自體脂肪及筋膜植入犬聲門旁間隙及固有層的實(shí)驗(yàn)研究*

胡慧英 徐文 范爾鐘 張麗

繼發(fā)于單側(cè)聲帶麻痹、聲帶溝、聲帶萎縮、聲帶瘢痕等原因的聲門閉合不良，可引發(fā)明顯的發(fā)聲及吞咽障礙，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。聲帶填充術(shù)已廣泛應(yīng)用于聲門閉合不良患者的治療，但是填充物的選擇仍然存在爭議。既往研究[1,2]采用脂肪、明膠海綿等大顆粒物質(zhì)植入聲門旁間隙，但植入物存活時(shí)間有差異，而是否會(huì)影響手術(shù)效果也有分歧。本研究通過建立聲帶麻痹動(dòng)物模型，研究自體脂肪、筋膜移植入聲帶后的局部病理反應(yīng)，探討填充物作用機(jī)制及影響填充效果的因素，以期指導(dǎo)臨床應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選擇叫聲響亮的健康雜種實(shí)驗(yàn)用犬(普通級(jí))16只(因術(shù)中操作失敗及喉部嚴(yán)重感染死亡4只，未計(jì)入)，雌雄不限，年齡1.5～2.0歲，體重10.7～12.5 kg。實(shí)驗(yàn)前經(jīng)0°鼻內(nèi)鏡檢查，犬喉部形態(tài)及聲帶運(yùn)動(dòng)均正常。16只犬的32側(cè)聲帶，除正常對(duì)照組2側(cè)聲帶不做任何手術(shù)處理外，其余30側(cè)聲帶在建立聲帶麻痹動(dòng)物模型后，按照不同的植入材料、植入方式、植入部位和植入后觀察時(shí)間進(jìn)行分組(表1)。

表1 實(shí)驗(yàn)用聲帶分組(側(cè))

1.2聲帶麻痹動(dòng)物模型制備 除正常對(duì)照組聲帶外，其余實(shí)驗(yàn)用犬以速眠新II注射液(0.15～0.2 ml/kg)麻醉，控制麻醉深度在III期1級(jí)，頸部正中切口，于第3、4氣管環(huán)平面用手術(shù)刀片截除喉返神經(jīng)1.0 cm，斷端局部筋膜包埋，縫合切口，觀察1周后進(jìn)行后續(xù)手術(shù)。

1.3自體填充物質(zhì)獲取 切開犬腹部獲取脂肪，去除周圍組織后備用，自體筋膜組織取自犬腹直肌筋膜，剪成約1 mm×1 mm的小碎塊放入1 ml注射器中備用，或約5 mm長以濕紗布包裹備用。

1.4全麻下聲帶填充物植入

1.4.1聲門旁間隙脂肪注射 支撐喉鏡下，在鼻內(nèi)鏡系統(tǒng)監(jiān)視下應(yīng)用Brunning高壓注射器將脂肪注入聲門旁間隙，注射量為0.5～1 ml。

1.4.2聲門旁間隙脂肪填充 頸部正中切口，暴露甲狀軟骨，正中裂開，徹底止血，在聲帶上表面與喉室交界處、聲帶外側(cè)切口，約1 ml脂肪塊完全植入聲門旁間隙，關(guān)閉甲狀軟骨，縫合切口。

1.4.3聲門旁間隙筋膜注射 用上頜竇穿刺針在甲狀軟骨板前下1/3處進(jìn)針,插入聲門旁間隙,緩慢注入筋膜0.5～1 ml,直至聲帶邊緣凸起為止。

1.4.4聲帶固有層筋膜填充 支撐喉鏡下，在顯微鏡下應(yīng)用喉部顯微手術(shù)器械切開聲帶表面黏膜，將條狀筋膜填充于聲帶黏膜下，以8-0絲線縫合黏膜切口。

所有實(shí)驗(yàn)犬術(shù)后注射廣譜抗生素1周，流食3日后正常飼養(yǎng)。

1.5組織病理學(xué)觀察 于術(shù)后第1周、1、3、6、12個(gè)月用0°鼻內(nèi)鏡觀察喉部形態(tài)及運(yùn)動(dòng)后，完整切取犬喉，常規(guī)石碏包埋。沿犬喉冠狀面自前聯(lián)合至聲帶突全喉切片,進(jìn)行HE染色及Masson染色。高倍光學(xué)顯微鏡下觀察填充的脂肪和筋膜的生長特性，如填充物的存在狀態(tài)、吸收情況、異物反應(yīng)等。40倍光學(xué)顯微鏡下獲得清晰的病理切片圖像，以Adobe Photoshop CS2軟件在1 024×768分辨率及25%縮放比例下進(jìn)行圖像的量化分析(每側(cè)標(biāo)本選取有觀察部位的全部切片，觀察部位的數(shù)據(jù)取均值)，分別計(jì)算單位面積(cm2)炎性細(xì)胞、纖維母細(xì)胞及新生血管個(gè)數(shù)、膠原纖維面積占圖像面積的百分比，以標(biāo)尺工具計(jì)算填充物周圍纖維包膜厚度。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)由計(jì)算機(jī)統(tǒng)一收集，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)及方差分析或非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1內(nèi)窺鏡下犬聲帶大體形態(tài) 自體脂肪與筋膜植入術(shù)后1個(gè)月內(nèi)，70.0%(21/30)術(shù)側(cè)聲帶出現(xiàn)充血、水腫，均于術(shù)后3個(gè)月內(nèi)消失，其中筋膜注射組反應(yīng)出現(xiàn)比例最低(1/8)(圖1、2)。

自體脂肪或筋膜植入后第1周均可見術(shù)側(cè)聲帶體積飽滿，呼氣期末可內(nèi)收超越中線，聲門閉合良好。術(shù)后第3個(gè)月，術(shù)側(cè)聲帶體積明顯縮小。填充物剩余體積觀察：筋膜注射組>脂肪注射組>脂肪填充組。術(shù)后第6個(gè)月時(shí)80%的聲帶可見植入部位隆起，體積趨于穩(wěn)定。筋膜填充組術(shù)后觀察期內(nèi)均可見填充部位隆起(因體積較小未測(cè)量)。

2.2實(shí)驗(yàn)側(cè)聲帶光鏡觀察結(jié)果 自體脂肪、筋膜植入聲帶后，可見植入物與周圍正常聲帶組織間有較明確的界限。脂肪植入部位可見成活的團(tuán)狀脂肪細(xì)胞存在，其間夾雜部分破碎的脂肪大泡；筋膜組織以密度較高的膠原纖維形式存在。植入部位組織病理學(xué)表現(xiàn)主要為：炎性浸潤、纖維形成(主要是Ⅰ型膠原纖維，呈不規(guī)則束狀，分布較均勻)、纖維母細(xì)胞形成、新生血管形成及纖維包膜形成(圖3～5)。病理變化依填充物、填充方式和觀察時(shí)間而不同。

圖1 左聲帶脂肪注射后1周纖維喉鏡圖像 左聲帶飽滿，內(nèi)移，聲門閉合好圖2 左聲帶筋膜填充表面絲線縫合圖3 脂肪注射后6月聲帶光鏡觀察圖 可見纖維包膜及脂肪細(xì)胞存活(HE×40)圖4 筋膜注射后1月聲帶光鏡觀察圖 纖維均勻，纖維包膜形成(Masson×40)圖5 筋膜填充后3月聲帶光鏡觀察圖 纖維排列，無明顯包膜(HE×100)

脂肪植入組1周時(shí)有炎性反應(yīng)，脂肪內(nèi)新生血管形成出現(xiàn)于術(shù)后3月，同時(shí)填充物周圍組織形成少量纖維結(jié)締組織分隔脂肪填充物，即形成纖維包膜，3月時(shí)包膜厚度最大，與周圍組織分界清楚。6月后纖維母細(xì)胞出現(xiàn)，12個(gè)月時(shí)脂肪填充物仍然存在，填充物周圍組織未見壞死及萎縮。

筋膜注射組病理學(xué)表現(xiàn)主要是膠原纖維形成，呈束狀排列不規(guī)則，分布較均勻，隨時(shí)間推移密度無明顯變化。術(shù)后1月植入部位有纖維母細(xì)胞，同時(shí)纖維包膜形成，術(shù)后3個(gè)月時(shí)包膜厚度值最大，與周圍組織分界清楚，術(shù)后12個(gè)月時(shí)纖維包膜消失。術(shù)后12個(gè)月時(shí)筋膜注射部位始有新生血管形成。

筋膜填充組膠原纖維密度隨時(shí)間推移逐漸降低，在術(shù)后第1、3個(gè)月時(shí)膠原纖維密度最大，筋膜植入部位于第1個(gè)月時(shí)觀察到纖維母細(xì)胞，都以橢圓形纖維母細(xì)胞為主，3個(gè)月后筋膜組織呈漩渦狀排列，6個(gè)月后橢圓形纖維母細(xì)胞密度增大，填充部位有新生血管形成。纖維包膜厚度較低，6個(gè)月后消失。第12個(gè)月時(shí)其密度與周圍組織趨于一致，筋膜植入部位纖維排列較密，與聲帶固有層組織無明顯分界。

脂肪注射組觀察期內(nèi)除2側(cè)聲帶分別于術(shù)后1、3個(gè)月時(shí)病理切片未發(fā)現(xiàn)填充物外，其余8側(cè)聲帶與脂肪填充組在各觀察時(shí)間點(diǎn)上形態(tài)學(xué)表現(xiàn)基本一致，組織病理學(xué)表現(xiàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此合并為脂肪植入組進(jìn)行分析(表2、3)(其中表2為所有觀察時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)的均值)。從表3可見，脂肪植入組纖維母細(xì)胞出現(xiàn)比例(4/15)小于筋膜植入組(9/15)，而新生血管形成比例(7/15)大于筋膜植入組(3/15)。

3 討論

聲帶填充術(shù)是將自體或異體生物材料注射或填充至聲帶不同層次或聲門旁間隙,使聲帶體積增加、游離緣內(nèi)移,以改善聲門閉合狀況及聲帶振動(dòng)特性，恢復(fù)發(fā)音及吞咽功能。目前對(duì)于聲帶麻痹及聲帶萎縮引起的聲門閉合不全，多用脂肪、明膠海綿等大顆粒物質(zhì)填充，其粘彈性特性不影響聲帶振動(dòng)。而聲帶溝位于聲帶固有層，在固有層內(nèi)填充筋膜的同時(shí)，還要在聲門旁間隙注射脂肪[1，2]。

表2 各組術(shù)后聲帶組織切片光鏡下觀察結(jié)果

注：*與脂肪植入組比較，P<0.05;△與筋膜填充組比較，P<0.05

表3 各組各觀察時(shí)間點(diǎn)聲帶組織光鏡下病理變化出現(xiàn)側(cè)次(側(cè))

脂肪與其他填充材料相比可以最大程度恢復(fù)聲帶振動(dòng)特性，缺點(diǎn)是會(huì)被吸收。對(duì)于脂肪的吸收率有不同研究結(jié)果。Kruschewsky等[3]通過磁共振技術(shù)研究了犬單側(cè)聲帶麻痹后的脂肪吸收率，結(jié)果顯示在植入后3個(gè)月時(shí)脂肪注射吸收率為82%，Ⅰ型甲狀軟骨成型術(shù)脂肪填充吸收率為71%。徐文等[4]研究發(fā)現(xiàn)，注射脂肪后的第1個(gè)月吸收最為明顯，達(dá)30 %～35 %，術(shù)后18個(gè)月時(shí)患者發(fā)聲仍有明顯改善。溫武等[5]通過測(cè)量發(fā)現(xiàn)自體脂肪聲帶注射后12個(gè)月時(shí)聲帶體積仍有增大。本研究發(fā)現(xiàn)，脂肪注射填充物體積明顯減少出現(xiàn)于術(shù)后第1、3個(gè)月，但聲門閉合良好。有研究顯示，脂肪組織在術(shù)后第3個(gè)月時(shí)幾乎全部消失，由纖維母細(xì)胞和巨噬細(xì)胞代替[5，6]。本研究組織病理學(xué)檢查顯示術(shù)后植入部位確實(shí)存在有活性的脂肪填充物，其中間及周圍為新生毛細(xì)血管、纖維母細(xì)胞及大量膠原纖維充斥，顯示有纖維化存在，在術(shù)后12個(gè)月時(shí)仍有大量有核脂肪細(xì)胞存在。正如Brandenburg等[7]指出，術(shù)后即便脂肪組織有損壞，纖維組織也可以代替損壞的脂肪，保持聲帶的輪廓和體積。

自體筋膜填充于聲帶固有層治療聲帶固有層缺陷療效良好[2，8],但尚缺乏組織病理研究來證實(shí)。本研究顯示筋膜組織填充后在形態(tài)上可與周圍組織區(qū)分開來，填充后3個(gè)月與周圍組織無明顯分別，開始有纖維細(xì)胞及纖維母細(xì)胞長入，細(xì)胞密度較高，以橢圓形纖維母細(xì)胞為主，而這種有活性的纖維母細(xì)胞具有分泌細(xì)胞外基質(zhì)的作用，使填充后的筋膜與聲帶本身生物學(xué)特性更接近。由于填充的筋膜存在時(shí)間較長，能很好的起到支架作用，使聲帶本身纖維組織、纖維母細(xì)胞及其他細(xì)胞外基質(zhì)成份充分長入。筋膜與聲帶固有層周圍組織無明顯纖維包膜形成，顯示自體筋膜與聲帶有很好的生物相容性，與植入部位結(jié)合良好。6個(gè)月后筋膜組織與聲帶固有層結(jié)構(gòu)趨于一致，提示聲帶溝筋膜植入術(shù)后的患者，嗓音大幅度的改善理論上應(yīng)該出現(xiàn)于術(shù)后6個(gè)月左右。筋膜注射于聲門旁間隙和填充于固有層，兩種植入方法炎性反應(yīng)均輕微，隨植入部位不同，反應(yīng)有所差異，植入物周圍纖維包膜形成比例高，與周圍組織界限清晰。

可見，脂肪填充于聲門旁間隙，相對(duì)于筋膜，更能起到介質(zhì)作用，使周圍的新生血管及活性纖維母細(xì)胞長入，這些新生成分的營養(yǎng)支持作用促進(jìn)了植入的脂肪細(xì)胞的存活，但隨時(shí)間的推移，有一定的吸收率，但仍可以起到填充效果。而筋膜注射于聲門旁間隙后，是以膠原纖維的結(jié)構(gòu)形式長期存在于植入部位，纖維母細(xì)胞出現(xiàn)的密度較大，因此筋膜移植物存在時(shí)間長，重吸收現(xiàn)象不顯著；但是由于筋膜的大量取材及注射方式受限，在一定程度上限制了其臨床應(yīng)用。

本研究中脂肪注射組有2側(cè)聲帶病理切片未發(fā)現(xiàn)明確填充物存在，分別出現(xiàn)于術(shù)后1個(gè)月和3個(gè)月，分析原因，考慮為注射部位過于表淺、脂肪自聲帶注射部位排出有關(guān)，因此術(shù)中脂肪注射入聲門旁間隙內(nèi)的深度控制非常重要。另外，由于本實(shí)驗(yàn)中無法控制犬很好地聲休，致使術(shù)后1周時(shí)一例犬聲帶填充筋膜脫落(記為操作失敗未計(jì)算在內(nèi))，可見術(shù)后聲休有利于筋膜在植入部位的生長。因此，聲帶填充術(shù)中應(yīng)注意，脂肪注射應(yīng)采用多點(diǎn)分散注射，要注射在聲門旁間隙內(nèi)，且要注射到一定深度；術(shù)后一定時(shí)期內(nèi)限制聲帶過度活動(dòng)，避免填充物排出或脫落，為新生物質(zhì)生長提供基礎(chǔ)。隨著組織工程技術(shù)、分子生物學(xué)、基因治療等技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，相信聲帶填充技術(shù)必將擁有更廣闊的研究前景和臨床應(yīng)用價(jià)值。

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