樟子松愈傷誘導(dǎo)及植株再生的初步研究

張文泉，閆 偉

樟子松愈傷誘導(dǎo)及植株再生的初步研究

張文泉，閆 偉

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019）

以樟子松成熟胚為外植體，研究不同生長調(diào)節(jié)劑組合對樟子松愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響，并獲得了完整的再生植株。結(jié)果表明：誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基組合為MS+1.5 mg/L 2,4-D +0.5 mg/L 6-BA，愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基組合為MS+ 0.2 mg/L IAA +1.5 mg/L 6-BA，樟子松不定芽伸長生長的適宜基本培養(yǎng)基為1/2MS＋0.1%活性炭，誘導(dǎo)生根的最佳培養(yǎng)基組合為1/4MS+0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA。

樟子松；組織培養(yǎng)；植株再生

樟子松Pinus sylvestris var. mongolica Litv.是松科松屬高大常綠喬木樹種，是歐洲赤松的一個(gè)地理變種，其材質(zhì)良好，防風(fēng)固沙作用顯著，具有抗寒、抗旱、耐貧瘠、適應(yīng)性強(qiáng)且較速生等特點(diǎn)，是我國北方主要造林和防風(fēng)固沙樹種。但樟子松結(jié)實(shí)間隔期長，籽?？瞻T率高，種子不能很快滿足生產(chǎn)上的需要[1]，組織培養(yǎng)作為一項(xiàng)生物技術(shù)為快速繁殖松屬樹種提供了一條有效的途徑。當(dāng)前國內(nèi)對樟子松離體培養(yǎng)雖有研究，但至今未有對其愈傷誘導(dǎo)途徑的報(bào)道，因此，對樟子松愈傷誘導(dǎo)及植株再生研究具有一定的理論和實(shí)踐意義[2-8]。本研究以樟子松成熟胚為外植體, 誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織后, 愈傷組織分化獲得到再生植株, 建立了植株再生體系。

1 材料與方法

供試材料種子采自內(nèi)蒙古自治區(qū)呼倫貝爾市鄂溫克族自治旗紅花爾基樟子松國家森林公園。

1.1 供試外植體

供試材料為樟子松成熟胚。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料消毒

精選的種子用 30℃左右溫水浸泡 24 h，0.5 %KMnO4溶液消毒 10～20 min，在超凈工作臺上剝?nèi)ネ鈿?，無菌水沖洗干凈后，用75%酒精表面消毒 1 min，無菌水沖洗 2 次，之后再用 10%的NaClO 溶液消毒 20 min，無菌水沖洗 5～6 次，用無菌濾紙吸去表面水分。于無菌條件下用細(xì)鑷子剝?nèi)ヅ呷?取出成熟種胚用于接種。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)

將成熟種胚接種到以 1/2MS 為基本培養(yǎng)基，附加 20 g/L 的蔗糖、8 g /L 的瓊脂、不同質(zhì)量濃度的2,4-D(0.5,1.5,2.5 mg/L)與 6-BA(0.5 ,1.0 ,1.5 mg/L)組合，NAA（0.5 ,1.0 mg/L）與 6-BA(0.5 ,1.0 ,1.5 mg/L)組合，pH值調(diào)至 5.8 的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織。黑暗處理 15 d 后，轉(zhuǎn)移至光強(qiáng)為1 500 Lx 的光照條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為16 h/d，培養(yǎng)溫度為 (25±1) ℃。每處理接種 32個(gè)外植體。20 d 后觀察統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.3 愈傷組織的分化

將獲得的愈傷組織轉(zhuǎn)移至 1/2MS 為基本培養(yǎng)基，附加 20 g/L 的蔗糖、8 g /L的瓊脂、不同質(zhì)量濃度的 6-BA(0.5,1.0,1.5,2.0 mg/L)與 IBA（0.2,0.5 mg/L）組合培養(yǎng)基上，pH 值調(diào)至 5.8，誘導(dǎo)不定芽，35 d 后統(tǒng)計(jì)愈傷組織分化情況及平均芽數(shù)。

不定芽誘導(dǎo)率=(產(chǎn)生不定芽的愈傷組織數(shù)/接種愈傷組織數(shù)總數(shù))×100 %;

平均不定芽數(shù)＝不定芽總數(shù)/被誘導(dǎo)的胚數(shù)。

1.2.4 芽的伸長

將獲得的不定芽接入伸長培養(yǎng)基中，芽伸長采用 1/2MS 為基本培養(yǎng)基，附加20 g/L 的蔗糖，8/L 的瓊脂，添加不同質(zhì)量濃度的活性炭 (0，0.03，0.05 ，0.1，0.15 ，0.2 mg/L)的培養(yǎng)基，pH值調(diào)至 5.8，不加任何激素。選擇合適的活性炭質(zhì)量濃度。

1.2.5 不定根的誘導(dǎo)

將高 1 cm 左右的芽接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行根的誘導(dǎo)。生根培養(yǎng)基以1/2MS、1/4MS 為基本培養(yǎng)基, 附加 20 g/L 的蔗糖、8 g/L 的瓊脂，添加不同質(zhì)量濃度的萘乙酸(NAA)和吲哚乙酸(IBA),40 d 后統(tǒng)計(jì)生根情況。

不定根誘導(dǎo)率=(產(chǎn)生不定根的芽數(shù)/接種芽總數(shù))×100 %。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)和外植體選擇

以樟子松成熟胚作為外植體，7 d后成熟胚均有愈傷組織產(chǎn)生，成熟胚膨大,葉面卷曲,開始出現(xiàn)肉眼可見的愈傷組織。樟子松成熟胚形成的愈傷組織從形態(tài)上可分為兩種類型：一種是淡黃色、光滑致密、球狀突起的愈傷組織，后轉(zhuǎn)為綠白色（見圖1）；另一種是形成了不規(guī)則的黃白色，質(zhì)地較為疏松的愈傷組織（見圖2）。從愈傷組織誘導(dǎo)正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析 (見表1) 表明, 愈傷誘導(dǎo)過程中細(xì)胞生長素2，4-D與NAA比較，2，4-D較優(yōu)于NAA。從表1可以看出,不同實(shí)驗(yàn)中的誘導(dǎo)結(jié)果有很大差異,其中水平組合為第2組實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)率為91.6 %。

本試驗(yàn)篩選樟子松愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+ 1.5 mg/L 2,4-D +0.5 mg/L 6-BA。

圖1 成熟胚形成的愈傷1Fig.1 Foraminate callus in mature embryo 1

圖2 成熟胚形成的愈傷2Fig.2 Foraminate callus in mature embryo 2

2.2 愈傷組織的分化

愈傷組織接入分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，光照培養(yǎng)15 d左右，已經(jīng)出現(xiàn)了分化的跡象。繼續(xù)培養(yǎng)20 d后，部分愈傷組織上形成綠色的芽點(diǎn)，芽點(diǎn)進(jìn)一步發(fā)育35 d左右，形成不定芽或芽叢。每塊愈傷組織上不定芽的數(shù)量多少不等，有的僅形成1個(gè)不定芽，最多的可達(dá)7個(gè)（見圖3）。其中不同質(zhì)量濃度的激素對愈傷組織的分化存在較大差異（見表2），當(dāng)6-BA為1.5 mg/L、IAA為0.2 mg/L時(shí)，出芽率最高。因此，本試驗(yàn)中樟子松愈傷組織分化的培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg/L +IAA 0.2 mg/L。

表1 外植體在不同激素質(zhì)量濃度的 MS 培養(yǎng)基上愈傷形成率?Table 1 Effects of different hormone and different concentration of hormone in MS medium on inductivity of callus

圖3 形成多個(gè)不定芽Fig.3 Adventitious bud in vitro shoot

表2 不同質(zhì)量濃度的激素組合對愈傷組織分化的影響Table 2 Effects of different hormone and different concentration on callus differentiation

2.3 芽的伸長

大量組織培養(yǎng)試驗(yàn)證明活性炭對芽的伸長生長具有一定的促進(jìn)作用，本試驗(yàn)結(jié)果（見圖4）表明，活性炭的加入對樟子松不定芽的生長與伸長具有一定的促進(jìn)作用，不同濃度活性炭的加入對芽伸長存在顯著性差異，當(dāng)加入的活性炭濃度為0.1%時(shí)，最有利于叢生芽苗的伸長生長，當(dāng)活性炭濃度高于這個(gè)值后芽的伸長生長開始受到抑制，這可能是由于活性炭在吸附有害物質(zhì)的同時(shí)也吸附了礦質(zhì)元素。因此，在樟子松叢生芽的伸長生長過程中，加入0.1%的活性炭較為適宜（見圖5）。

圖4 芽的伸長生長Fig.4 Elongation growth of bud

圖5 活性炭對不定芽伸長生長的影響Fig.5 Influence of activated charcoal on growth of adventitious buds

2.4 不定根的誘導(dǎo)

將高1 cm左右的芽接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行根的誘導(dǎo)，1周后觀察到部分無根幼苗莖基部有愈傷組織產(chǎn)生，隨后形成不定根，2周后即可獲得完整的再生植株(見圖6，7)，4周時(shí)，根長可達(dá)1.5 cm左右。不定根誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果（見表3）表明：培養(yǎng)基中大量元素質(zhì)量濃度對樟子松芽的生根具一定的影響,降低培養(yǎng)基中的大量元素質(zhì)量濃度有利于樟子松不定芽的生根,1/4MS培養(yǎng)基對樟子松不定芽生根最為有效,在以1/4MS為培養(yǎng)基且不加任何激素的情況下,培養(yǎng)一段時(shí)間偶爾有不定根產(chǎn)生。培養(yǎng)基中單獨(dú)加入生長素可明顯提高不定芽的生根率，NAA的效果比IBA好,在含有NAA的1/4MS生根培養(yǎng)基中同時(shí)加入低質(zhì)量濃度的IBA對樟子松不定根的誘導(dǎo)有明顯的促進(jìn)作用，生根率達(dá)60 %。

圖6 根系誘導(dǎo)Fig.6 Roots induced

圖7 完整的再生植株Fig.7 Complete regeneration plant

表3 不同培養(yǎng)基和 NAA、IBA 對不定根誘導(dǎo)的影響Table 3 Effects of different media with different NAA and IBA on adventitious root inductions

3 討 論

植物形成愈傷組織后，再分化形成完整植株,在離體植物快繁中是普遍存在的現(xiàn)象[9-11]。關(guān)于樟子松通過此途徑獲得再生植株的研究，國內(nèi)外尚未見報(bào)道, 本試驗(yàn)研究表明，利用樟子松成熟胚作為外植體，通過脫分化形成愈傷組織，再分化形成不定芽而產(chǎn)生再生植株。

其中培養(yǎng)基配方正確與否直接影響著外植體的脫分化與再分化[12]，特別是各種誘導(dǎo)培養(yǎng)基和8 種不同的愈傷組織分化培養(yǎng)基。激素的調(diào)配也尤為重要，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了15種不同的誘導(dǎo)愈傷組織的激素組合，其中以 2,4-D 1.5 mg/L 和 6-BA 0.5 mg/L 培養(yǎng)基的愈傷組織形成率較高, 而且在愈傷誘導(dǎo)過程中，2,4-D 對樟子松的影響大于 NAA，6-BA 為 1.0 mg/L、IAA 為 0.2 mg/L 時(shí)，出芽率最高，且與其它培養(yǎng)基存在顯著差異，明顯表現(xiàn)出激素組合的優(yōu)勢。

為了使增殖后的芽苗進(jìn)一步伸長生長，可利用去掉植物激素，降低礦質(zhì)鹽、維生素及蔗糖等方法[13]，附加吸附物質(zhì)如活性炭，對芽的生長也有促進(jìn)作用[14]。

本研究表明，在以 1/2MS 為基本培養(yǎng)基，去掉植物激素的情況下，附加 0.1%的活性炭對樟子松不定芽的伸長生長起到良好的促進(jìn)作用，這也許與活性炭在一定程度上吸附了不定芽在生長過程中代謝出的有害物質(zhì)有關(guān)，與齊力旺等[15]對油松封頂芽的組織培養(yǎng)，鄭均寶等[16]對油松離體胚子葉的組織分化和無根試管苗，闕國寧等[17]對火炬松、濕地松、晚松組培繁殖的研究結(jié)果一致。

針葉樹組織培養(yǎng)中誘導(dǎo)生根往往比較困難，生根率低嚴(yán)重制約著針葉樹的離體快速繁殖。促進(jìn)針葉樹生根的方法通常有：降低培養(yǎng)基無機(jī)鹽的質(zhì)量濃度、降低蔗糖的質(zhì)量濃度、加入不同種類和配比的激素、培養(yǎng)基中加入活性炭、誘導(dǎo)前期用激素進(jìn)行刺激、試管外生根等[18-24]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，基本培養(yǎng)基、生長素種類和質(zhì)量濃度等對樟子松不定芽生根有較大影響。培養(yǎng)基中大量元素含量減半（由1/2MS降到1/4MS）有利于樟子松不定根的誘導(dǎo)，1/4 MS培養(yǎng)基對誘導(dǎo)樟子松不定芽生根效果較好，在不含生長素的情況下偶爾有不定根產(chǎn)生，這與Thorpe總結(jié)針葉樹中再生植株形成過程中芽生根的結(jié)論一致。

[1] 康 明，田建強(qiáng)，鄭均寶.樟子松成熟胚的離體培養(yǎng)與不定芽的形成[J].河北林學(xué)院學(xué)報(bào)，1993，8(4)：273-276.

[2] 彭麗萍，董麗芬．樟子松組織培養(yǎng)不定根誘導(dǎo)的研究[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2008 ，23(1)：100-103.

[3] Mathur G, Nadgauda R. In vitro plantlet regeneration from mature zygotic embryos of Pinus wallichiana[J]. Plant Cell Reports，1999，19：74-80.

[4] Gonzzalez M V, Rey M, Tavazza R. In vitro adventitious shoot formation on cotyledons of Pinus pinea[J]. Hort Science, 1998,33 ：4，749-750.

[5] Druart P, Wulf O D. Activated charcoal catalses sucrose hydrolysis during autoclaving[J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture，1991，32(1)： 97．

[6] Jang J C, Tainter F H. Microp ropagation of shortleaf， Virginia and loblolly×shortleaf pine hybrids viaorganogenesis[J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture，1991，25 (1)： 61-67．

[7] Saborio F, Dvorak W, Donahue J, et al. In vitro regeneration of plantlets from mature embryos of Pinus ayacahuite[J]. Tree Physiology， 1997(17) ： 787-796.

[8] Niemi K, Scagel C, Hêggman H. Application of ectomycorrhizal fungi in vegetative propagation of conifers[J].Plant Cell,Tissueand Organ Culture，2004，78：83-91.

[9] 郝玉華．我國植物組織培養(yǎng)的發(fā)展現(xiàn)狀與前景展望[J] ．江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，(4)：20-23.

[10] 張建瑛，楊 玲．薔薇科植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生及影響因素研究進(jìn)展[J] ．生物技術(shù)通報(bào)，2007，3：35-38.

[11] 王雪婧，羅建勛．林木體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究進(jìn)展[J] ．四川林業(yè)科技，2007，28(2)：24-28.

[12] 張法勇．木本植物組織器官發(fā)生植株再生研究進(jìn)展[J] ．河北林果研究，2005，20(3)：34-38.

[13] Haddock P G. Sapling sugar pine grown from excised mature embryos[J]. Jour Forestry，1994，52：434-437.

[14] Debergh P c, Zimmerman R h. Micro prpagation technology and application[M]. Netherlands:Kluwer Academic Publishers, 1991.

[15] 齊力旺，楊云龍.油松封頂芽的組織培養(yǎng)[J].植物生理學(xué)通訊，1995，31（1）：40-41．

[16] 鄭均寶，潘冬梅，陳正華.油松離體胚子葉的組織分化和無根試管苗的形成[J] .河北林學(xué)院學(xué)報(bào)，1994，9(2)：97-101.

[17] 闕國寧，房建軍，葛萬川，等.火炬松、濕地松、晚松組培繁殖的研究[J].林業(yè)科學(xué)研究，1997，10(3)：227-232．

[18] Druart P, Wulf O D. Activated charcoal catalses sucrose hydrolysis during autoclaving[J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture，1991，32(1) ：97．

[19] Saborio F, DvorakW, Donahue J, et al. In vitro regenerationof plant-lets from mature embryos of Pinus ayacahuite[J]. Tree Physiology, 1997(17)：787-796．

[20] 張守英，杜小光，李 玲.興安落葉松組織培養(yǎng)不定根誘導(dǎo)的研究[J].林業(yè)科技通訊，1993(5)：8-10．

[21] 王 虹，張金鳳.針葉樹組織培養(yǎng)繁殖技術(shù)研究進(jìn)展[J].河北林業(yè)科技，2004(4)：14-18．

[22] 彭麗萍，董麗芬．樟子松組織培養(yǎng)不定根的誘導(dǎo) [J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2008,28(1)：93-97．

[23] 石進(jìn)朝，陳蘭芬,王 晶，等.變?nèi)~金銀木組織培養(yǎng)研究 [J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2011,31(6)：116-121．

[24] 李永欣，王曉明,陳明皋，等.外源激素對美洲冬青組織培養(yǎng)的影響 [J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2010,30(1)：65-68．

Preliminary study on calliferous induction and plant regeneration of Pinus sylvestris var. mongolica Litv

ZHANG Wen-quan, YAN Wei
(Forestry College, Inner Mongolia Agricultural University, Huhhot 010019, Inner Mongolia Autonomous Region, China)

The effects of various combination of growth regulating agents on the callus induction and differentiation of mature embryo of Pinus sylvestris var. mongolica Litv were studied, and complete regeneration plant was established. The results indicate that the optimum medium for callus induction from leaves was MS+ 1.5 mg/L 2,4-D+0. 5 mg/L 6-BA; the optimum medium for callus differentiation was MS+ 0.2 mg/L IAA + 1.5 mg/L 6-BA; the best medium for increasing the height of cluster buds was 1/2MS+0.1% activated carbon and the adventitious root was induced on 1/4 MS++0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA.

Pinus sylvestris var. mongolica Litv；tissue culture；plant regeneration

S791.253; Q943.1

A

1673-923X(2012)11-0037-05

2012-05-20

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31060111）

張文泉（1984-），男，湖南婁底人，博士研究生，主要從事林木菌根生物技術(shù)方面的研究

閆 偉（1959-），男，內(nèi)蒙古呼和浩特人，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事林木菌根生物技術(shù)方面的研究；E-mail：weiyan @imau.edu.cn

[本文編校：謝榮秀]