牛奶樣品中志賀氏菌膠體金免疫試紙條檢測方法的建立

徐鋒，武曉麗，徐迪，明星，魏華,，黎鵬,

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330047 2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，南昌 330047 3.江西中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，南昌 330004）

牛奶樣品中志賀氏菌膠體金免疫試紙條檢測方法的建立

徐鋒2，武曉麗3，徐迪1，明星1，魏華1,2，黎鵬1,2

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330047 2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，南昌 330047 3.江西中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，南昌 330004）

通過用超聲波破碎的宋內(nèi)氏志賀氏菌和福氏志賀氏菌的菌體碎片為免疫原免疫BALB/c小鼠，獲得4株能穩(wěn)定分泌抗志賀氏菌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，選取其中一株制備單抗，并用膠體金標(biāo)記。同時(shí)抗志賀氏菌的兔多抗和驢抗鼠抗體（二抗）分別噴涂于硝酸纖維素膜作為檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線），研制了志賀氏菌膠體金快速檢測試紙條。結(jié)果顯示試紙條的靈敏度為105mL-1，并只與兩株志賀氏菌有陽性反應(yīng)外，而與其它23株常見的細(xì)菌無交叉反應(yīng)。同時(shí)在檢測添加有阪崎腸桿菌和長雙歧桿菌的牛奶樣品中，結(jié)果顯示試紙條的靈敏度為106mL-1。志賀氏菌免疫膠體金試紙條的建立，為加強(qiáng)食品中志賀氏菌的檢測工作，建立一種快速、簡便的篩查方法具有重要的意義。

宋內(nèi)氏志賀氏菌；福氏志賀氏菌；試紙條；檢測方法

0 引言

志賀氏菌屬于革蘭氏陰性細(xì)胞內(nèi)致病菌，是一類具有高度傳染性和危害嚴(yán)重的食源性致病菌[1-2]。奶牛養(yǎng)殖過程中，受衛(wèi)生條件影響，養(yǎng)殖環(huán)境易遭受志賀氏菌污染，對牛奶造成潛在威脅。每年全球有1.6億人患病，而志賀氏菌感染的高發(fā)人群最主要為l～4歲的兒童[3]，嚴(yán)重威脅人類健康和社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。故此，志賀氏菌被我國衛(wèi)生部和農(nóng)業(yè)部列為牛奶原料乳衛(wèi)生指標(biāo)檢測的必檢項(xiàng)目[4]。

免疫膠體金技術(shù)簡便快速，避免了傳統(tǒng)檢測方法中繁瑣的生化鑒定環(huán)節(jié)和PCR方法對操作人員、檢測儀器及檢測環(huán)境的要求，15 min即可出結(jié)果，可滿足現(xiàn)場快速檢測要求。因此，本研究旨在建立一種快速、簡便篩查牛奶樣品中志賀氏菌的膠體金免疫試紙條檢測方法。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 菌株

阪崎腸桿菌45401(Cronobacterspp CMCC45401)，粉塵腸桿菌(Enterobacter pulverisPESA5)，副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticusPVPA0125)，鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimuriumATCC13311)，單核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes54001)，白色假絲酵母(Candida guilliermondiiZ1)，腸致病性大腸桿菌(Enteropathogenic E.ColiCMCC 44496)，大腸桿菌O157:H7 EDC(Escherichia coliO157:H7 EDC)，宋內(nèi)氏志賀氏菌(Shigella sonneiATCC29930)，福氏志賀氏菌(Shigella flexneriATCC29903)，藤黃微球菌(Micrococcus luteusCMCC28003)，短雙歧桿菌(Bifidobacterium breveWBBR04)，動物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalisWBBR05)，兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidumWBBI01)，嬰兒雙歧桿菌(BifidobacteriuminfantisWBAN07)，青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolensentisWBAD08)，乳雙歧桿菌(BifidobacteriumlactisWLABO9)，長雙歧桿菌(Bifidobac terium longumNCC2705)，植物乳桿菌(Lactobacterium plantarumATCC 8014)，唾液乳桿菌唾液亞種(Lactobacillus salivariusssp.salivarius1.1881)，鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosusGG ATCC 7469)，德氏乳桿菌德氏亞種(Lactobacillus delbruechiissp.delbrueckii1.2624)，嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus1.1878)，嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilusG1)，保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricusF1)，為本實(shí)驗(yàn)室保存。

BALB/c小鼠購自南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物科學(xué)部，濃縮型DAB試劑盒購自中杉金橋公司。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

LB培養(yǎng)基；MRS培養(yǎng)基；PBS緩沖液（pH 7.4）；DMEM培養(yǎng)液（Hyclone）；胎牛血清（GIBCO）；酶標(biāo)二抗（中杉金橋公司）；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑（Sigma）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純化學(xué)試劑。

1.1.3 主要儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱；超聲破碎儀；高速冷凍離心機(jī)；厭氧培養(yǎng)箱；BIO-DOT XYZ-3050點(diǎn)噴系統(tǒng)；Milli-Q水處理系統(tǒng)；HGS-201可編程切條機(jī)，ZX-6090B真空干燥箱，酶標(biāo)測定儀。

1.2 方法

1.2.1 志賀氏菌的培養(yǎng)與抗原制備

將-80℃保存的宋內(nèi)氏志賀氏菌和福氏志賀氏菌菌株分別接種于LB平板上進(jìn)行劃線，37℃培養(yǎng)24 h后，挑選單菌落接種于LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)16 h，按1%接種量接種于300 mL LB培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)20 h后，8 000 r/min，室溫離心2 min收集菌體，并用PBS洗滌三遍。最終用20 mL PBS重懸菌體，經(jīng)超聲波(220 Hz)破碎，13 000 r/min，4℃離心10 min，收集沉淀，用PBS洗滌3遍后，混合兩株菌的破碎沉淀作為免疫抗原-20℃保存。

1.2.2 單克隆抗體的制備

方法參照崔煥忠等人[5]方法免疫BALB/c小鼠制備單克隆抗體。每只小鼠每次注射300 μg志賀氏菌細(xì)胞碎片抗原，篩選融合細(xì)胞采用新鮮培養(yǎng)的宋內(nèi)氏志賀氏菌?？贵w效價(jià)的測定參照張建群等人[6]，采用間接ELISA法測定多克隆抗體的效價(jià)。單克隆抗體Ig類與亞類采用瓊脂糖擴(kuò)散試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。

1.2.3 抗體交叉反應(yīng)的檢測

把材料1.1.1中的25種菌株分別活化培養(yǎng)，并調(diào)整菌體濃度為109CFU/mL。取PVDF膜，甲醇活化30 sec，于PBS溶液中振蕩15 min，取菌液各5 μL分別點(diǎn)于膜上，陰干后，浸入5%的脫脂乳溶液37℃封閉1 h，取出，浸入單克隆抗體稀釋液，37℃孵育1 h，用PBST清洗三遍，加入酶標(biāo)二抗，按照濃縮型DAB試劑盒的說明進(jìn)行顯色。

1.2.4 志賀氏菌免疫膠體金試紙條的制備

參照付連軍等人的方法[7]制備志賀氏菌免疫膠體金試紙條，封閉劑選用0.5%的雞卵清蛋白。

1.2.4.1 多克隆抗體和單克隆抗體的配對

采用雙抗夾心ELISA進(jìn)行配對實(shí)驗(yàn)?？怪举R氏菌兔多抗從800倍開始倍比稀釋，單克隆抗體，從200倍開始倍比稀釋。

1.2.4.2 膠體金標(biāo)記抗志賀氏菌單抗的制備

膠體金的制備采用檸檬酸三鈉還原法，當(dāng)溶液的顏色完全變?yōu)橥该鞯募t色時(shí)，停止加熱，冷卻至室溫，4℃保存?zhèn)溆?。?個(gè)2 mL離心管，分別加入1.5 mL膠體金，用濃度為0.2 mol/L的K2CO3將pH值分別調(diào)為3，4，5，6，7，8，9，10。各取1 mL不同pH值的膠體金分別加入8個(gè)2 mL離心管中。取100 μL質(zhì)量濃度為1 g/L的單克隆抗體加入上述離心管中，震蕩20 min后室溫放置10 min，每管分別加入100 μL 100 g/L NaCl溶液，震蕩混勻室溫下放置10 min，記錄保持紅色的最低pH（X）。再將pH調(diào)為梯度X-0.8、X-0.6、X-0.4、X-0.2、X、X+0.2、X+0.4、X+0.6、X+0.8重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，以完全溶解呈均勻的透明酒紅色溶液管的pH值為最佳。

蛋白標(biāo)記量以目測法確定。取10個(gè)2 mL離心管，分別加入1 mL膠體金，用濃度為0.2 mol/L的K2CO3將pH值調(diào)為8.0。將待標(biāo)記的抗志賀氏菌單克隆抗體逐級稀釋后，各取100 μL分別加入離心管中，使每個(gè)離心管中的蛋白含量如表1，搖勻室溫放置5 min，分別加入100 μL 100 g/L NaCl，混勻后靜置2 h觀察結(jié)果。保持紅色的離心管中，所含最低蛋白量即為穩(wěn)定1 mL膠體金的必須蛋白量，實(shí)際用量為最低蛋白量的120%～130%。封閉劑選用0.5%的雞卵清蛋白

1.2.4.3 檢測線（T線）包被濃度的確定

選擇質(zhì)量濃度為1.5 g/L驢抗鼠IgG作為質(zhì)控線（C線）的噴涂濃度，將抗志賀氏菌兔多克隆抗體稀釋成不同濃度，質(zhì)量濃度設(shè)置為0.25，0.5，1，1.5，2 g/L，再和質(zhì)量濃度為1 g/L驢抗鼠IgG分別以1 μL/cm噴涂于硝酸纖維素膜的檢測線與質(zhì)控線位置，37℃溫箱干燥4～5 h。將標(biāo)記膠體金液4℃、4 000 r/min離心30 min，沉淀10倍濃縮重懸，用點(diǎn)樣儀將重懸液點(diǎn)樣于結(jié)合墊上（8 μL/cm），真空干燥1～2 h。將吸水紙、樣品墊、包被硝酸纖維素膜、結(jié)合墊固定于PVC底板上，切割成4 mm寬的條子。將無菌PBS緩沖液（pH=7.4）與不同濃度梯度的宋內(nèi)氏志賀氏菌（108～105mL-1）分別加入不同條件的檢測卡上，10～15 min后讀取結(jié)果。

表1 抗體標(biāo)記量確定

1.2.4.4 試紙條的組裝

用BIODOT XYZ三維點(diǎn)樣平臺將抗志賀氏菌兔多克隆抗體及驢抗鼠二抗按照最佳濃度噴在NC膜上的檢測線和控制線位置，置于37℃恒溫干燥箱干燥8 h。同時(shí)將金標(biāo)抗體按照選定的噴金量噴在膠金墊上，于30℃真空干燥箱干燥2 h。之后將濾紙、樣品墊、膠金墊、NC膜、吸水紙依次搭接粘于PVC底板上，用BIODOT切割機(jī)切成4 mm寬條狀后裝入卡殼，置于包裝袋中，加干燥劑密封，于常溫下保存。

1.2.5 試紙條檢測樣品

將各種細(xì)菌用0.01 mol/L PBS稀釋至108CFU/mL，分別取100 μL加入試紙條點(diǎn)樣槽中，并設(shè)濃度為0.01 mol/L的PBS與混有雜菌的奶粉樣本作為陰性對照，10～15 min后讀取結(jié)果。將純培養(yǎng)的宋內(nèi)氏志賀氏菌分別用濃度為0.01 mol/L的PBS和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%脫脂奶粉（混合有108mL-1的阪崎腸桿菌和長雙歧桿菌）稀釋成104～107mL-1的不同濃度梯度，分別取100 μL加入試紙條點(diǎn)樣槽中，10～15 min后讀取結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 抗志賀氏菌單克隆抗體的制備

超聲波破碎后的志賀氏菌菌體碎片為免疫原免疫BALB/c小鼠，其抗血清效價(jià)如表2所示，約為640000左右?？梢匀∑⑴K用于單抗制備，經(jīng)融合，篩選獲得4株陽性融合細(xì)胞4E2、3E7、10H7、4G9，抗體類型均為IgG1a。

2.2 抗志賀氏菌單克隆抗體交叉反應(yīng)的檢測

表2 小鼠抗血清效價(jià)的測定

將25種菌株菌體分別點(diǎn)于膜上，取4G9單抗進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，結(jié)果如圖1所示，除兩株志賀氏菌（斑點(diǎn)1和斑點(diǎn)3）有反應(yīng)外，與腸致病性大腸桿菌CMCC 44496（斑點(diǎn)11）有交叉反應(yīng)，而與其他菌株均無反應(yīng)。

1-25對應(yīng)菌株參見表5。

2.3 多克隆抗體和單克隆抗體的配對

利用雙抗夾心ELISA對兔多克隆抗體與4G9單克隆抗體進(jìn)行配對檢測，結(jié)果如表3所示，這兩種抗體可同時(shí)用于制備膠體金試紙條。

表3 全菌抗原免疫所得多克隆抗體與單克隆抗體雙抗夾心結(jié)果

2.4 膠體金標(biāo)記抗體最佳pH值與檢測線（T線）包被濃度的確定

當(dāng)膠體金溶液pH值為7.5～8.5時(shí)為紅色，所以選擇pH 7.5再做細(xì)化實(shí)驗(yàn)，以確定標(biāo)記時(shí)的最佳pH值。pH值為8.1時(shí)膠體金溶液紅色保持最好。最終選擇標(biāo)記pH值為8.1。

當(dāng)抗體添加量大于等于15 μg/mL膠體金溶液時(shí)，膠體金溶液可以保持原有的透亮酒紅色。因此，15 μg即為穩(wěn)定1 mL膠體金溶液需要的最小蛋白量。實(shí)際標(biāo)記1 mL膠體金選擇為18 μg抗體量。檢測線多克隆抗體的噴涂濃度會影響T線顯色情況。當(dāng)多克隆抗體質(zhì)量濃度小于1 g/L時(shí)，加入不同質(zhì)量濃度梯度的宋內(nèi)氏志賀氏菌（108～105mL-1），T線顯色均隨多克隆抗體質(zhì)量濃度升高顯色加深。而質(zhì)量濃度大于1 g/L時(shí)，增大多克隆抗體噴涂濃度，肉眼下觀察T線顯色沒有明顯加深，結(jié)果如表4所示。因此本研究選擇兔多克隆抗體以1 g/L和1 μL/cm噴涂T線。

2.5 試紙條特異性檢測

將各測試菌株菌體稀釋至108mL-1，與試紙條反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)只與宋內(nèi)氏志賀氏菌ATCC 29930和福氏志賀氏菌ATCC 29903呈陽性反應(yīng)，其他細(xì)菌和稀釋液PBS均呈陰性反應(yīng)，如表5所示。

表4 檢測線條件優(yōu)化

表5 試紙條特異性檢測驗(yàn)證

2.6 試紙條靈敏度分析

用純培養(yǎng)的宋內(nèi)氏志賀氏菌用PBS稀釋至不同梯度測定試紙條靈敏度，加樣后3～15 min觀察結(jié)果，結(jié)果顯示，本研究制備的志賀氏菌膠體金快速檢測試紙條的靈敏度為105mL-1，如圖2所示。

圖2中，1為無菌PBS緩沖液；2為LB液體培養(yǎng)基；3～6為含104～107mL-1宋內(nèi)氏志賀氏菌的PBS緩沖液。

選取奶粉樣品中常見的阪崎腸桿菌和長雙歧桿菌混入5%的脫脂奶粉中，菌數(shù)調(diào)整為108mL-1，然后用于梯度稀釋宋內(nèi)氏志賀氏菌，加樣10～15 min后觀察結(jié)果，結(jié)果顯示在牛奶樣品中，相比對于菌體純培物的檢測靈敏度要低，靈敏度為106mL-1，結(jié)果如圖3所示。

圖3中，1為LB液體培養(yǎng)基；2為含雜菌（108mL-1阪崎腸桿菌和長雙歧桿菌）的奶粉樣本；3～6,含104～107mL-1宋內(nèi)氏志賀氏菌的奶粉樣本，同時(shí)含有108mL-1的阪崎腸桿菌和長雙歧桿菌。

3 討論

本文在制備了志賀氏菌單克隆抗體的基礎(chǔ)上，首次探討了志賀氏菌膠體金免疫試紙條在牛奶樣品中應(yīng)用的可能性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在奶粉樣品中的檢測靈敏度為106CFU/mL。

試紙條的靈敏度和特異性都與制備所用的兩種抗體有密切的關(guān)系，抗體的親和力、特異性以及抗原表位等都是影響試紙條品質(zhì)的重要因素。因?yàn)樗@得的單克隆抗體有較好的特異性，所以試紙條上的膠體金抗體對大多數(shù)的菌株不會結(jié)合顯色。盡管該單克隆抗體與腸致病性大腸桿菌CMCC 44496有一定的交叉反應(yīng)，但最后制備的試紙條表現(xiàn)出良好的特異性，并未出現(xiàn)對腸致病性大腸桿菌CMCC 44496的陽性反應(yīng)，這與在試紙條T線噴涂的兔多抗有關(guān)。所用的抗志賀氏菌兔多抗經(jīng)過免疫特異性逆向吸附，已除去了腸致病性大腸桿菌CMCC 44496的交叉抗體，故在T線上不能捕獲腸致病性大腸桿菌CMCC 44496，所以最終試紙條上呈現(xiàn)陰性。如果想進(jìn)一步提高試紙條的靈敏度可以從制備更好的抗體著手。

為了配合試紙條的應(yīng)用，我們在融合細(xì)胞篩選過程中，選用活的志賀氏菌進(jìn)行篩選，這樣就可得到結(jié)合自然狀態(tài)菌體表面的單克隆抗體，符合致病菌現(xiàn)場篩查的要求?，F(xiàn)階段對志賀氏菌檢測一般都需要經(jīng)過增菌步驟，有時(shí)還應(yīng)用選擇性培養(yǎng)基，本文制備的試紙條檢測純培養(yǎng)的志賀氏菌，靈敏度達(dá)到105mL-1，也能直接用于混有雜菌的牛奶樣品中。鑒于目前實(shí)驗(yàn)室條件有限，還需獲得更多的志賀氏菌用于進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的通用性。此外我們在市面上購買的所有奶粉樣本都未發(fā)現(xiàn)有志賀氏菌的污染，所以我們用人工添加的志賀氏菌牛奶樣本替代實(shí)際陽性樣本進(jìn)行檢測。阪崎腸桿菌是嬰幼兒奶粉中的常見污染菌，而長雙歧桿菌又通常作為提高營養(yǎng)利用率的添加菌，故我們選取這兩種菌作為雜菌添加到牛奶樣品中，用于試紙條的檢驗(yàn)。結(jié)果表明，不論雜菌，還是食品基質(zhì)都不會干擾試紙條對志賀氏菌的特異性檢測，結(jié)合試紙條在3～15 min內(nèi)就可以快速完成檢測的優(yōu)點(diǎn)，說明試紙條比酶聯(lián)免疫技術(shù)、放射免疫技術(shù)以及PCR技術(shù)有更廣泛的適用范圍，尤其是在基層和現(xiàn)場檢測方面有著無可比擬的優(yōu)點(diǎn)。

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Development of colloidal gold based immunochromatographic strip test for detection of Shigella spp.in milk

XU Feng2,WU Xiao-li3,XU Di1,MING Xing1,WEI Hua1,2,LI Peng1,2
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047，China；2.Jiangxi-OAI Joint Research Institute,Nanchang 330047，China;3 Basic Medical College，Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330004,China)

Monoclonal antibody againstShigellaspp.was produced in Balb/c mice using ultrasonicatedShigella sonneiand S.flexneri as immunogen.Indirect ELISA was employed for screening of monoclonal antibodies from fusion cells(spleen cells from Balb/c mice fused with myeloma cells).Four stable anti-Shigellaspp.monoclonal antibody producing hybridoma cell lines were screened out and one of which was labeled with colloidal gold for following studies.Polyclonal antibody againstShigellaspp.(rabbit source)and donkey-anti-mouse antibody were sprayed on the nitrocellulose membrane in line as test(T)and control(C)lines,respectively.The colloidal gold based immunochromatographic test strips for detection ofShigellaspp.were fabricated and tested with bacteria pure culture for their sensitivity and specificity.Results showed that the sensitivity of the strip was 105CFU/mL,and the test strip was specific to 2 Shigella strains with no cross reactivity with other 23 selected bacteria strains.The sensitivity of Shigella test strips was 106CFU/mL inEnterobacter sakazakiiandBifidobacterium longumspiking milk samples.The established colloidal gold based immunochromatographic strip test method is important for rapid and simple screening of Shigella spp.in food samples.

Shigella sonnei；Shigella flexneri；immunochromatographic strip；detection method

TS252.7

A

1001-2230（2012）05-0046-05

2011-12-30

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31000048）；（31170091）；（30900038）；江西省國際科技合作項(xiàng)目計(jì)劃（2010EHA02200）。

徐鋒（1977-），男，博士，從事益生菌的分子生物學(xué)研究。

黎鵬