蘇鐵珊瑚根結(jié)構(gòu)觀察及其內(nèi)生放線菌分離

曹 妍 ，伍建榕

蘇鐵珊瑚根結(jié)構(gòu)觀察及其內(nèi)生放線菌分離

曹 妍1，伍建榕2

(1.西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院 云南省高校森林災(zāi)害預(yù)警控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2.國(guó)家林業(yè)局 西南地區(qū)生物多樣性保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224）

蘇鐵類(lèi)是現(xiàn)存最原始的裸子植物類(lèi)群，被認(rèn)為是活化石。為了探究清蘇鐵珊瑚根的結(jié)構(gòu)和內(nèi)生放線菌的多樣性，本研究采用石蠟切片法對(duì)蘇鐵珊瑚根進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)觀察，用改良的TWYE（M1）、高氏1號(hào) (M2)和甘油—天冬酰胺（M3）培養(yǎng)基對(duì)珊瑚根的內(nèi)生放線菌進(jìn)行分離，并通過(guò)16S rRNA系列分析鑒定其種屬。結(jié)果表明：蘇鐵珊瑚根由周皮、外部皮層、藻胞層、內(nèi)部皮層和維管柱組成；外部皮層和內(nèi)部皮層細(xì)胞在橫切面上呈圓形，而且在有的細(xì)胞中能看到被染成暗紅色的菌絲團(tuán)的存在；利用以上三種培養(yǎng)基從蘇鐵珊瑚根中共分離到了13株放線菌，隸屬于鏈霉菌屬和擬諾卡氏菌屬。

蘇鐵；珊瑚根；內(nèi)生放線菌；分離;16S rRNA

蘇鐵Cycas revoluta又名鐵樹(shù)，為蘇鐵科Cycadaceae蘇鐵屬Cycas植物。蘇鐵被譽(yù)為植物界的“大熊貓”和“活化石”，為我國(guó)一級(jí)保護(hù)植物[1]。蘇鐵類(lèi)植物全世界僅有蘇鐵目，現(xiàn)存有3個(gè)科，即蘇鐵科Cycadaceae、蕨鐵科Stangeriaceae和澤米鐵科Zamiaceae，11屬，約280多種[2]。我國(guó)蘇鐵僅有1科1屬，自然分布的蘇鐵屬植物約38種，約占世界蘇鐵屬植物總數(shù)的30%左右[3]。

蘇鐵除具有正常根和肉質(zhì)根以外還發(fā)現(xiàn)有珊瑚狀根。珊瑚根是蘇鐵類(lèi)植物的一類(lèi)背地性生長(zhǎng)的、重復(fù)二叉分枝的根叢，可暴露于土壤表面，形似珊瑚，因此得名[4]。蘇鐵珊瑚根結(jié)構(gòu)與形成一直存在爭(zhēng)議，藍(lán)細(xì)菌的侵入是否必要成為爭(zhēng)議的熱點(diǎn)。而珊瑚根的形成是否與內(nèi)生菌有關(guān)，這方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。植物內(nèi)生菌(endophyte)是一類(lèi)生活史有部分或整個(gè)一生都在健康植物組織細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間生活，并且不會(huì)造成明顯的致病癥狀的微生物，包括細(xì)菌、放線菌、真菌[5]。由于內(nèi)生放線菌生長(zhǎng)緩慢，分離比較困難，相比內(nèi)生真菌和細(xì)菌研究較少。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生放線菌宿主范圍廣，種類(lèi)豐富，是放線菌資源的一個(gè)重要來(lái)源。蘇鐵為古老的孑遺植物，其研究重點(diǎn)一直是系統(tǒng)進(jìn)化，而其內(nèi)生菌的多樣性尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究旨在從蘇鐵珊瑚根結(jié)構(gòu)觀察及內(nèi)生放線菌的分離出發(fā)，探究清楚其結(jié)構(gòu)和其中的微生物宿住情況及內(nèi)生放線菌的多樣性，從而為促進(jìn)蘇鐵快速繁育和生長(zhǎng)提供基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料采自昆明市金殿森林保護(hù)區(qū)，該處土壤酥松，為紅壤土，蘇鐵珊瑚根生長(zhǎng)旺盛，大多在地表下2～5cm處或裸露于地表。2011年4月在此處采集珊瑚根，放于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，用自來(lái)水將泥土沖洗干凈，備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蘇鐵珊瑚根顯微結(jié)構(gòu)觀察——石蠟切片法

將珊瑚根切成約0.5 cm的小段，用FAA固定液固定24小時(shí)以上。固定好的材料經(jīng)叔丁醇從低濃度到高濃度系列脫水，石蠟包埋，旋轉(zhuǎn)切片機(jī)連續(xù)切片，厚度8 μm。切片干燥后用番紅固綠對(duì)染，再用中性膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察并照相。材料經(jīng)番紅固綠染色后，木質(zhì)、角質(zhì)、細(xì)胞核等為紅色，薄壁細(xì)胞為綠色。

1.2.2 蘇鐵珊瑚根內(nèi)生放線菌的分離

(1) 材料的消毒 將材料在流水下沖洗干凈后，用刀片將二叉狀根切開(kāi)，在無(wú)菌操作臺(tái)中先用75%的酒精對(duì)其處理30～60 s，無(wú)菌水清洗3次；0.1%的升汞消毒5 min，無(wú)菌水清洗3次。

(2) 放線菌的分離 將材料放進(jìn)1.5 mL的滅菌離心管中，加入0.5 mL的無(wú)菌水，用杵棒將其搗碎，靜置10 min后吸取0.2 mL菌懸液分別涂布在改良的TWYE（M1）、高氏1號(hào)培養(yǎng)基(M2)、甘油—天冬酰胺培養(yǎng)基（M3）上，即分別在3種培養(yǎng)基中添加100 mg/L的重鉻酸鉀，28 ℃恒溫培養(yǎng)。約3周后，根據(jù)平板上長(zhǎng)出菌落的形態(tài)、顏色、大小等挑取不同的菌落進(jìn)行純化。

(3) 消毒方法有效性的檢測(cè) 吸取最后一次清洗過(guò)材料的水0.2 mL涂布在培養(yǎng)基上作為對(duì)照，將平板于28 ℃培養(yǎng)3周以上，觀察是否有菌落長(zhǎng)出。以此方法來(lái)檢測(cè)此消毒方法是否將蘇鐵珊瑚根表面消毒干凈。

1.2.3 蘇鐵珊瑚根內(nèi)生放線菌的鑒定

用SDS法[6]對(duì)分離到的放線菌進(jìn)行DNA提 取， 然 后 用 引 物: Primer A:5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’；Primer B:5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’(北 京 三 博 公司合成)對(duì)16S rRNA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性1 min，54℃退火1 min，72℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物5 μL于1%瓊脂糖凝膠電泳(電壓100 V)30 min，放置于凝膠成像系統(tǒng)中檢測(cè)照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘇鐵珊瑚根的外部形態(tài)觀察

蘇鐵珊瑚根生長(zhǎng)于尚未木質(zhì)化的幼根組織上，大多產(chǎn)生于生產(chǎn)側(cè)根的部位。觀察培養(yǎng)出的幼苗發(fā)現(xiàn)，珊瑚根瘤瓣在向外突出根的表皮時(shí)往往不是一個(gè)瘤瓣，而是多個(gè)瘤瓣同時(shí)突出根的表皮，呈簇狀生長(zhǎng)。這時(shí)的珊瑚根顏色還是同其著生部位的根的顏色完全一致，呈乳白色。隨著瘤瓣的生長(zhǎng)，不斷進(jìn)行二叉分枝，最終形成多分枝的球形珊瑚狀瘤簇，大多在地表下2～5cm處或裸露于地表（見(jiàn)圖1）。形成的瘤簇直徑可達(dá)2～3 cm以上。成熟的蘇鐵珊瑚根由于藍(lán)細(xì)菌的入侵而使得表面呈藍(lán)綠色，老的周皮上具明顯的皮孔，每個(gè)二叉狀分支長(zhǎng)約1 cm，直徑約0.15～0.2 cm（見(jiàn)圖2）。

2.2 蘇鐵珊瑚根顯微結(jié)構(gòu)觀察

圖1 蘇鐵珊瑚根Fig.1 The cycad coralloid roots

圖2 蘇鐵珊瑚根(皮孔和長(zhǎng)度) Lc =lenticelFig.2 The cycad coralloid root (lenticel and length)Lc =lenticel

蘇鐵珊瑚根橫切面呈近橢圓形，由周皮、外部皮層、藻胞層、內(nèi)部皮層和維管柱組成（見(jiàn)圖3）。藻胞層的細(xì)胞多為徑向延長(zhǎng)的大細(xì)胞，排列緊密，整個(gè)藻胞層被番紅和固綠染成了鮮紅色，這是由于大量的藍(lán)細(xì)菌宿住在此區(qū)域。根橫切面中空而無(wú)法看到完整的維管柱。外部皮層和內(nèi)部皮層薄壁細(xì)胞在橫切面上呈近圓形，而且在有的細(xì)胞中能看到被染成暗紅色的菌絲團(tuán)的存在。在縱切面上同樣可以看到在內(nèi)外皮層有的細(xì)胞中存在被染成暗紅色的菌絲團(tuán)，菌絲團(tuán)大小不一。（見(jiàn)圖3、4）。

2.3 蘇鐵珊瑚根內(nèi)生放線菌的分離和鑒定結(jié)果

利用M1、M2和M3 3種培養(yǎng)基從蘇鐵珊瑚根共分離到13株菌。用SDS法[6]提取總DNA，提取的總DNA在19 kb以上。對(duì)提取的DNA進(jìn)行純化后，用PA和PB引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，擴(kuò)增出的片段大小約為1 500 bp。將PCR產(chǎn)物送北京三博公司測(cè)序。測(cè)得16S rRNA用DNAMAN軟件拼接后，用Eztaxon Server 2.1進(jìn)行序列比對(duì)，在GenBank上找到同源序列，各菌株與近源菌相似性見(jiàn)表1。再用Mega 4.0軟件中的Neighbor-Joining法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析（見(jiàn)圖5）。根據(jù)16S rRNA序列相似性達(dá)到98%以上的認(rèn)為是一個(gè)種，達(dá)97%以上則認(rèn)為是同一個(gè)屬[7]，若序列相似性小于96%～97%的可以認(rèn)為不是同一個(gè)種，小于93%～95% 的可以認(rèn)為不是同一個(gè)屬[8]的劃分，可以得出這13株菌屬于鏈霉菌菌屬Streptomyces和擬諾卡氏菌屬Nocardiopsis。

圖3 蘇鐵珊瑚根的橫切面結(jié)構(gòu)Fig. 3 The cross section structure of coralloid root in Cycas

圖4 蘇鐵珊瑚的縱切面結(jié)構(gòu)Fig.4 The longitudinal section of coralloid Root in Cycas

3 討 論

3.1 蘇鐵珊瑚根顯微結(jié)構(gòu)

蘇鐵珊瑚根由周皮、外部皮層、藻胞層、內(nèi)部皮層和維管柱組成。外部皮層和內(nèi)部皮層在橫切面上呈圓形。藻胞層的細(xì)胞多為徑向延長(zhǎng)的大細(xì)胞，排列緊密。這些結(jié)構(gòu)特征都與蘇建英等[4]報(bào)道的相一致。艾素云[9]等對(duì)珊瑚根進(jìn)行了解剖學(xué)研究，探究了其結(jié)構(gòu)和發(fā)育起源，但沒(méi)有報(bào)道除藍(lán)細(xì)菌外的其它微生物宿住其中的現(xiàn)象。本研究通過(guò)石蠟切片法對(duì)蘇鐵珊瑚根結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，在皮層細(xì)胞中有被番紅染成暗紅的菌絲團(tuán)的存在且大小不一。菌絲團(tuán)可能是菌絲纏繞著細(xì)胞核生長(zhǎng)形成的。而這些菌絲團(tuán)是否為真菌或放線菌還有待于進(jìn)一步的研究。2004年，Jack B. Fisher等[10]報(bào)道Zamia pumila根中存在著真菌，并觀察到了叢枝。但這與本研究在蘇鐵珊瑚根中看到的菌絲團(tuán)又存在一定的差異。因此，我們推測(cè)蘇鐵珊瑚根中菌絲團(tuán)的形成很可能是內(nèi)生放線菌侵染形成的。

表1 蘇鐵珊瑚根中可培養(yǎng)內(nèi)生放線菌16S rRNA系列分析結(jié)果Table 1 16S rRNA sequence analysis results of cultivable endophytes actinomycetes in cycad coralloid root

圖5 根據(jù)16S rRNA基因系列構(gòu)建部分菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 5 Neighbor-joining phylogenetic tree based on almost-complete 16S rRNA gene sequences

3.2 蘇鐵珊瑚根內(nèi)生放線菌

本研究分離到的13株菌中11株為鏈霉菌屬Streptomyces，占總數(shù)的84.6%，說(shuō)明蘇鐵珊瑚根內(nèi)生放線菌的優(yōu)勢(shì)種群是鏈霉菌。這與已有的報(bào)道大多數(shù)的內(nèi)生放線菌大部分都是鏈霉菌屬[11-12]相符。利用M1和M2均分離到了兩屬，而M3只分離到一屬，說(shuō)明M1和M2對(duì)分離蘇鐵珊瑚根內(nèi)生放線菌優(yōu)于M3。但3種培養(yǎng)基分離到的種屬都比較單一，可能是蘇鐵珊瑚根中可培養(yǎng)內(nèi)生放線菌種類(lèi)較少，有待于用不同方法對(duì)其進(jìn)行分離。

放線菌生長(zhǎng)緩慢，往往由于真菌和細(xì)菌的干擾而無(wú)法成功分離到。要成功分離到放線菌，必須在培養(yǎng)基中加入一些能抑制真菌和細(xì)菌的生長(zhǎng)但又不影響放線菌生長(zhǎng)的抑制劑。本研究選取了高效又便宜的抑制劑重鉻酸鉀，當(dāng)在養(yǎng)基中加入100 mg/L的重鉻酸鉀時(shí)，能夠有效的抑制真菌和細(xì)菌的生長(zhǎng)，這與徐麗華等[13]的報(bào)道相一致。

另外，植物材料的預(yù)處理對(duì)于內(nèi)生菌的分離也至關(guān)重要。本研究是直接采用的新鮮植物材料進(jìn)行分離，效果不是很理想，分離到的種屬較少，要分離到盡可能多的內(nèi)生放線菌可能還要采取不同的預(yù)處理方法。

弗蘭克氏菌屬Frankia是最早被發(fā)現(xiàn)的能在非豆科植物根部形成根瘤并具有固氮能力的內(nèi)生放線菌。而放線菌在蘇鐵中具有什么樣的作用，以及其侵染途徑和機(jī)制目前還不清楚。曹理想[14]等認(rèn)為內(nèi)生鏈霉菌不僅可促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高作物產(chǎn)量、而且可以增加植物對(duì)病原菌的抗性。筆者在野外調(diào)查時(shí)也發(fā)現(xiàn)具有珊瑚根的植株比沒(méi)有珊瑚根植株要生長(zhǎng)旺盛并且病蟲(chóng)害侵染相對(duì)較少，但蘇鐵珊瑚根中的內(nèi)生鏈霉菌是否也能夠促進(jìn)蘇鐵的生長(zhǎng)和增強(qiáng)蘇鐵對(duì)病原物的抗性還有待證實(shí)。

[1] 國(guó)家林業(yè)局、農(nóng)業(yè)部令（1999）第4號(hào), 《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄（第一批）》, 1999.

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Structural observations of Cycas revolute coralloid root and disassociation of endophytic actinomycetes

CAO Yan1, WU Jian-rong2
(1. Key Lab. of Forest Disaster and Warning Control of Yunnan Province University, College of Forestry, Southwest Forestry University,Kunming 650224, Yunnan, China; 2. Key Lab. of Biodiversity Conservation in Southwest China of State Forestry Administration,Kunming 650224, Yunnan, China)

Cycad is the most primitive extant gymnosperms, which is considered to be living fossil. In order to explore the structure and the endophytes actinomycetes of cycad coralloid root, the paraffin section was used to do the observation on microstructure; TWYE（M1）,Gao one (M2) and Glycerin – asparagine mediums were used to seprate the endophytic actinomycetes in the coralloid roots and through 16S rRNA sequence analysis, the Actinomycetes were identified. The results indicate that the periderm, outer cortex, cyanobacterial zone, internal cortex and vascular cylinder consisted of the cycad coralloid root; the cells of the external and internal cortex presented to be a circular form on the cross section, and pelotons that were stained to be red existed in some cells of them. 13 strains of actionmycetes were separated from the cycad coralloid root through the above three mediums, and they belong to streptomyces and nocardiopsis.

Cycas revoluta; coralloid root; endophytic actionomycetes; disassociation; 16S rRNA

S791.11;Q939

A

1673-923X(2012)11-0047-04

2012-10-10

國(guó)家“十一五”科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2008BAC39B05)；西南林業(yè)大學(xué)重點(diǎn)科研基金項(xiàng)目（BC2010FK01）；云南省重點(diǎn)學(xué)科森林保護(hù)學(xué)(XKZ200905)

曹 妍（1987-），女，江西吉安人，碩士研究生，研究方向：森林保護(hù)學(xué)與資源微生物利用；E-mail:caoyan_612@163.com

伍建榕(1963-)，女，福建人，教授，主要從事森林病理學(xué)及資源微生物利用研究；E-mail: wujianrong63@Yahoo.com.cn

[本文編校：吳 毅]