單環(huán)刺螠生殖腺的發(fā)生及雌體的生殖周期＊

李 昀，王航寧，邵明瑜，張志峰

（中國海洋大學海洋生物遺傳育種教育部重點實驗室，山東青島266003）

生殖腺是兩性生殖細胞產生和分化的場所，研究生殖腺發(fā)生可以更好地調控物種的繁殖性能，提高種質特性，開發(fā)和利用優(yōu)異的品種資源。這無論在理論上還是人工繁殖及資源開發(fā)利用等實際應用中都具有重要的意義。

單環(huán)刺螠（Urechis unicinctus）俗稱“海腸子”，隸屬于螠蟲動物門（Echiuroidea）、螠綱（Echiurida）、無管螠目（Xenopneusta）、刺螠科（Urechidae）、刺螠屬（Urechis），是無管螠目在我國沿海分布的唯一種類［1］，具有很高的經濟食用價值和改良底質的能力［2］，是一類亟待進一步開發(fā)的海洋動物資源。然而目前人們對單環(huán)刺螠生殖腺是如何發(fā)生的、性腺的形態(tài)結構及發(fā)育特點尚不清楚，這大大地限制了人們對該物種繁殖生物學以及養(yǎng)殖開發(fā)的研究。本實驗以幼螠和成體單環(huán)刺螠為材料，采用組織學和細胞學方法對單環(huán)刺螠生殖腺的發(fā)生，卵巢的結構及年周期發(fā)育進行了觀察，旨在為單環(huán)刺螠生殖生物學及人工繁育提供基礎資料。

1 材料和方法

實驗用單環(huán)刺螠成體購自青島市南山海產品市場，產地為萊州海區(qū)，體長10～20 cm，體質量100～300 g。每月取樣1次，共70只。幼螠由本實驗室培養(yǎng)獲得。選擇生殖期腎管飽滿的雌、雄個體，解剖從腎管中獲取成熟兩性生殖細胞，人工受精（精、卵數(shù)量8∶1）。受精卵經3次洗卵后轉入50 cm×30 cm×30 cm的培養(yǎng)箱中充氣培養(yǎng)。水溫為室溫（16～20℃），p H 7.9±0.05，鹽度29±1。48 h后每天早晚各1次投喂小球藻、金藻等單胞藻。體節(jié)幼蟲后轉入含沙泥底質的水缸中，底質厚6 cm，培養(yǎng)密度為0.2 ind／cm2。在Nikon E80i型顯微鏡下觀察單環(huán)刺螠的發(fā)育，選取1～4 cm的幼螠用于組織學觀察。

游離生殖細胞的獲?。翰捎米⑸淦鞔┩阁w壁抽取含有生殖細胞的體腔液，2 000 r／min離心，棄掉上層體腔液細胞，收集各期生殖母細胞，Nikon E80i顯微鏡下觀察和拍照。

組織學觀察：單環(huán)刺螠幼螠用飽和MgSO4麻醉后，Bouin’s固定液固定24 h；對于成熟個體，剪取其雌性個體尾部蟲體，固定于Bouin’s溶液中24 h。酒精梯度脫水，石蠟包埋，美國AO輪式切片機連續(xù)切片，厚度5～7μm，H＆E染色，Nikon E80i顯微鏡下觀察、測量和拍照。

2 結果

2.1 單環(huán)刺螠性腺的發(fā)生和卵巢的結構

作者最早在3.5 cm體長的單環(huán)刺螠幼螠尾部后腸外壁處的結締組織中，發(fā)現(xiàn)了原始生殖細胞（Primodial germ cells，PGCs）樣的細胞。這些細胞胞體較大，直徑約4μm，核大而圓，核仁明顯，胞質透明并呈弱嗜堿性；此期幼螠連續(xù)切片觀察，PGCs數(shù)量接近10個，它們和周圍的結締組織一起構成了生殖腺原基（見圖1－1，2）。發(fā)育至4 cm的幼螠，構成性腺原基的細胞進一步增殖，且生殖干細胞主要位于原基的外圍，結締組織被包圍其中（見圖1－3，4），性腺的基本結構已具備。此期生殖細胞處于性原細胞階段，未見分化的生殖細胞產生。隨著發(fā)育的進行，生殖腺進一步伸長，并通過肌束將性腺兩端的結締組織固著在后腸壁和體壁上。

圖1 單環(huán)刺螠生殖腺的發(fā)生和卵巢結構的年周期變化Fig.1 Gonad genesis and ovary annual development of Urechis unicinctus

單環(huán)刺螠的卵巢極小，呈條帶狀，位于蟲體尾部后腸處。生長期和成熟期的卵巢長度也僅有900μm左右，因此肉眼不易辨認。光鏡下可見各期卵母細胞位于卵巢外周，同一發(fā)育時期的卵母細胞往往聚集成團，卵巢內部為疏松結締組織，結構相對疏松，膠原纖維豐富，偶爾可見排列疏松的肌纖維分布；在卵巢兩端形成發(fā)達的肌束。卵巢中的生殖細胞包括卵原細胞、小生長期卵母細胞、卵黃發(fā)生早期卵母細胞和卵黃發(fā)生時期的卵母細胞（見圖1－10～15）。

2.2 卵巢年周期發(fā)育

通過對全年樣品切片觀察發(fā)現(xiàn)，單環(huán)刺螠一年中出現(xiàn)2個生殖期，一次發(fā)生在春季（大生殖期）的4月中下旬至5月底，持續(xù)時間可達50 d左右；另一次為秋季（小生殖期），發(fā)生于9月份，約持續(xù)30 d。根據(jù)卵巢的組織結構以及體腔液中生殖細胞的發(fā)育特點，將單環(huán)刺螠雌體的性腺發(fā)育周期劃分為5個時期，即增殖期、生長期、成熟期、排放期和休止期。

2.2.1 增殖期 6月末～7月和11月～次年1月，卵巢長度為200～800μm，卵巢中僅見外周的卵原細胞成團分布。卵原細胞團的數(shù)量隨著卵巢的發(fā)育逐漸增加，從卵巢的最大切面觀察，可見每個細胞團的卵原細胞數(shù)量約為7～9個（見圖1－10，11）。此階段體腔液中游離的卵母細胞團數(shù)量很少，腎管萎縮（見圖1－5）。

2.2.2 生長期 7月末～8月下旬和2月～4月初，卵巢長度為800～900μm，卵巢內可見卵原細胞和卵母細胞（見圖1－12）。7月末～8月中旬和2～3月，卵母細胞團開始出現(xiàn)在卵巢中部的結締組織中，但數(shù)量明顯少于卵原細胞團的數(shù)量；8月中旬～8月下旬和3月下旬～4月初，卵巢中卵原細胞團數(shù)量逐漸減少，卵母細胞團數(shù)量迅速增多，并充滿卵巢中部，成為此時期卵巢中主要生殖細胞；在這些卵母細胞團中，以小生長期和卵黃發(fā)生早期的卵母細胞團為主，卵黃發(fā)生時期的卵母細胞數(shù)量少，且單個分布；進一步可見此期由于卵母細胞團脫落，而使卵巢邊緣不完整，部分結締組織膜破裂。生長期個體的體腔液中卵母細胞團的數(shù)量迅速增加，進入8月中下旬和3月末后，細胞團的數(shù)量減少，而游離卵母細胞數(shù)量增多（見圖1－6，7）。

2.2.3 成熟期 8月末～9月中旬和4月～5月初，卵巢長度為800μm左右，其結構組成與生長期末期相似，卵原細胞數(shù)量很少，卵巢中充滿了卵母細胞，其中卵黃發(fā)生時期卵母細胞數(shù)量最多（見圖1－13）。體腔液中主要以游離的卵母細胞為主，卵母細胞團較少（見圖1－8）。此階段腎管飽滿，充滿了大量的成熟卵子。

2.2.4 排放期 9月下旬～10月中旬和5月中旬～6月中旬，卵巢長度為600μm左右，卵巢中的生殖細胞驟減，主要為卵原細胞，卵母細胞急劇減少（見圖1－14）。體腔液中卵母細胞團和游離卵母細胞的數(shù)量均逐漸減少。腎管中的生殖細胞已基本排放干凈或殘留少量，腎管迅速萎縮。

2.2.5 休止期 10月下旬～11月初和6月中旬～下旬，卵巢萎縮至100～200μm，生殖細胞團由單一的卵原細胞構成（見圖1－15）。體腔液中幾乎沒有生殖細胞（見圖1－9），腎管完全萎縮。

3 討論

3.1 單環(huán)刺螠生殖腺的發(fā)生與卵巢的結構

生殖腺是由生殖細胞和體細胞共同組成的。一般來講，生殖細胞源于原始生殖細胞PGCs，后者多數(shù)情況下又往往在非生殖腺發(fā)生的地方產生，然后經過遷移抵達生殖嵴，與生殖嵴的體細胞共同構成原始的生殖腺；伴隨著個體的生長發(fā)育，在性染色體、性激素或者環(huán)境因子的影響下，原始性腺分化為精巢或卵巢，并最終成熟［3］。由于不同動物的體制和進化地位不同，其PGCs和生殖嵴發(fā)生的位置和時間也存在一定程度的差異［4］。本實驗中作者最早在3.5 cm幼螠尾部后腸的外壁處觀察到生殖腺原基，它是由少量PGCs和后腸外壁局部的結締組織構成。至4 cm幼螠時，性腺的基本結構已經具備。盡管隨著發(fā)育，性腺的體積將有一定的增大，但比較而言單環(huán)刺螠的生殖腺極小，成熟期的性腺也僅有900μm，肉眼難于分辨。推測這也是多年來人們研究螠蟲動物性腺發(fā)生沒有成功的原因之一。本研究首次給出了螠蟲動物生殖腺發(fā)生的實驗證據(jù)。

從進化上來看，動物的生殖腺經歷了由無定型（無固定形態(tài)和發(fā)生位置）到定型（固定的形態(tài)和發(fā)生位置）的演化。之前通過分離觀察螠蟲動物體腔液中的生殖細胞，認為螠蟲動物生殖細胞的大部分發(fā)生過程都游離于體腔內進行，繁殖期時體腔膜可臨時用來產生生殖干細胞（卵原細胞或精原細胞），在體腔液中發(fā)育成熟后轉入腎管，排出體外［5］。本實驗首次顯示了單環(huán)刺螠卵巢為長期存在的一個固定性的結構，其由蟲體后腸壁外的局部結締組織和生殖細胞共同構成，為膜帶狀；生殖細胞成團或單個狀分布于其中；性腺兩端通過肌束固定在后腸的外壁和附近的體壁上，其結構相對于高等無脊椎動物的定型生殖腺而言要簡單得多。單環(huán)刺螠生殖腺既沒有明顯而發(fā)達的結締組織外膜，也沒有排出管；卵巢中分布有不同發(fā)育時期的生殖母細胞（卵原細胞、不同發(fā)育時期的卵母細胞），它們以卵原細胞團或者單個較大的卵母細胞的形式由卵巢的結締組織膜中脫離，并落入體腔中進一步發(fā)育，成熟的卵母細胞將進入腎管并排出體外，等待受精。因此單環(huán)刺螠卵子成熟前經歷了2個發(fā)育場所（卵巢和體腔），這種方式與其近親環(huán)節(jié)動物［6］和星蟲動物［7］有很大的相似性，均屬于由低等性腺類型向高等類型進化的過渡類型。

螠蟲動物是從環(huán)節(jié)動物中分出的一個小門，由此二者在特征上既有相似又有差異，最典型的是二者在發(fā)育過程中都有體節(jié)產生，但是前者在體節(jié)幼蟲之后，體節(jié)消失，因此體節(jié)僅在其個體發(fā)育較短的時期內存在；而環(huán)節(jié)動物則終生保持分化特征。這種分化差異或許也是導致它們的生殖腺分布、結構以及生殖細胞在其中發(fā)育持續(xù)時間存在差異的原因之一。Clank和Oliue調查了14個科的多毛類動物卵巢的分布情況并將其分為2種類型：一種是性腺分布于身體前端的少量體節(jié)中，另一種是在大量體節(jié)中重復分布［8］。2種類型的共性是性腺按照體節(jié)重復分布。單環(huán)刺螠明顯的性腺結構發(fā)生于幼螠，此時蟲體的體節(jié)已消失，因此其性腺未表現(xiàn)出環(huán)節(jié)動物樣的分節(jié)分布特征，而是在體后部后腸附近極小的范圍內發(fā)生，這種性腺不按體節(jié)分布的特征與同樣由環(huán)節(jié)動物分出的另一個小門動物—星蟲動物是一致的。星蟲動物的卵巢也沒有按節(jié)律分布，其位于身體前端腹側收吻肌的基部，為指狀小葉組成的帶狀結構［7］。3類動物中，星蟲的生殖腺由于外由腹膜包被，內部各期生殖細胞（性原細胞，初級性母細胞，次級性母細胞）均有分布，可謂是較高等的類型［9］；單環(huán)刺螠次之，其卵巢中存在卵原細胞和早期初級卵母細胞，但無發(fā)達的結締組織膜包被；最低等的應該是環(huán)節(jié)動物多齒圍沙蠶，它沒有固定的生殖腺，生殖腺由局部體隔膜上皮分化而來，卵巢內只存在卵原細胞［6］。

由上可見，3類動物生殖腺既存在相似性，說明它們存在親緣關系；又存在差異。且性腺的差異性一定程度上與其物種進化關系是一致的。

3.2 單環(huán)刺螠卵巢的年發(fā)育周期

一般來講，動物由幼體到成體的時期，同時也是性腺發(fā)育和成熟的時期。第一次性腺成熟對不少種類的動物來說是一生中的唯一經歷，但對大量的海洋無脊椎動物來說，在一生中都有著多次性腺成熟的現(xiàn)象。在這種情況下，性腺在前一次發(fā)育成熟并排出精卵后即進入休止時期，待新的內外條件具備時再進入下一次發(fā)育過程。正是這種形態(tài)和生理變化的周而復始形成了性腺發(fā)育的周期性。

利用組織學方法，根據(jù)單環(huán)刺螠不同時期卵巢的大小、結構組成及體腔液中生殖細胞的發(fā)育狀況，作者將單環(huán)刺螠卵巢年周期發(fā)育分為5個時期：增殖期（6月末～7月和11月～次年1月）、生長期（7月末～8月下旬和2月～4月初）、成熟期（8月末～9月中旬和4月～5月初）、排放期（9月下旬～10月中旬和5月中旬～6月中旬）和休止期（10月下旬～11月初和6月中旬～下旬）。與單環(huán)刺螠的生殖期（春季：4月下旬～5月下旬；秋季：9月中旬～10月中旬）相比，卵巢的成熟期與生殖期并不完全同步，性腺成熟期比繁殖期稍早。本實驗性腺的年發(fā)育周期和生殖周期的研究結果將為深入進行單環(huán)刺螠生殖生物學研究以及該物種苗種繁育及增養(yǎng)殖開發(fā)具有促進作用。

［1］ 李鳳魯，王瑋，周紅.我國黃渤海螠蟲動物（螠蟲動物門）的研究［J］.青島海洋大學學報，1994，24（2）：203－210.

［2］ Kang Kyoung Ho，Zhang Zhifeng，Kim Jae Min，et al.Effects of Urechis unicinctus Juveniles on chemical characteristics of organically contaminated coastal sediment［J］.J Ocean Univ China，2010，9（1）：48－52.

［3］ 張紅衛(wèi).發(fā)育生物學［M］.北京：高等教育出版社，2006.

［4］ Saffman E E，Lasko P.Germline development in vertebrates and invertebtates［J］.CMLS Cell Mol Life Sci，1999，55：1141－1163.

［5］ 李諾，宋淑蓮，唐永政.山東沿海單環(huán)刺螠繁殖生物學的研究［J］.動物學報，1997，43（4）：433－435.

［6］ 杜榮斌，劉紅梅，鄭家聲，等.人工養(yǎng)殖條件下多齒圍沙蠶親體培育和繁殖生物學的初步研究［J］.海洋科學，2009，33（11）：37－43.

［7］ 顧曉英，竺俊全，許式見，等.可口革囊星蟲（Phascolosoma esculenta）卵子發(fā)生的組織學研究［J］.海洋與湖沼，2009，40（3）：283－288.

［8］ 多齒圍沙蠶（Perinereis Nuntia Savigny）人工養(yǎng)殖條件下親體培育生態(tài)條件和繁殖生物學的研究［D］.青島：中國海洋大學，2004.

［9］ 竺俊全，王武，許世見，等.可口革囊星蟲的精子發(fā)生及精子結構［J］.動物學報，2007，53（4）：733－741.