兩種快速分離檢測南方水牛乳乳清蛋白方法的比較

成希飛，李昀鍇，向明霞，徐明芳

（廣州暨南大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物工程系，廣州 510632）

兩種快速分離檢測南方水牛乳乳清蛋白方法的比較

成希飛，李昀鍇，向明霞，徐明芳

（廣州暨南大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物工程系，廣州 510632）

采用了毛細(xì)管電泳法（CE）和反相高效液相色譜法（RP-HPLC）兩種方法對乳源乳清蛋白進(jìn)行分離檢測。結(jié)果表明：兩種方法都能夠有效分離乳清蛋白中的BSA，α-La，β-Lg，并能對各種蛋白進(jìn)行定性定量分析。相比而言，毛細(xì)管電泳法分離更加快速，整個分離過程7 min左右即可完成，能分離出IgG組分。而RP-HPLC分離時間更長，需要45 min才能完全分離，并且無法分離出IgG組分。

毛細(xì)管電泳法；RP-HPLC；牛奶；乳清蛋白

0 引言

水牛乳蛋白和脂肪含量高，還富含鋅、鐵等礦物質(zhì)元素，具有脂肪直徑大，酸度小，易吸收等特點(diǎn)[1-2]。水牛乳非蛋白氮含量較低，含有寡糖，具有免疫調(diào)節(jié)作用[3-4]。

近年來高效液相色譜（HPLC）和毛細(xì)管電泳（CE）的發(fā)展為蛋白質(zhì)和多肽的分離分析提供了新的手段。CE法在乳蛋白檢測[5-6]、遺傳變異體及處理方法對乳蛋白含量變化[7]的研究中被廣泛應(yīng)用。唐萍[8]、劉婷[9]等采用檸檬酸緩沖體系對乳蛋白進(jìn)行研究并取得了較好的結(jié)果。HPLC法在氨基酸、多肽、糖類及蛋白質(zhì)的分離和定量分析上應(yīng)用廣泛，目前RP-HPLC在乳品中的蛋白分離分析、摻假[10-11]、變異體等[12-13]方面已有廣泛的研究。

本文采用CE及RP-HPLC兩種方法對水牛乳乳清蛋白進(jìn)行分離檢測，并與荷斯坦奶乳清蛋白進(jìn)行差異性分析。CE法分離效果更好，分離時間更短。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 主要儀器、試劑及材料

材料及試劑：荷斯坦鮮牛奶、水牛奶（均為巴氏殺菌奶，市售）；α-乳白蛋白（α-lactalbumin,α-La，L6010）、β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg，L3908）、免疫球蛋白（IgG,HA010,sigma公司）、BSA（純度≥96%，北京欣普森生物科技有限公司）；乙腈及三氟乙酸（色譜純）；Millipor純水。SDS純度＞99%、聚乙二醇(PEG4000)，羥丙基甲基纖維素，其他試劑均為分析純。

儀器：P/ACE MDQ型毛細(xì)管電泳儀；PHS-3C pH計(jì)；Agilent 1100型HPLC色譜儀及數(shù)據(jù)處理平臺；KDC-2046型冷凍離心機(jī)；CP224C型電子天平。

1.2 方法

1.2.1 乳清蛋白的提取

新鮮牛乳以4 000 r/min（4℃）離心25 min，除去乳脂，吸出清液。用濃度為5 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值為4.6，靜置30 min，以4 000 r/min（4℃）離心20 min，棄去沉淀，清液0.22 μm濾膜過濾備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

α-La，β-Lg，BSA，IgG溶于蒸餾水分別配制成終質(zhì)量濃度為10，9.6，10.1，2.0 g/L的儲液，0.22 μm濾膜過濾備用。

1.2.3 緩沖液的配制硼砂電泳緩沖液

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%硼砂，濃度為1 mol/L硼酸調(diào)pH值，定容至25 mL，0.22 μm濾膜過濾備用.

1.2.4 毛細(xì)管電泳操作條件

毛細(xì)管電泳測定條件:毛細(xì)管柱溫25℃;檢測波長214 nm;壓力進(jìn)樣(3.9 KPa)，進(jìn)樣時間5 s；運(yùn)行電壓25 kV；柱清洗：每次進(jìn)樣前分別用水洗5 min和緩沖液沖洗3 min。每次分離后用濃度為0.1 mol/L的NaOH沖洗2 min。

1.2.5 反相高效液相色譜條件

Agilent 1100高效液相色譜儀及數(shù)據(jù)處理平臺1100,包括自動進(jìn)樣器、光電二極管陣列檢測器(DAD)、柱溫箱、進(jìn)樣瓶、渦漩振蕩器、針管過濾器、0.45 μm尼龍濾膜；RP-HPLC色譜柱Jupiter C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，孔徑：300A)。流動相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%的三氟乙酸（TFA）水溶液，B為體積分?jǐn)?shù)0.1%的TFA的乙腈溶液。洗脫梯度：0～9 min為3%～35%B；9～18 min為37%～40%B；18～22 min為40%～41%B；22～27.5 min為41%B；27.5～28 min為41%～43%B；28～36 min為43%～45%B；36～40 min為45%～90%B；柱溫為20℃，流速為0.8 mL/min，檢測波長為214 nm，進(jìn)樣量為20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 毛細(xì)管電泳及RP-HPLC色譜結(jié)果

2.1.1 乳清蛋白混合標(biāo)樣毛細(xì)管電泳

毛細(xì)管電泳條件：電泳緩沖液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的SDS，1.2%硼砂，pH值為8.95，電壓25 kV，溫度25℃。圖1為乳清蛋白混合標(biāo)樣毛細(xì)管電泳結(jié)果。由圖1可以看出，本文所采取的毛細(xì)管電泳條件可以有效地將乳清蛋白混合標(biāo)樣的各個組分完全分開，出峰順序依次為IgG，BSA，β-Lg，α-La，且分離效果良好。

2.1.2 RP-HPLC色譜

圖2為乳清蛋白混合標(biāo)樣高效液相色譜圖。由圖2可以看出，在1.2.5色譜條件下，乳清蛋白標(biāo)樣高效液相色譜圖出峰蛋白依次為BSA，α-La，β-Lg。最早被洗脫下來的BSA與雜質(zhì)能完全分離，分離效果較好。結(jié)果表明，在該色譜條件下進(jìn)行乳清蛋白單體的分離是可行的。

2.2 乳源乳清蛋白組分的分離及差異性分析

2.2.1 水牛奶乳清蛋白的毛細(xì)管電泳分析

水牛奶含有較高的營養(yǎng)價值，其大多數(shù)營養(yǎng)物質(zhì)比荷斯坦奶牛、人母乳、黃牛奶更豐富，較為適合制作多種優(yōu)質(zhì)奶產(chǎn)品。

由圖3（a）可以看出，水牛奶乳清蛋白BSA，β-Lg，α-La在該電泳條件下的遷移時間分別為6.19，6.56，6.69 min；IgG的兩個遷移時間分別為5.17 min和5.26 min。另外，β-Lg的峰面積大于α-La的峰面積，即β-Lg的含量高于α-La。荷斯坦牛奶乳清蛋白的BSA、β-Lg、α-La的遷移時間為6.11 min、6.31 min、6.43min，IgG的兩個遷移時間分別為5.29 min、5.36 min（圖3b），β-Lg的峰面積與α-La的峰面積相差極大，即β-Lg的含量遠(yuǎn)低于α-La的質(zhì)量濃度，原因可能是在牛奶進(jìn)行加工時因所采用的處理方法而造成β-Lg蛋白質(zhì)量濃度的減少。水牛奶乳清蛋白與荷斯坦牛奶的乳清蛋白在遷移時間上有顯著不同，同時由表1看出，兩種牛奶的乳清蛋白中4種主要成分蛋白的含量也有所不同，水牛奶乳清蛋白的主要成分的質(zhì)量濃度高于荷斯坦牛奶中乳清蛋白的質(zhì)量濃度。

表12 種牛奶乳清蛋白的質(zhì)量濃度g/L

綜上可見，水牛奶乳清蛋白與荷斯坦牛奶的乳清蛋白有顯著差異性，分析原因：水牛奶乳清蛋白與荷斯坦牛奶乳清蛋白在蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)上有所不同，從而造成蛋白在高級結(jié)構(gòu)、分子量及所帶電荷的不同，以致各蛋白在進(jìn)行毛細(xì)管電泳時的荷質(zhì)比不同，表觀體現(xiàn)在蛋白的遷移時間的不同。

2.2.2 水牛奶乳清蛋白的RP-HPLC色譜分析

圖4為水牛奶、荷斯坦牛奶乳清蛋白的RP-HPLC色譜分離圖結(jié)果。由圖4可以看出，乳清蛋白在本實(shí)驗(yàn)色譜條件下的出峰順序依次為：BSA，α-La，β–Lg。由圖4(a)水牛奶乳清蛋白的色譜圖可知，BSA的出峰時間為18.91 min。α-La在19.97 min有一個峰，表明α-La成分單一無遺傳變異體，β-Lg有3個峰說明β-Lg有3種遺傳變異體，其出峰時間分別為28.34 min、32.1 min、33.30 min。由圖4(b)可知，荷斯坦牛奶BSA在19.03min，α-La在20.05 min各有一峰，表明α-La成分單一無遺傳變異體，β-Lg在29.20 min和32.20 min有兩個變異體峰。同時由表2看出，兩種牛奶的乳清蛋白中3種主要成分蛋白的含量也有所不同。

綜上所述，水牛奶乳清蛋白與荷斯坦牛奶乳清蛋白在出峰時間及蛋白變異體上都有顯著的差異性，分析原因：水牛奶乳清蛋白與普通荷斯坦牛奶乳清蛋白在蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)上有所不同，從而造成蛋白在高級結(jié)構(gòu)、分子量、所帶電荷及蛋白的極性有所不同，在進(jìn)行梯度洗脫時，蛋白隨洗脫液的疏水性的改變而逐步被洗脫，從而表現(xiàn)在出峰時間上有所不同。

表22 種牛奶乳清蛋白的質(zhì)量濃度g/L

3 結(jié)論

毛細(xì)管電泳法能有效分離檢測乳清蛋白中的BSA，β-Lg，α-La，IgG 4種組分。結(jié)果表明，水牛奶乳清蛋白在遷移時間上與普通荷斯坦牛奶乳清蛋白的遷移時間及蛋白質(zhì)量濃度有明顯差異。RP-HPLC法能有效分離檢測乳清蛋白中的BSA，β-Lg，α-La 3種組分。從保留時間和蛋白含量兩個方面分析了水牛奶乳清蛋白與普通荷斯坦牛奶乳清蛋白的差異性，水牛奶乳清蛋白在保留時間上與普通荷斯坦牛奶乳清蛋白的保留時間有明顯差異，且水牛奶乳清蛋白α-La無變異體，β-Lg有3個變異體，與荷斯坦奶有明顯差異。

本文采用毛細(xì)管電泳和RP-HPLC兩種方法都能將乳源乳清蛋白中的組分分開，但是毛細(xì)管的分辨率更好，能將乳中的4種組分（BSA，β-Lg，α-La，IgG）分開，RP-HPLC沒有檢測到IgG峰。并且毛細(xì)管電泳的分離時間更短，7 min左右即可分離完全，而RPHPLC需要45 min。對比兩種方法的峰形，可以看出毛細(xì)管電泳的峰寬比RP-HPLC的峰寬窄，說明毛細(xì)管電泳方法分離效率更高。

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Contrast between two rapid separation and detection of Southern Water Buffalo whey protein methods

CHENG Xi-fei，LI Yun-kai，XIANG Ming-xia，XU Ming-fang
(Department of biotechnology,Jinan University,Guangzhou 510632,China)

Two methods were studied for the separation and detection of whey protein by reverse-phase HPLC(RP-HPLC)and capillary electrophoresis(CE).The results show that two methods can both separate BSA、α-La、β–Lg effectively,and both can do qualitative and quantitative analysis for different kinds of whey protein.In contrast,CE can separate more rapidly,it only used 7 minutes to complete the whole separation process while RP-HPLC needed 45 minutes,in addition,RP-HPLC cannot separate and examine the IgG component.

CE；RP-HPLC;milk;whey protein

TS252.7

A

1001-2230（2012）05-0055-03

2011-11-14

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（No:2009B011300003），兩種快速分離檢測南方水牛乳乳清蛋白方法的比較。

成希飛（1988-），女，碩士，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物與微生物工程。

徐明芳