革蘭氏陽性菌和陰性菌對(duì)山梨酸鉀的耐受差異性

滕 菲， 郭桂萍， 趙 勇， 潘迎捷， 盧 瑛＊

（1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.江蘇南通出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 南通 226000）

革蘭氏陽性菌和陰性菌對(duì)山梨酸鉀的耐受差異性

滕 菲1， 郭桂萍2， 趙 勇1， 潘迎捷1， 盧 瑛＊1

（1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.江蘇南通出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 南通 226000）

對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌對(duì)山梨酸鉀防腐劑的耐受性差異進(jìn)行了探討。以食品中常見的革蘭氏陽性菌（蠟樣芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌）與革蘭氏陰性菌（沙門氏菌、副溶血弧菌、熒光假單胞菌）為研究對(duì)象，針對(duì)純培養(yǎng)狀態(tài)和模擬食品體系進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，加入1 g／L山梨酸鉀后革蘭氏陰性菌的菌數(shù)可減少近102～103.5CFU／m L，而革蘭氏陽性菌的菌數(shù)只能減少近10 CFU／m L，說明山梨酸鉀對(duì)革蘭氏陰性菌的抑菌效果比革蘭氏陽性菌要高2倍以上。最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)和即食海帶的接種模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果與生長(zhǎng)曲線結(jié)果相吻合，顯示革蘭氏陽性菌對(duì)山梨酸鉀的耐受性強(qiáng)于革蘭氏陰性菌，此結(jié)果對(duì)于今后應(yīng)用山梨酸鉀進(jìn)行革蘭氏陽性菌類的防控具有重要意義。

革蘭氏陽性菌；革蘭氏陰性菌；耐受性；山梨酸鉀

食源性疾病是發(fā)展中國(guó)家和發(fā)達(dá)國(guó)家的首要食品安全問題，對(duì)人類健康危害嚴(yán)重，尤其是對(duì)兒童、孕婦和老人。食品在生產(chǎn)和貯藏過程中，易受細(xì)菌性微生物感染而腐敗變質(zhì)，并導(dǎo)致食物中毒和食源性疾病影響人類健康。采用防腐劑抑制腐敗菌與食源性致病菌是貯藏食品的有效手段之一［1］。常見的食源性致病菌種類繁多，其中包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。目前水產(chǎn)品中的主要防腐劑有山梨酸鉀，山梨酸，二氧化氯水溶液等［2］。山梨酸鉀作為一種不飽和脂肪酸，可在體內(nèi)參與新陳代謝，最終被分解成二氧化碳和水，而幾乎沒有毒性［3］，目前山梨酸鉀已成為一種在全球范圍使用廣泛的化學(xué)防腐劑。

金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌是革蘭氏陽性菌，在環(huán)境中分布廣泛［4－5］，兩者在我國(guó)水產(chǎn)品中都曾有報(bào)道被檢出［4，6－7］。副溶血弧菌是一種革蘭陰性嗜鹽桿菌，主要分布于沿岸海水、海河交界處及海產(chǎn)品中，是沿海地區(qū)引起食物中毒的重要病原菌，在海產(chǎn)品上的帶菌率高達(dá)45.7%［8］。有報(bào)道稱這3種菌引起的食物中毒事件近年來呈上升趨勢(shì)［9］。沙門氏菌是革蘭氏陰性無芽抱桿菌，是我國(guó)進(jìn)口水產(chǎn)品致病菌檢測(cè)中的必檢項(xiàng)目［10］。作者選取這4種菌以及食品中常見的蠟樣芽孢桿菌和熒光假單胞菌作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)純培養(yǎng)狀態(tài)和模擬食品體系中的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌對(duì)山梨酸鉀防腐劑的耐受性差異進(jìn)行了探討，以期為今后制定更有針對(duì)性的食品防控措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料山梨酸鉀（食品添加級(jí)）：購自珠海市悅發(fā)食品有限公司；菌株：購于ATCC；培養(yǎng)基：胰蛋白胨大豆肉湯和胰蛋白胨大豆瓊脂（TSB，TSA）：均購于中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；即食海帶（1 k G真空包裝）：上海揚(yáng)騏工貿(mào)有限公司所贈(zèng)。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；分析天平：梅特洛－托利多公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化及菌懸液制備菌種于－80℃冰箱中取出，取一環(huán)接種于5 m L TSB中，活化3次。

1.2.2 生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)取500μL活化3次后的菌液接種于100 m LTSB的三角燒瓶中，37℃、170 r／min轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)至菌數(shù)為103CFU／m L時(shí)加入山梨酸鉀。于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。加入的山梨酸鉀質(zhì)量濃度為0.2，1，2，4 g／L，另取一組未加山梨酸鉀的培養(yǎng)基做為對(duì)照組，每個(gè)質(zhì)量濃度做3個(gè)平行。持續(xù)培養(yǎng)，每小時(shí)取樣品進(jìn)行平板記數(shù)。

1.2.3 最小抑菌濃度（MIC）實(shí)驗(yàn)參考 Millette等人的試驗(yàn)方法［12］，首先將山梨酸鉀溶于TSB中，二倍梯度稀釋，取各梯度稀釋液0.1 m L注入無菌的96孔培養(yǎng)板中。然后每個(gè)孔中加入5×105CFU／mL指示菌，實(shí)際實(shí)驗(yàn)中山梨酸鉀的最終質(zhì)量濃度為600，300，150，75，37.5，15.75 g／L。另外取一組未接指示菌的山梨酸鉀梯度液作為陰性對(duì)照。將96孔板蓋上無菌膜放于37℃培養(yǎng)24 h。然后于96孔酶標(biāo)儀600 nm下測(cè)定吸光值。樣品孔指示菌的A600值與陰性對(duì)照組有明顯差異時(shí)的濃度視為最小抑菌濃度。

1.2.4 接種海帶實(shí)驗(yàn)取新鮮出廠的真空包裝即食海帶樣品，用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇浸泡30 min，無菌水洗3次備用，此時(shí)海帶的帶菌量小于5 CFU／mL，吸取103CFU／mL活化3次后的各菌液分別滴加到盛有25 g酒精處理后海帶的無菌培養(yǎng)皿中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。參考食品添加標(biāo)準(zhǔn)GB2760－1996系列中針對(duì)即食海帶的規(guī)定［11］，加入1 g／L山梨酸鉀溶液；另取一組未加山梨酸鉀的酒精處理后海帶做為對(duì)照組，每個(gè)質(zhì)量濃度做3個(gè)平行。持續(xù)培養(yǎng)24 h，每4 h取樣品進(jìn)行平板記數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)曲線結(jié)果

由圖1可見，蠟樣芽孢桿菌組中加入山梨酸鉀后，在進(jìn)入生長(zhǎng)平衡期時(shí)（8 h），加入1 g／L山梨酸鉀時(shí)菌數(shù)比對(duì)照組減少了近10 CFU／m L，加入2，4 g／L山梨酸鉀時(shí)比對(duì)照組減少了近100 CFU／m L。對(duì)于金黃色葡萄球菌組，在培養(yǎng)4 h后可觀察到較明顯變化：加入1，2 g／L山梨酸鉀組其菌數(shù)比對(duì)照組減少了近100.5CFU／m L，加入4 g／L山梨酸鉀時(shí)菌數(shù)比對(duì)照組減少了約10 CFU／m L。對(duì)于單增李斯特菌組，培養(yǎng)20 h后，加入了1、2 g／L山梨酸鉀組的菌數(shù)比對(duì)照組減少了近10 CFU／m L，而加入了4 g／L山梨酸鉀組的菌數(shù)則比對(duì)照組減少了近100 CFU／m L。國(guó)標(biāo)中規(guī)定的山梨酸鉀最大加入量為1 g／L，上述3種菌在此濃度時(shí)的菌數(shù)與對(duì)照組相比，都減少了約10 CFU／m L。上述結(jié)果顯示，山梨酸鉀對(duì)蠟樣芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌有一定的抑制作用。

圖1 致病菌在不同山梨酸鉀質(zhì)量濃度下的生長(zhǎng)曲線圖Fig.1 Effect of potassium sorbate concentration on the growth curves of three gram positive bacteria

圖2 致病菌在不同山梨酸鉀質(zhì)量濃度下的生長(zhǎng)曲線圖Fig.2 Effect of potassium sorbate concentration on the growth curves of three gram negative bacteria

由圖2可知，沙門氏菌組中加入了1 g／L山梨酸鉀后生長(zhǎng)平衡期（10 h）的菌數(shù)比對(duì)照組減少了100 CFU／m L，加入4 g／L山梨酸鉀組則減少了將近103.5CFU／m L。副溶血弧菌組在培養(yǎng)6 h后，加入0.2 g／L山梨酸鉀后即比對(duì)照組減少了近101.5CFU／m L，加入1 g／L 山梨酸鉀后減少了近103.5CFU／m L，加入4 g／L山梨酸鉀后的菌數(shù)比對(duì)照組減少了近104CFU／m L。對(duì)于熒光假單胞菌，加入0.2 g／L山梨酸鉀后在生長(zhǎng)平衡期（10 h）的菌數(shù)比對(duì)照組減少了近10 CFU／m L，加入1 g／L山梨酸鉀后減少了近100 CFU／m L，加入了4 g／L山梨酸鉀后的平臺(tái)期菌數(shù)比對(duì)照組減少了近103CFU／m L。綜上所述，上述3種菌在加入了國(guó)標(biāo)所規(guī)定的最大質(zhì)量濃度1 g／L山梨酸鉀時(shí)，與對(duì)照組相比，平臺(tái)期的菌數(shù)減少了102～103.5CFU／m L。由此可見，山梨酸鉀對(duì)沙門氏菌、副溶血弧菌、熒光假單胞菌3種菌的抑制作用較強(qiáng)。

2.2 最小抑菌濃度（MIC）實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表1可見，山梨酸鉀對(duì)金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌的最小抑菌濃度最高，達(dá)到600 g／L，對(duì)單增李斯特次之，為300 g／L，對(duì)熒光假單胞最低，僅為37.5 g／L，對(duì)副溶血弧菌次之，為75 g／L。雖然山梨酸鉀對(duì)沙門氏菌的最小抑菌濃度與單增李斯特菌相同，但山梨酸鉀對(duì)革蘭氏陽性菌的最小抑菌濃度（300 g／L）整體高于革蘭氏陰性菌 （150 g／L）。這與前面的生長(zhǎng)曲線結(jié)果相吻合。

表1 山梨酸鉀對(duì)革蘭氏陽性菌和陰性菌的抑菌效果Tab.1 Effects of potassium sorbate concentration of growth of gram positive and negative bacteria

2.3 即食海帶接種實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖3可知，金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌接種到即食海帶中后，山梨酸鉀組的生長(zhǎng)曲線與對(duì)照組基本重合，并同時(shí)達(dá)到生長(zhǎng)平衡期。上述結(jié)果說明1 g／L山梨酸鉀對(duì)這兩種革蘭氏陽性菌的生長(zhǎng)基本上沒有抑制作用。

圖3 即食海帶中革蘭氏陽性菌的生長(zhǎng)曲線圖Fig.3 Growth curves of two gram positive bacteria inoculated to instant kelp

由圖4可知，沙門氏菌和副溶血性弧菌接種到即食海帶中后，在生長(zhǎng)平衡期（16～20 h），這兩種菌的山梨酸鉀加入組的菌數(shù)比對(duì)照組減少了近10 CFU／m L，結(jié)果顯示1 g／L山梨酸鉀對(duì)沙門氏菌和副溶血性弧菌有一定的抑制作用。

圖4 即食海帶中革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)曲線圖Fig.4 Growth curves of two gram positive bacteria inoculated to instant kelp

3 結(jié)語

選用了3種革蘭氏陽性菌（分別為蠟樣芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌）和3種革蘭氏陰性菌（分別為沙門氏菌，副溶血弧菌和熒光假單胞菌），探討了食品工業(yè)中常用的防腐劑山梨酸鉀對(duì)這些菌的抑菌效果。不同山梨酸鉀質(zhì)量濃度下的生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示，加入1 g／L山梨酸鉀后，革蘭氏陰性菌的菌數(shù)可減少近102～103.5CFU／m L，而革蘭氏陽性菌的菌數(shù)只能減少近10 CFU／m L，即山梨酸鉀對(duì)革蘭氏陰性菌的抑菌效果比革蘭氏陽性菌要高2倍以上。最小抑菌濃度結(jié)果和即食海帶的接種模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示出革蘭氏陽性菌對(duì)山梨酸鉀的耐受性要高于革蘭氏陰性菌，與生長(zhǎng)曲線結(jié)果相吻合。研究顯示，山梨酸鉀需要通過微生物細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，造成胞內(nèi)p H值降低而抑制細(xì)胞的基本代謝反應(yīng)。山梨酸鉀具有親脂性［14］，革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁脂類物質(zhì)含量較高，因此山梨酸鉀分子易通過；革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁則含有大量肽聚糖，不易通過。因此，作者認(rèn)為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)差異可能是造成兩者對(duì)山梨酸鉀耐受性差異的主要原因。

山梨酸鉀在食品工業(yè)中作為防腐劑應(yīng)用范圍十分廣泛，在很多食品中的使用質(zhì)量濃度不得超過1 g／L，研究顯示，蠟樣芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌這些革蘭氏陽性菌在37℃時(shí)對(duì)高于此規(guī)定質(zhì)量濃度的山梨酸鉀仍有一定的耐受性，具有較好的生長(zhǎng)趨勢(shì)。這說明即便是添加了山梨酸鉀防腐劑，一旦在食品供應(yīng)銷售過程中其貯藏或保存條件不當(dāng)時(shí)，這些菌還是具備大量繁殖能力，即還存在著食品安全的隱患。因此，在應(yīng)用山梨酸鉀防腐劑時(shí)，對(duì)于革蘭氏陽性菌類應(yīng)予以特殊重視并多管齊下進(jìn)行控制為宜。

（References）：

［1］喬支紅，程永強(qiáng)，魯戰(zhàn)會(huì)，等.乳酸對(duì)三種食源性致病菌的抑菌及殺菌作用［J］.食品科技，2008.10：187－191.

QIAO Zhi－h(huán)ong，CHENG Yong－qiang，LU Zhan－h(huán)ui，et al.Antibacterial and bactericide activity of lactic acid against three strains of food－borne pathogenic bacteria［J］.Food Science and Technology，2008.10：187－191.（in Chinese）

［2］凌關(guān)庭，唐述潮，陶民強(qiáng)，等.食品添加劑手冊(cè)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003：645－680.

［3］馬玉山，梁詠梅.山梨酸鉀在肉制品中的應(yīng)用實(shí)例［J］.肉類工業(yè)，2006，8（304）：3－4.

MA Yu－shan，LIANG Yng－mei.Examples of potassium sorbate applied in meat and related products［J］.Roulei Gngye，2006，8（304）：3－4.（in Chinese）

［4］韓斌，劉戰(zhàn)民，高海燕，等.單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測(cè)技術(shù)［J］.中國(guó)生物工程雜志，2008，28（6）：125－128.

HAN Bin，LIU Zhan－min，GAO Hai－yan，et al.Advance on the detection assays of listeria monocytogenes［J］.China Biotechnology，2008，28（6）：125－128.（in Chinese）

［5］王麗哲，晉懷峰，宮樹權(quán)，等.金黃色葡萄球菌污染水產(chǎn)食品的研究［J］.食品科學(xué)，2001，22（5）：78－80.

WANG Li－zhe，JIN Huai－feng，GONG Shu－quan，et al.Study on S.Aureus contamination of aguatic products［J］.Food Science，2001，22（5）：78－80.（in Chinese）

［6］崔京輝，李達(dá)，王永全，等.2004—2005年北京市食品中單核細(xì)胞增生性李斯特菌的污染狀況調(diào)查［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2006，16（12）：1508－1509.

CUI Jing－h(huán)ui，LI Da，WANG Yong－quan，et al.Surveillance on the contamination withListeria monocytogensof food in Beijing during 2004～2005［J］.Chinese Journal of Health Laboratory Technology，2006 16（12）：1508－1509.（in Chinese）

［7］趙晉，楊小蓉，薛晴.四川省食品單核細(xì)胞增生性李斯特菌污染監(jiān)測(cè)［J］.預(yù)防醫(yī)學(xué)情報(bào)雜志，2006，22（3）：256－258.

ZHAO Jin，YANG Xiao－rong，XUE Qing，et al.Surveillance on contamination of listeria monocytogenes in food of sichuan province［J］.Journal of Preventive Medicine Information，2006，22（3）：256－258.（in Chinese）

［8］Kam ruzzam，Bhoopong P，Vuddhaku，et al.Detection of a functional insertion sequence responsible for deletion of the Therm ostable directhem olysin gene（tdh）in Vibrio parahaemolyticus［J］.Gene，2008，421：67－73.

［9］王娜，陶妍.水產(chǎn)中三種致病菌多重PCR檢測(cè)方法的建立［J］.食品與生物技術(shù)報(bào)，2009.28（3）：397－402.

WANG Na，TAO Yan.Establishment of a multiplex PCR for detection of three types of pathogen in aquatic foods［J］.Journal of Food Science and Biotechnology，2009，28（3）：397－402.（in Chinese）

［10］趙宏，張宏偉，魏亞東，等.水產(chǎn)品中沙門氏菌的檢測(cè)和確證［J］.口岸衛(wèi)生控制，2005，11－4：22－23.

ZHAO Hong，ZHANG Hong－wei，WEI Ya－dong，et al.Detection and analysis of salmonella in import aquatic products［J］.Port Health Control，2005，11（4）：22－23.（in Chinese）

［11］黃志良.山梨酸衍生物的合成與抗菌活性研究［D］.廣州：華南理工大學(xué)，2002.

［12］Millette M，Luquet F M，Lacroix M.In vitro growth control of selected pathogens byLactobacillus acidophilusandLactobacillus casei－fermented milk［J］.Letters in Applied Microbiology，2007，44：314－319.

Study of the Tolerance Difference between Gram Positive and Gram Negative Bacteria to Potassium Sorbate

TENG Fei1，GUO Gui－ping2，ZHAO Yong1，PAN Ying－jie1，LU Ying＊1

（1.College of Food Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2.Nantong Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nantong 226000，China）

In this study，the tolerance of 3 gram positive（Bacillus cereus，Staphylococcus aureusandListeria monocytologene）and 3 gram negative bacteria（Vibrio parahaemolyticus，SalmonellaandPseudomonas fluorescens）topotassium sorbate were carefully studied by pure cultivation and simulation of food system.When 1 g／L potassium sorbate was presented in culture，the number of gram negative bacteria was reduced to up to 2～3.5 lg（CFU／m L），while those of gram positive bacteria were only reduce to 1 lg（CFU／m L）.This results demonstrated potassium sorbate inhibited on the gram negative bacteria growth than that of the gram negative bacteria.Results of pure culture，minimal inhibitory concentration（MIC）and inoculation to instant kelp results all showed that the tolerance of gram positive bacteria is better than gram negative bacteria.It may have significance in the application of potassium sorbate on the control of gram positive bacteria.

gram positive，gram negative，tolerance，potassium sorbate，innoculation

＊

盧瑛（1971－），女，浙江東陽人，理學(xué)博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事食品生物技術(shù)方面的研究。Email：y－lu＠shou.edu.cn

TS 201.6

A

1673－1689（2012）04－0417－06

2010－12－21

上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（滬農(nóng)科攻字（2009）第6－1號(hào)）；上海市教育委員會(huì)科研創(chuàng)新項(xiàng)目（09YZ274）；江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局科研項(xiàng)目（2010KJ34）；上海市教育委員會(huì)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（J50704）。