對成都地區(qū)10株黏細(xì)菌菌株酶活性的初步研究

劉冰花，羅亞雄，曾玉桂，謝小英，饒 停，陳 娟，張艷萍

(成都大學(xué)醫(yī)護(hù)學(xué)院，四川成都 610106)

0 引言

目前，酶廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、生物燃料、傳統(tǒng)釀造、食品加工、紡織、造紙、皮革及有機(jī)合成等領(lǐng)域，酶的提取和合成已成為科研人員重要的研究課題［1－3］.酶可以從動(dòng)植物體內(nèi)提取，但由于酶在生物體內(nèi)的含量很低，并且從動(dòng)植物體內(nèi)提取酶的成本較高，在工業(yè)上目前主要通過微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)酶.黏細(xì)菌(myxcobacteria)是產(chǎn)子實(shí)體的滑行細(xì)菌，屬于原核生物，具有復(fù)雜的社會(huì)行為和生活周期［4］.同時(shí)，黏細(xì)菌可產(chǎn)生豐富的次級代謝物，是人們獲得大量天然藥物和酶的重要來源［5］.本研究擬從黏細(xì)菌中尋找具有工業(yè)價(jià)值的酶類.

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

實(shí)驗(yàn)所用黏細(xì)菌菌株來自成都地區(qū)并由本實(shí)驗(yàn)室分離并保藏，菌株編號分別為，CL-1、CL-3、CL-5、CH-1、CH-2、CC-1、CY-1、CX-1、CL-7和CM-2.

1.2 培養(yǎng)基

(1)VY/4培養(yǎng)基［6］.安琪酵母0.25%，CaCl2· 2H2O 0.1%，維生素 B120.5 μg·mL－1，瓊脂粉1.50%，pH值7.2.

(2)纖維素酶活性鑒別培養(yǎng)基.微晶纖維素0.5%，安琪酵母0.2%，K2HPO4·3H2O 0.15%， KH2PO40.1%，NaCl 0.05%，無水CaCl20.01%，維生素B120.5 μg·mL－1，瓊脂粉1.5%，pH值7.2.

(3)淀粉酶活性鑒別培養(yǎng)基.可溶性淀粉0.5%，安琪酵母0.2%，K2HPO4·3H2O 0.15%，KH2PO40.1%，NaCl 0.05%，無水CaCl20.01%，維生素B120.5 μg·mL－1，瓊脂粉1.5%，pH值7.2.

(4)蛋白酶活性鑒別培養(yǎng)基.酪蛋白0.25%，K2HPO4·3H2O 0.15%，KH2PO40.1%，NaCl 0.05%，無水CaCl20.01%，維生素B120.5 μg·mL－1，瓊脂粉1.5%，pH值7.2.

(5)殼聚糖酶活性鑒別培養(yǎng)基.A液，殼聚糖1.0%，pH值7.2.B液，安琪酵母0.4%，K2HPO4· 3H2O 0.30%，KH2PO40.2%，NaCl 0.10%，無水CaCl20.02%，瓊脂粉3.0%，pH值7.2.A液、B液分別于121℃滅菌20 min，待A液、B液冷卻至50℃左右時(shí)進(jìn)行1∶1混合，同時(shí)加入維生素B12至0.5 μg·mL－1.

(6)脂肪酶活性鑒別培養(yǎng)基.Tween 80 1.0%，安琪酵母0.2%，K2HPO4·3H2O 0.15%，KH2PO40.1%，NaCl 0.05%，無水CaCl20.01%，維生素B120.5 μg·mL－1，瓊脂粉1.5%，pH值7.2.

2 方法

2.1 10株黏細(xì)菌菌株纖維素酶活性初步檢測

將10株黏細(xì)菌菌株分別接種于纖維素酶活性鑒別培養(yǎng)基平板上，30℃恒溫保濕培養(yǎng).38 h后取出，在每個(gè)平板上加入適量1 mg/mL剛果紅溶液染色1 h，然用1 mol/L的NaCl溶液脫色［7］.觀察是否有透明圈，并用游標(biāo)卡尺測量透明圈的直徑.若菌株產(chǎn)纖維素酶，則在菌落周圍會(huì)出現(xiàn)清晰的透明圈，透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)之比(D/d)越大，其酶活性越高.

2.2 10株黏細(xì)菌菌株淀粉酶活性初步檢測

將10株黏細(xì)菌菌株分別接種在淀粉酶活性鑒別培養(yǎng)基平板上，30℃恒溫保濕培養(yǎng).38 h后取出，在每個(gè)平板上加入適量的盧戈斯碘液染色，20 min后用蒸餾水洗去多余的碘液，觀察是否有透明圈，并用游標(biāo)卡尺測量透明圈的直徑.有透明圈者則證明該株黏細(xì)菌可產(chǎn)生淀粉酶，透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)之比(D/d)越大，其酶活性越高.

2.3 10株黏細(xì)菌菌株蛋白酶活性初步檢測

將10株黏細(xì)菌菌株分別接種在蛋白酶活性鑒別培養(yǎng)基平板上，30℃恒溫保濕培養(yǎng).觀察是否有透明圈及測量透明圈直徑大小.有透明圈者則證明該株黏細(xì)菌可產(chǎn)生蛋白酶，透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)之比(D/d)越大，其酶活性越高.

2.4 10株黏細(xì)菌菌株殼聚糖酶活性初步檢測

將10株黏細(xì)菌菌株分別接種在殼聚糖酶活性鑒別培養(yǎng)基平板上，30℃恒溫保濕培養(yǎng).觀察是否有透明圈及測量透明圈直徑大小.有透明圈者則證明該株黏細(xì)菌可產(chǎn)生殼聚糖酶，透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)之比(D/d)越大，其酶活性越高.

2.5 10株黏細(xì)菌菌株脂肪酶和氧化分解脂肪酸的酶類活性初步檢測

將10株黏細(xì)菌菌株分別接種在脂肪酶活性鑒別培養(yǎng)基平板上，30℃恒溫保濕培養(yǎng).觀察是否有白色沉淀圈和透明圈.產(chǎn)脂肪酶的菌株能水解Tween 80，并在菌落周圍形成白色沉淀圈［8］;既可產(chǎn)脂肪酶又可產(chǎn)生氧化分解脂肪酸的酶類的菌株不但能將Tween 80水解，而且還可將Tween 80的水解產(chǎn)物油酸氧化分解，其菌落周圍會(huì)出現(xiàn)透明圈.沉淀圈和透明圈直徑與菌落直徑之比越大，其酶活性越高.

3 結(jié)果

部分黏細(xì)菌菌株在相應(yīng)的酶活性檢測平板上的透明圈或沉淀圈如圖1所示.

圖1 部分黏細(xì)菌菌株在特定酶活性檢測平板上的透明圈或沉淀圈

3.1 纖維素酶活性初步檢測結(jié)果

研究發(fā)現(xiàn):10株黏細(xì)菌菌株均可在纖維素酶活性鑒別培養(yǎng)基平板上生長，染色前只有CL-1、CX-1 2個(gè)菌株的平板上有明顯的透明圈，其余菌株的平板上僅有模糊的透明圈或者沒有透明圈;用1 mg/ mL剛果紅溶液染色后，除了CC-1菌株的平板上沒有透明圈外，其余菌株的培養(yǎng)基平板上都有明顯的透明圈出現(xiàn)，用1 mol/L鹽酸脫色后，透明圈的邊界更明顯;脫色后各培養(yǎng)基平板上的菌落直徑(d)、透明圈直徑(D)及D/d之比如表1所示.

表1 10株黏細(xì)菌菌株在纖維素酶活性鑒別平板上的酶活性情況(38 h)

從表1數(shù)據(jù)可知，10株黏細(xì)菌菌株中只有菌株CC-1不產(chǎn)生纖維素酶，其余菌株均可產(chǎn)生纖維素酶，其中菌株CX-1的D/d之比為11.50，為最大，故菌株CX-1的纖維素酶活性最高.雖然菌株CY-1的透明圈直徑(D)最大，但由于菌株CY-1在平板上的菌落直徑(d)也較大，導(dǎo)致其D/d之比較小.

3.2 淀粉酶活性初步檢測結(jié)果

研究發(fā)現(xiàn):除了菌株CC-1在淀粉酶檢測平板上沒有透明圈外，其余9株黏細(xì)菌菌株在淀粉酶檢測平板上均有明顯的透明圈;用盧戈斯碘液染色后透明圈的邊界更加明顯.各培養(yǎng)基平板上的透明圈直徑(D)、菌落直徑(d)及D/d之比如表2所示.

表2 10株黏細(xì)菌菌株在淀粉酶活性鑒別培養(yǎng)基平板上的酶活性情況(38 h)

從表2數(shù)據(jù)可知:除了菌株CC-1不產(chǎn)生淀粉酶外，其余9株黏細(xì)菌菌株均可產(chǎn)生淀粉酶，其中菌株CL-7的D/d之比為3.60，為最大，故菌株CL-7的淀粉酶活性最高;雖然菌株CL-3的透明圈直徑(D)最大，但由于菌株CL-3在平板上的菌落直徑(d)也較大，導(dǎo)致其D/d之比較小.

3.3 蛋白酶活性初步檢測結(jié)果

研究發(fā)現(xiàn)，10株黏細(xì)菌菌株的蛋白酶活性檢測平板上均有明顯的透明圈，各平板上的透明圈直徑(D)、菌落直徑(d)及D/d之比如表3所示.

表3 10株黏細(xì)菌菌株在蛋白酶活性鑒別培養(yǎng)基平板上的酶活性情況(39 h)

從表3數(shù)據(jù)可知:10株黏細(xì)菌菌株均可產(chǎn)生蛋白酶，其中菌株CC-1的D/d之比為5.50，為最大，故菌株CC-1的蛋白酶活性最高;菌株CY-1的D/d之比為1.15，所以菌株CY-1的蛋白酶活性最低;菌株CL-5的透明圈直徑(D)雖然最大，但由于菌落直徑(d)也最大，導(dǎo)致其D/d之比較小.

3.4 殼聚酶活性初步檢測結(jié)果

研究發(fā)現(xiàn)，菌株CL-1、CL-3、CX-1和CL-7的殼聚糖酶活性檢測平板上有明顯的透明圈，菌株CL-5、CH-1、CH-2的殼聚糖酶活性檢測平板上盡管有透明圈，但透明圈均比較模糊不清，菌株CC-1的殼聚糖酶活性檢測平板上完全沒有透明圈.各平板上的透明圈直徑(D)、菌落直徑(d)及D/d之比如表4所示.

表4 10株黏細(xì)菌菌株在殼聚糖酶活性鑒別培養(yǎng)基平板上的酶活性情況(42 h)

從表4數(shù)據(jù)可知，菌株CL-1的殼聚糖酶活性最高，菌株CL-3的殼聚糖酶活性僅次于菌株CL-1，菌株CC-1不產(chǎn)生殼聚糖酶，其他菌株的殼聚糖酶活性均較低.

3.5 脂肪酶活性初步檢測結(jié)果

研究發(fā)現(xiàn):菌株CL-3、CL-5、CH-1、CH-2和CM-2的脂肪酶活性檢測平板上只有明顯的白色沉淀圈，無透明圈，說明這幾種菌株只產(chǎn)生脂肪酶，不產(chǎn)生氧化分解脂肪酸的酶類;菌株CL-1、CC-1和CY-1的脂肪酶活性檢測平板上只有明顯的透明圈，無白色沉淀圈，說明這些菌株不但將Tween 80上水解了，而且還將生成的油酸也氧化分解了，這些菌株既可產(chǎn)生脂肪酶又可產(chǎn)生氧化分解脂肪酸的酶類，并且氧化分解脂肪酸的酶類的酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于脂肪酶的酶活性;菌株CX-1和CL-7的脂肪酶活性檢測平板上既有白色沉淀圈又有無色透明圈，說明這2種菌株產(chǎn)生的氧化分解脂肪酸的酶類的酶活性小于其產(chǎn)生的脂肪酶的酶活性.各平板上的白色圈直徑(D)、菌落直徑(d)及D/d之比、透明圈直徑(D')及D'/d之比如表5所示.

表5 10株黏細(xì)菌菌株在脂肪酶活性鑒別培養(yǎng)基平板上的酶活性情況(54 h)

從表5數(shù)據(jù)可知:菌株CL-5的脂肪酶活性最高，菌株CH-2的脂肪酶活性次之;菌株CL-1的D'/ d之比為9.00，故其具有極高的氧化分解脂肪酸的酶活性.

4 討論

本研究表明，實(shí)驗(yàn)所選10株黏細(xì)菌菌株均可產(chǎn)生特定的高活性酶類，說明黏細(xì)菌不但是抗生素的重要來源，而且還可以在酶工業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮極大的作用.特別是菌株CC-1，其不產(chǎn)生纖維素酶、殼聚糖酶、淀粉酶，而只產(chǎn)生活性較高的蛋白酶和氧化分解脂肪酸的酶類，產(chǎn)酶種類比較單一，這為其進(jìn)一步的酶的分離純化奠定了良好基礎(chǔ).同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)，菌株CC-1的次級代謝物具有溶栓活性和抗腫瘤活性，說明菌株CC-1具有極高的研究開發(fā)價(jià)值.

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