甲醛對(duì)小鼠骨髓組織的毒性作用

柯玉潔,秦曉丹,李 蘭,張玉超,杜 娟,丁書(shū)茂 (華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430079)

甲醛是室內(nèi)主要的空氣污染物[1],世界衛(wèi)生組織已將甲醛歸類為人類致癌物 A1類.流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),甲醛污染可能與白血病發(fā)生有關(guān).骨髓組織是具有分化生成各種細(xì)胞的干細(xì)胞的能力動(dòng)物器官組織,這些干細(xì)胞通過(guò)分化能生成各種專職血細(xì)胞.因此,骨髓對(duì)于維持機(jī)體的生命和免疫力非常重要,任何對(duì)骨髓產(chǎn)生毒害作用的因素都有可能對(duì)動(dòng)物體的健康產(chǎn)生影響.Golden等[2]指出:甲醛作為潛在的人類白血病致病原,需要從多條路線上去求證其生物學(xué)合理性;其核心問(wèn)題是:吸入和食入的甲醛能夠轉(zhuǎn)運(yùn)到骨髓;到達(dá)骨髓的甲醛具有造血毒性.Zhang等[3]認(rèn)為甲醛致白血病可能有3個(gè)機(jī)制:①同其他致白血病原因一樣,直接破壞骨髓中的干細(xì)胞;②破壞外周血中的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞,進(jìn)而進(jìn)入骨髓,最終導(dǎo)致白血病;③破壞鼻黏膜等組織中的多功能干細(xì)胞,通過(guò)血液進(jìn)入骨髓,導(dǎo)致白血病的產(chǎn)生.因此,在甲醛和白血病相關(guān)性的研究中,骨髓組織就是一個(gè)非常重要的靶器官.本研究以氣態(tài)甲醛暴露為染毒方式,骨髓組織細(xì)胞為研究對(duì)象,從骨髓組織細(xì)胞分裂,DNA穩(wěn)定性,DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)(DPC)效應(yīng)和相關(guān)基因表達(dá)等方面展開(kāi)研究,探究甲醛暴露對(duì)骨髓細(xì)胞的毒性效應(yīng),以期對(duì)評(píng)估甲醛暴露是否能增加白血病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑及儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為5周齡純系SPF級(jí)雄性昆明小鼠,購(gòu)自湖北省預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心.

主要實(shí)驗(yàn)試劑:10%甲醛溶液(Sigma 公司);Hoechst 33258熒光染料(Sigma公司).

實(shí)驗(yàn)儀器:WH-2小型智能環(huán)境氣候艙(武漢市宇信科技開(kāi)發(fā)有限公司);4160-2型甲醛測(cè)定儀(Interscan公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 染毒 實(shí)驗(yàn)采用仿真式暴露染毒[4],將20只小鼠,隨機(jī)分為1個(gè)對(duì)照組和3個(gè)甲醛染毒組,每組 5只小鼠.染毒組在染毒缸中連續(xù)動(dòng)態(tài)染毒72h,甲醛經(jīng) WH-2型小型智能環(huán)境氣候艙調(diào)配后,持續(xù)穩(wěn)定地輸出濃度為0.5,1.0,3.0mg/m3的甲醛氣體.對(duì)照組為在相同條件下的玻璃缸中,吸入經(jīng)過(guò)濾的新鮮空氣(甲醛濃度＜0.01mg/m3).染毒期間,小鼠自由進(jìn)食和飲水.

1.2.2 制備骨髓細(xì)胞樣品 染毒結(jié)束后,頸椎脫臼處死小鼠,取出雙側(cè)股骨,制備骨髓細(xì)胞懸浮液后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),將細(xì)胞數(shù)量調(diào)節(jié)到106個(gè)/mL.

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定骨髓細(xì)胞的細(xì)胞周期 將固定好的骨髓細(xì)胞樣品處理后,上細(xì)胞流式儀,用488nm氬離子激光管,測(cè)前向、側(cè)向散色光和紅色熒光.數(shù)據(jù)記錄與分析.

1.2.4 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(RAPD)檢測(cè)骨髓細(xì)胞的DNA穩(wěn)定性 骨髓細(xì)胞的DNA基因組提取參照文獻(xiàn)[5]方法.按紫外吸收法用微孔板分光光度計(jì)的DNA Quant程序進(jìn)行含量測(cè)定,制備0.7%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果分析.

PCR反應(yīng)體系為(50μL),之后進(jìn)行RAPD程序流程.實(shí)驗(yàn)所用8個(gè)隨機(jī)引物如表1所示.

表1 RAPD的隨機(jī)引物Table 1 List of RAPD primers

1.2.5 DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)的檢測(cè). DPC采用KCI—SDS沉淀法進(jìn)行檢測(cè).計(jì)算DPC系數(shù)η,以此值表示DNA和蛋白質(zhì)的交聯(lián)程度.η計(jì)算公式為:

式中:DPC定量得先制作DNA濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1).

圖1 DNA濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of DNA concentration

1.2.6 RT-PCR 骨髓細(xì)胞RNA的提取:用Trizol法提取總RNA,提取的RNA應(yīng)該保存于-70℃冰箱中,或者立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,具體操作參照Yaghoobi等[6]的方法.實(shí)驗(yàn)所用引物序列如下:

隨后進(jìn)行 PCR,選用的目的基因?yàn)镃YP1B1和Nucleostemin,選用的內(nèi)參基因?yàn)棣?actin 2,前后分開(kāi)制膠.用凝膠成像系統(tǒng)照膠分析.數(shù)據(jù)用Origin 5.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)分析,并進(jìn)行t檢驗(yàn)和繪圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 甲醛暴露對(duì)骨髓組織細(xì)胞分裂周期的影響

由表2可見(jiàn),氣態(tài)甲醛動(dòng)態(tài)染毒對(duì)于SPF 級(jí)昆明種純系雄性小鼠的骨髓細(xì)胞細(xì)胞周期有明顯的影響作用, S期細(xì)胞含量明顯下降,而G2期細(xì)胞含量上升.對(duì)于 G1期的影響作用不顯著.S期是細(xì)胞DNA復(fù)制時(shí)期,可以推測(cè)甲醛暴露對(duì)于骨髓細(xì)胞DNA的復(fù)制過(guò)程有毒害作用;G2期的百分比回升,表明甲醛能抑制小鼠骨髓細(xì)胞進(jìn)入M期,而使大量細(xì)胞停滯于 G2期.結(jié)果表明:甲醛暴露對(duì)能影響小鼠骨髓細(xì)胞的分裂與分化,甲醛對(duì)骨髓細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生毒害作用.

表2 甲醛暴露對(duì)骨髓細(xì)胞分裂周期的影響Table2 Formaldehyde exposure on bone marrow cell division cycle

2.2 甲醛暴露對(duì)骨髓組織細(xì)胞中遺傳物質(zhì)DNA穩(wěn)定性的影響

圖2 骨髓基因組DNA的電泳圖譜Fig.2 Gel electrophoresis of bone marrow DNA

提取的小鼠骨髓細(xì)胞DNA.通過(guò)ND-1000核酸微量定量?jī)x檢測(cè)DNA濃度和純度,選擇OD260與OD280的比值在1.76～1.85的樣品進(jìn)行DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳(圖2).圖象呈現(xiàn)單一條帶,沒(méi)有拖尾現(xiàn)象,表明此方法提取純化得到的DNA具有很高純度.以此作為PCR擴(kuò)增模版.

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記技術(shù),是在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的,它是以細(xì)胞的DNA為模板,以一系列隨機(jī)排列的不同寡聚核苷酸單鏈為引物進(jìn)行擴(kuò)增.若相應(yīng)部位的基因組發(fā)生損傷,出現(xiàn)缺失、增加、移位等現(xiàn)象,就會(huì)使擴(kuò)增DNA片段發(fā)生變化[7].本研究中,小鼠染毒后,不同染毒濃度下基因組DNA的RAPD圖譜發(fā)生了明顯的變化.經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)(表3)發(fā)現(xiàn):甲醛處理后,0.5mg/m3染毒組多態(tài)性條帶最多,且更易導(dǎo)致新帶的產(chǎn)生;1.0mg/m3濃度組則有較多條帶消失;而3.0mg/m3濃度組條帶變化數(shù)目最多,且較易引起擴(kuò)增條帶強(qiáng)度的變化;由低濃度到高濃度,變化條帶數(shù)與甲醛升高而增多.甲醛的濃度與 RAPD圖譜的變化之間呈現(xiàn)良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系,說(shuō)明甲醛濃度越高對(duì)小鼠骨髓DNA的損傷越嚴(yán)重.

表3 隨機(jī)多態(tài)性擴(kuò)增結(jié)果Table 3 RAPD bands of control group and each concentration group

2.3 甲醛暴露引起的骨髓組織細(xì)胞DPC效應(yīng)

如圖3所示,隨著甲醛濃度的升高,小鼠骨髓細(xì)胞DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)系數(shù)逐漸升高,0.5mg/m3組與對(duì)照組存在顯著差異(P＜0.05),1.0、3.0mg/m3組與對(duì)照組存在極顯著差異(P＜0.01).表明在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),甲醛可顯著誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)物的形成.

圖3 不同濃度的氣態(tài)甲醛致DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)的變化Fig.3 DNA-protein crosslinks induced by different concentrations of gaseous formaldehyde

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,甲醛濃度與骨髓組織細(xì)胞中的DPC效應(yīng)呈現(xiàn)良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系,即甲醛濃度越高,骨髓細(xì)胞中的DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)程度越重.這與上述DNA穩(wěn)定性研究的結(jié)果一致.從而可以顯示甲醛對(duì)骨髓細(xì)胞造成損傷.

本研究的結(jié)果與Heck等[8]實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同,Heck等認(rèn)為吸入和食入的甲醛不能夠在體內(nèi)隨血液轉(zhuǎn)運(yùn),且甲醛暴露沒(méi)有造成骨髓組織細(xì)胞的遺傳毒性;對(duì)此本課題組分析如下:①為什么體內(nèi)甲醛濃度不隨外界甲醛濃度改變與改變.甲醛是內(nèi)源物質(zhì)之一,高濃度甲醛暴露,可能誘導(dǎo)甲醛脫氫酶的高效表達(dá),加快甲醛的降解.但降解的醛基并沒(méi)有全部直接氧化生成CO2和H2O,主要是基團(tuán)的轉(zhuǎn)移,即甲醛進(jìn)入體內(nèi)可能與其他生物分子結(jié)合,體內(nèi)游離甲醛量沒(méi)有變,因此體內(nèi)甲醛的含量不隨外界環(huán)境甲醛含量的變化而變化.②通過(guò)同位素標(biāo)記甲醛分子中的C和H,然后檢查骨髓組織中是否含有同位素標(biāo)記DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)量即DPC含量并不科學(xué).甲醛的還原性很強(qiáng),易與多種物質(zhì)結(jié)合,沒(méi)有特殊載體,不可能直接運(yùn)到骨髓,目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這樣的載體.檢查甲醛有沒(méi)有造成骨髓遺傳毒性,不能只檢測(cè)同位素標(biāo)記的DPC,生物體有許多基團(tuán)轉(zhuǎn)位酶和異構(gòu)酶,吸入的甲醛分子和最后造成毒性的分子不一定是同一被標(biāo)記的分子.在他們實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有檢測(cè)到同位素標(biāo)記的DPC,不等于甲醛暴露沒(méi)有造成骨髓組織中DPC的形成.

2.4 甲醛暴露對(duì)骨髓組織細(xì)胞分化關(guān)鍵因子的影響

本實(shí)驗(yàn)考察小鼠骨髓細(xì)胞中NS基因,CYP1B1基因的表達(dá)情況,其中NS基因,CYP1B1基因與選用的β-actin 2表達(dá)情況如圖4所示.NS基因,CYP1B1基因在各濃度組暴露下均有表達(dá).

圖4 CYP1B1和Nucleostemin基因的RNA表達(dá)結(jié)果Fig.4 The RNA expression results of CYP1B1 and Nucleostemin

圖5 CYP1B1基因與內(nèi)參擴(kuò)增產(chǎn)物的豐度比值Fig.5 The abundance ratios of CYP1B1 compared with β-actin 2

利用Origin 5.0分析NS基因,CYP1B1基因各自與內(nèi)參擴(kuò)增產(chǎn)物的豐度比值,并做圖分析.圖5顯示,甲醛暴露之后,CYP1B1基因在 0.5,1.0,3.0mg/m3濃度組中表達(dá)量.與空白組相比有極顯著差異.圖6顯示,甲醛暴露之后,各濃度染毒組與空白組相比, Nucleostemin的表達(dá)量發(fā)生了改變,其中,1.0mg/m3濃度組有極顯著性升高,而0.5和3.0mg/m3濃度組則是由極顯著性降低.

細(xì)胞色素 P450(CYP)是一類亞鐵血紅素—硫醇鹽蛋白的超家族,它參與內(nèi)源性物質(zhì)和包括藥物、環(huán)境化合物在內(nèi)的外源性物質(zhì)的代謝.作為發(fā)揮藥物代謝功能的主要I相代謝酶,CYP在肝臟中最為豐富.而肝外CYP的表達(dá)與功能及其與腫瘤發(fā)生的關(guān)系是近些年研究的熱點(diǎn),Nagai等[9]利用 RT-PCR技術(shù)在人類髓系白血病細(xì)胞系和淋巴細(xì)胞系中對(duì)各種CYP基因的表達(dá)做了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)CYP1A1、CYP1B1、CYP2A6、CYP2A7、CYP2D6和CYP2E1在所有被檢測(cè)的細(xì)胞系中均有高表達(dá).本實(shí)驗(yàn)選用CYP1B1因子進(jìn)行表達(dá)研究,結(jié)果顯示,各染毒組相較空白組,表達(dá)量都有明顯增高,其中1.0 mg/m3濃度組尤為明顯.說(shuō)明甲醛暴露對(duì)骨髓組織中細(xì)胞色素P450表達(dá)有影響,CYP1B1因子上調(diào),說(shuō)明外源性甲醛暴露對(duì)引起骨髓組織發(fā)生癌變有關(guān)聯(lián).

圖6 Nucleostemin基因與內(nèi)參擴(kuò)增產(chǎn)物的豐度比值Fig.6 The abundance ratios of Nucleostemin compared with β-actin 2

NS是一種新的p53結(jié)合蛋白,它參與干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增值調(diào)控.Ma等[10]認(rèn)為NS是以P53依賴途徑調(diào)控著細(xì)胞的G1/S期的轉(zhuǎn)換.Kafienah等[11]利用小干擾RNA技術(shù)阻抑NS基因表達(dá),發(fā)現(xiàn) NS蛋白表達(dá)與細(xì)胞周期有關(guān).由圖6可見(jiàn),甲醛暴露之后,S期細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組,NS的表達(dá)在 1.0mg/m3濃度組比空白組有極顯著上升,0.5mg/m3和3.0mg/m3濃度組與比空白組有極顯著下降.實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明,甲醛暴露對(duì) NS的正常表達(dá)有極顯著影響.因此我們推測(cè)甲醛暴露對(duì)骨髓的干細(xì)胞分化是有影響.

3 結(jié)語(yǔ)

從本次研究可以看到,甲醛暴露可以造成骨髓細(xì)胞的DNA損傷,影響細(xì)胞分裂周期,并且在不同的暴露組中,可以使相關(guān)的細(xì)胞分化因子差異性表達(dá).這些都說(shuō)明外源性甲醛暴露對(duì)小鼠骨髓組織有毒性作用. 此項(xiàng)研究對(duì)評(píng)估甲醛暴露是否能增加白血病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義.然而,甲醛暴露能否導(dǎo)致白血病,其機(jī)制如何,還需要進(jìn)行持續(xù)性地研究.

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