強噪聲暴露后不同時期豚鼠耳蝸外毛細胞死亡方式的研究

薛秋紅 何堅 陳佳 吳翔磊 龔樹生 謝靜

研究表明，噪聲首先損傷柯替器的外毛細胞，從耳蝸底回開始，進行性向蝸頂發(fā)展，可進一步累及內(nèi)毛細胞、支持細胞、耳蝸血管紋甚至螺旋神經(jīng)節(jié)細胞[1]。耳蝸的損害存在兩種類型的細胞死亡—即凋亡和壞死[2]，本實驗采用細胞核熒光染色方法，觀察強噪聲暴露后不同時期豚鼠耳蝸毛細胞死亡的不同方式，為其不同的時期干預提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 選用健康白色紅目雄性豚鼠48只，體重400～450 g，耳廓反射靈敏，鼓膜完整，無中耳炎，無藥物、噪聲接觸史。隨機分為健康對照組(8只)和實驗組(40只)，實驗組又分為噪聲暴露后3 h、1 d、4 d、14 d、30 d組，每組8只。實驗前適應性喂養(yǎng)1周。

1.2實驗方法

1.2.1噪聲暴露 噪聲由軟件4 kHz NBN-316 Hz BW-50 mV(北京解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉研究所自制并惠贈) 經(jīng)筆記本電腦聲卡產(chǎn)生，經(jīng)放大器放大傳至揚聲器，揚聲器置于80 cm×80 cm×85 cm的雙層隔音箱四角；實驗組豚鼠置于35 cm×35 cm×50 cm的飼養(yǎng)籠中，自由進水，豚鼠活動范圍內(nèi)聲強相差最大不超過5 dB。用HS6280型噪聲頻譜分析儀(中國江西國營紅聲器材廠)連續(xù)監(jiān)測，噪聲為中心頻率4 kHz的窄帶噪聲，聲級計測量噪聲強度，給聲強度為120 dB SPL,暴露時間為4 h。對照組正常飼養(yǎng)不作任何處理。

1.2.2聽性腦干反應(ABR)測試：正常對照組、實驗組豚鼠在噪聲暴露前及噪聲暴露后相應時間點處死前，以10%水合氯醛(30 mg/kg)腹腔麻醉，在靜電屏蔽室內(nèi)測試ABR。采用Nicolet Compass 系統(tǒng),刺激聲為click，重復率為20次/秒, 掃描周期為10 ms，濾波帶寬100～3 000 Hz，信號疊加1 024次，以引出可重復波Ⅲ的最小刺激聲強度為標準判斷反應閾。

1.2.3耳蝸基底膜鋪片、Hoechst33342熒光染色 各組豚鼠于全身麻醉狀態(tài)下完成ABR測試后，快速斷頭處死，取雙側(cè)聽泡，開放卵圓窗和圓窗，灌注4%多聚甲醛磷酸緩沖液后，將聽泡置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液2 h，去蝸殼，分離耳蝸基底膜；應用DNA熒光染料Hoechst33342進行細胞核染色。將分離的基底膜置于染色液中，室溫避光染色10 min后10 mmol/L BPS清洗標本3次，染色后的基底膜鋪片，50%甘油封片。共聚焦熒光顯微鏡觀察毛細胞核的變化并計數(shù)；觀察全耳蝸基底膜，選擇受損最明顯的一段基底膜(距蝸尖約9～14 mm處，長約6 mm)，定量觀察受損的外毛細胞，并分別計數(shù)凋亡、壞死和缺失數(shù)目的百分比。 Hoechst33342染色顯示核固縮、核碎裂是細胞凋亡的特征，核腫脹是細胞壞死的特征，在正常的毛細胞排列處出現(xiàn)空缺為毛細胞缺失。

1.3統(tǒng)計學處理 各組計量資料以均數(shù)± 標準差表示，用SPSS11.5統(tǒng)計軟件兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1各組ABR反應閾 對照組及實驗組噪聲暴露前后ABR平均反應閾見表1，可見實驗組噪聲暴露后各組與對照組及實驗組噪聲暴露前ABR閾值差異均有統(tǒng)計學意義(P<0．01),噪聲暴露后3 h、1 d組與噪聲暴露后其他組ABR閾值差異有統(tǒng)計學意義(P<0．01)，但噪聲暴露后4 d、14 d、30 d組間差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。說明本實驗的噪聲條件可以引起豚鼠聽力永久性閾移，噪聲暴露后3 h閾移達到高峰，4 d后基本穩(wěn)定。

注：*與對照組及同組噪聲暴露前相比，P<0.01；△與噪聲暴露后4、14、30 d組相比，P<0.01

2.2共聚焦熒光顯微鏡下觀察 正常對照組毛細胞核為淡藍色，大小一致，三排外毛細胞及一排內(nèi)毛細胞排列整齊。噪聲刺激后3 h、1 d、4 d、14 d、30 d組外毛細胞排列紊亂，內(nèi)、外毛細胞均呈現(xiàn)3種病理改變：①核腫脹：細胞核體積增大，熒光染色減弱；②核固縮：細胞核體積縮小，熒光染色增強；③核消失：在原細胞核位置出現(xiàn)空白區(qū)。根據(jù)Hoechst33342染色判斷標準,這三種核改變分別是細胞發(fā)生壞死、凋亡和缺失的改變。各種毛細胞核的病理改變多見于第一排外毛細胞,其次為第二、第三排，內(nèi)毛細胞核受損較少。毛細胞核形態(tài)學改變累及耳蝸基底膜各回,主要為底回末端和第二回起始區(qū)域(距蝸尖約9～14 mm處，長約6 mm)(圖1)。

圖1 各組耳蝸基底膜鋪片(Hochest33342染色×400)

2.3損傷的外毛細胞定量分析 在噪聲暴露后總的趨勢是缺失的外毛細胞逐漸增加，壞死和凋亡的細胞數(shù)逐漸減少，總的損傷外毛細胞數(shù)(壞死、凋亡、缺失)明顯增加。凋亡和壞死的細胞數(shù)在不同的時間點不同，噪聲暴露后3 h、1 d、4 d組凋亡的平均細胞數(shù)百分比明顯多于壞死(P<0.05)，噪聲暴露后14 d組凋亡與壞死的細胞數(shù)百分比沒有明顯差異(P>0.05),噪聲暴露后30 d組凋亡細胞少于壞死細胞(P<0.05)(表2)。

表2 實驗各組豚鼠外毛細胞凋亡、壞死占受損細胞總數(shù)百分比

注：與同組壞死的平均細胞百分數(shù)相比，*P<0.05

3 討論

研究表明，強噪聲刺激后，耳蝸內(nèi)細胞壞死和凋亡是同時發(fā)生的[2]。細胞的死亡方式與線粒體能量代謝相關(guān)，細胞內(nèi) ATP水平保持在一定的閾值以上時, 細胞以調(diào)亡方式死亡，而 ATP水平在閾值之下時, 細胞以壞死方式死亡[ 3]。Hoechst為核酸特異性染料，能區(qū)分凋亡和壞死細胞，凋亡細胞發(fā)生染色質(zhì)濃縮或核碎裂，染色后熒光顯微鏡下表現(xiàn)為胞核致密濃染或碎塊樣致密濃染，而壞死細胞表現(xiàn)為核腫脹，熒光變淡。本實驗結(jié)果中，在噪聲刺激后基底膜鋪片Hoechst33342熒光染色顯示內(nèi)、外毛細胞均呈現(xiàn)核腫脹、核固縮和核消失3種病理改變，外毛細胞比內(nèi)毛細胞損害嚴重，外毛細胞損害主要表現(xiàn)在底回和第二回，且多為第一排和第二排，與HU等[2]報道基本一致。同時實驗組受損的細胞愈近底回愈多，愈近頂回則愈少，耳蝸的基底回末段及第二回開始處病變最明顯，可能是由于此處接近鼓室，容易受噪聲影響，且該部位主要感受4 kHz的聲音，本實驗所給噪聲的中心頻率為4 kHz，故此處損害最明顯。噪聲可造成耳蝸局部缺血再灌注及細胞膜微小損傷，導致谷氨酸、NO、ROS(活性氧)形成，其中ROS的產(chǎn)生和耳蝸中抗氧化防御系統(tǒng)的改變對耳蝸細胞的損傷起到了主要作用[4]。許多實驗證明NO、ROS可直接誘導體內(nèi)、外各種組織的氧化損傷和細胞凋亡，因此推測噪聲刺激導致耳蝸內(nèi)NO、ROS的水平增高，并可能激活細胞內(nèi)的信號途徑和調(diào)控基因表達來誘導耳蝸細胞凋亡。本實驗中，強噪聲暴露后30天，耳蝸還同時存在3種核形態(tài)變化，據(jù)此推論強噪聲暴露后毛細胞的損傷是一個復雜的長期非同步的病理變化過程，且耳蝸的損傷至少持續(xù)到噪聲暴露后30天。

從文中結(jié)果看，實驗組噪聲暴露后總的趨勢是缺失的外毛細胞明顯增加，壞死和凋亡的細胞數(shù)減少，噪聲暴露后3 h、1 d、4 d組凋亡的細胞數(shù)明顯多于壞死(P<0.05)，噪聲暴露后14 d組凋亡與壞死的細胞數(shù)沒有明顯差異(P>0.05)，噪聲暴露后30 d組凋亡的細胞數(shù)明顯少于壞死(P<0.05)。由此推論, 強噪聲暴露后的早期,細胞能量代謝系統(tǒng)輕度受損,毛細胞死亡方式以凋亡為主；到中晚期一些細胞內(nèi)ATP含量嚴重減少,細胞死亡以壞死為主。凋亡不僅發(fā)生在強噪聲對豚鼠耳蝸損害的早期，而且至少一直持續(xù)到噪聲暴露后30天。這可能與強噪聲除對內(nèi)耳直接作用外，還會發(fā)生次級損傷有關(guān)，即高強度噪聲后產(chǎn)生大量自由基，自由基損傷DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等，導致毛細胞的凋亡和壞死[5,6]。噪聲暴露后30天總的損傷外毛細胞數(shù)(壞死、凋亡、缺失)明顯上升，這與豚鼠噪聲暴露后聽力損失結(jié)果并不矛盾，因為隨著噪聲停止刺激后時間的延長，大量損害不嚴重的毛細胞在各種細胞保護機制的作用下會逐漸恢復[7]，因此聽力也逐漸恢復，而本研究統(tǒng)計的總的損傷細胞數(shù)是不可逆的細胞病理改變，只是損傷細胞的一部分。至于噪聲誘導耳蝸細胞凋亡與聽力損失的具體相關(guān)性，以及凋亡的途徑和分子調(diào)控機制，還需進一步的研究。

4 參考文獻

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