈉調(diào)至p H為7.5，4℃保存?zhèn)溆?

1.2 人外周血淋巴細胞的分離與培養(yǎng)［8］

采集新鮮的人血液，用生理鹽水稀釋后緩慢倒入等量的人淋巴細胞分離液，離心25 min（2500 r／min），取中間白色的條帶淋巴細胞層，加入4倍量的鈉離子緩沖液，離心10 min（1 500 r／min），取沉淀.將分離后的淋巴細胞接種到含有植物血球凝集素的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng).隨后用于實驗測定.

1.3 細胞內(nèi) Fura-2 AM 的孵育［6］

取細胞濃度105個／m L的人外周血淋巴細胞2 m L，將2μL Fura-2 AM在37℃恒溫水浴中與細胞孵育40 min后，離心10 min（1 000 r／min），棄上清液以洗去沒有進入細胞的Fura-2 AM，溶于預先配好的Na＋緩沖生理液，得到含有Fura-2 AM的細胞.

1.4 鈣離子濃度的測定

取含有Fura-2 AM的人淋巴細胞2 m L，固定其熒光發(fā)射在505 nm處，熒光儀上測出340 nm處與380 nm 處的熒光比值，3 min后加入不同濃度的頭孢噻肟鈉（0.005 g／L，0.05 g／L，0.5 g／L，1 g／L，2 g／L），繼續(xù)掃描340 nm處與380 nm處的熒光比值，10 min后加入Fura-2測定細胞外的鈣離子濃度，由（1）式將實驗中所測得的熒光比值轉(zhuǎn)化為鈣離子濃度［5］：

Kd為Fura-2和Ca2＋絡合物的解離常數(shù)，Rmax為加入Triton X-100測得最大熒光比值，Rmin為加入EDTA測得最小熒光比值，Sf／Sb是380 nm處沒有Ca2＋和Ca2＋飽和時測得的熒光強度比值.

1.5 鈣-ATP酶活性的測定［9］

通過測定無機磷的量可判斷鈣ATP酶活力的高低，測定通過鈣-ATP酶試劑盒完成，總蛋白含量通過考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒完成.

2 結(jié)果與討論

2.1 頭孢噻肟對淋巴細胞鈣穩(wěn)態(tài)的影響

圖2（P335）為人外周血淋巴細胞在不同濃度頭孢噻肟鈉刺激下Fura-2的熒光比值，圖3（P335）為不同濃度頭孢噻肟鈉刺激下胞內(nèi)外鈣離子濃度變化.結(jié)合圖2、3可以看出，在低濃度的頭孢噻肟鈉（0.005 g／L）刺激下，瞬間胞內(nèi)鈣離子濃度略有增加，隨后鈣離子濃度又返回靜息狀態(tài)下濃度，在胞外也檢測出鈣離子存在，但是胞外鈣離子濃度遠低于胞內(nèi)鈣離子濃度.當藥物濃度增加至0.05 g／L時，瞬間胞內(nèi)鈣離子濃度略有減少，而胞外鈣離子濃度依然變化不大，說明當藥物濃度較低時，細胞內(nèi)鈣離子濃度輕微波動，少量鈣離子從細胞內(nèi)排出，胞外鈣離子濃度變化較低.而當藥物濃度持續(xù)增加時，胞內(nèi)鈣離子的濃度則持續(xù)減少，此時胞內(nèi)鈣離子大量排出胞外，在藥物劑量為0.5 g／L刺激時，胞外鈣離子濃度最大.

2.2 頭孢噻肟對淋巴細胞鈣穩(wěn)態(tài)影響下的鈣-ATP酶活性

為避免胞內(nèi)過高Ca2＋濃度對細胞產(chǎn)生損傷，細胞通過各種通道將Ca2＋排出胞外或重攝入鈣庫，質(zhì)膜的Ca2＋轉(zhuǎn)運主要依靠鈣泵和 Na＋／Ca2＋交換器［10］.此外，質(zhì)膜上還存在有鈣庫操縱的Ca2＋離子通道［11］.由圖4可以看出，當藥物濃度較低時，即頭孢噻肟鈉濃度為0.005 g／L和0.05 g／L時，鈣-ATP酶活性降低，胞內(nèi)鈣離子的變化幅度也不大，胞外鈣離子濃度幾乎不變.而當藥物濃度濃度繼續(xù)增加時，鈣-ATP酶活性降低，可能是線粒體功能障礙，ATP生成減少，細胞能量代謝障礙，導致鈣泵活性降低.Yang等［12］報道，樂果能顯著抑制骨骼肌細胞線粒體和胞漿中的Ca2＋-ATP酶活性.本試驗亦得出類似結(jié)論，不同藥物處理組的Ca2＋-ATP酶活性與對照組相比均降低，呈現(xiàn)出一定的劑量－效應關(guān)系.

圖2 人淋巴細胞內(nèi)加入不同濃度頭孢噻肟鈉后Fura-2的熒光比率Fig.2 Ratio of Fura-2 in lymphocyte after the addition of different concentrations of CTX

圖3 不同濃度頭孢噻肟對人淋巴細胞胞內(nèi)外鈣離子濃度的影響Fig.3 Effect of different concentrations of cefotaxime on［Ca2＋］in lymphocytes

圖4 人淋巴細胞中加入不同濃度的頭孢噻肟鈉后鈣ATP酶的活性Fig.4 Effect of CTX on the activity of Ca2＋ -ATPase in human lymphocyte

鈣離子作為細胞內(nèi)重要的信使，行使著一系列復雜的生理功能，參與肌肉收縮、蛋白質(zhì)分泌、基因表達等眾多生命活動，細胞內(nèi)鈣信號的傳遞是一個復雜的生物過程，鈣離子的波動是一系列信號網(wǎng)絡傳遞信號的結(jié)果［13］.IP3受體鈣通道與RyR受體通道是細胞中的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等鈣庫釋放鈣離子的主要通道［14－15］，在低濃度（0.005 g／L）的藥物刺激下，胞內(nèi)鈣離子濃度瞬時增加，頭孢噻肟鈉本身的親脂性不強，所以它不可能通過細胞膜進入細胞內(nèi)直接發(fā)生作用.這個過程可能是頭孢噻肟鈉的－COOH和G蛋白的－NH2相互作用激活與G蛋白相連的受體，使IP3受體鈣通道與Ry R受體通道打開釋放鈣離子到細胞內(nèi)，使胞內(nèi)鈣離子濃度增加，鈣離子濃度的增加除了調(diào)節(jié)各種蛋白酶和離子通道功能外，也激活了鈣泵，從而使胞內(nèi)鈣離子濃度恢復正常，與本實驗中觀察到的輕微擾動相符合.當藥物濃度增大，胞內(nèi)鈣離子濃度迅速降低，表明在頭孢噻肟鈉作用下，淋巴細胞鈣離子通道受阻，導致細胞內(nèi)鈣離子濃度下降，這與韓曉紅［16］等的研究相符.從圖3中的C，D，E可以看出，胞外鈣離子濃度增大，但是鈣泵的活性卻下降，這說明導致胞外鈣濃度升高不單純是鈣泵發(fā)生作用，還有其他的離子通道實現(xiàn)了鈣離子的外排.如細胞質(zhì)膜受損時，Ca2＋-ATP酶等轉(zhuǎn)運蛋白被抑制，膜通透性發(fā)生改變，造成細胞內(nèi)外離子梯度紊亂，影響細胞正常生理功能，當質(zhì)膜完整性喪失時，細胞內(nèi)容物傾出，最終導致細胞死亡.ATP酶活性下降提示細胞膜受到損害，膜的完整性和流動性改變.

總之，對于人外周血淋巴細胞來說，低濃度頭孢噻肟鈉刺激下，胞內(nèi)鈣信號的傳遞受到鈣泵的調(diào)節(jié)，高濃度頭孢噻肟鈉刺激下，胞內(nèi)鈣信號的傳遞受到多種通道的調(diào)節(jié)，藥物濃度與鈣-ATP酶活性表現(xiàn)出一定的劑量－效應關(guān)系.

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Study on the Effect of Cefotaxime on Ca2＋Signal Transduction by Fluorometric Method

DONG Chuan，LU Dong-tao，QIAO Xiao-na，MU Li-xiao，SHUANG Shao-min
（ResearchCenterofEnvironmentalScienceandEngineering，ShanxiUniversity，Taiyuan030006，China）

To observe the relationship of Ca2＋ion concentrations with the changes of Ca2＋-ATPase in human lymphocytes treated with cefotaxime （CTX）of different concentrations（0.005 g／L，0.05 g／L，0.5 g／L，1 g／L，2 g／L），free calcium concentrations in human lymphocytes were measured by double wavelength spectrofluorometer with Fura-2／AM as the fluorescence indicator.The results showed that low concentration of CTX （0.005 g／L）lead to the increase of［Ca2＋］i via phosphatidylinositol transduction pathway.In the other groups（0.05 g／L，0.5 g／L，1 g／L，2 g／L），［Ca2＋］i in human lymphocytes were reduced by the concentration of CTX increased，hence the concentration of CTX and［Ca2＋］i showed dose-effect relationship.Meanwhile，the activities of Ca2＋-ATPase in human lymphocytes were investigated.Compared with the control group，the activities of Ca2＋-ATPase in group with cefotaxime were all declined.The concentration of CTX and activities of Ca2＋-ATPase also showed dose-effect relationship.

lymphocytes;Ca2＋signal transduction;Fura-2 AM

R962

A

0253-2395（2012）02-0333-05＊

2012-02- 17;

2012-02-28

國家自然科學基金（21175087）

董川（1963－），男，山西太原人，博士，教授，主要從事環(huán)境分析化學方面研究.E-mail：dc＠sxu.edu cn