聯(lián)合偶合概率與似然比率在炭化骨骼個(gè)人識別中的計(jì)算及分析*

徐國昌，齊 靜，任 甫，劉海東

(1.南陽理工學(xué)院生物人類學(xué)研究所，河南南陽 473004；2.遼寧醫(yī)學(xué)院人類學(xué)研究所，遼寧錦州 121000；3.山東省濰坊市公安局 261041)

在火災(zāi)、焚尸、交通、空難、爆炸等案件和事故中常需要對炭化骨骼進(jìn)行個(gè)人識別[1-2]。人體軟組織被燒焦或者缺失時(shí)，留下的骨骼殘骸就顯得尤為重要[2-3]。國內(nèi)外研究者近年來對骨骼法醫(yī)學(xué)價(jià)值進(jìn)行探討并取得了一定成績，但如何利用分子生物學(xué)技術(shù)對殘存位點(diǎn)進(jìn)行計(jì)算與分析，仍是困擾該類研究的首要問題[4-8]。為了探討聯(lián)合偶合概率(random match probability，RMP)與似然比率(likelihood ratio，LR)在炭化骨骼個(gè)人識別中的計(jì)算及分析，本研究采用改進(jìn)的酚-氯仿法提取DNA，應(yīng)用熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)擴(kuò)增15個(gè)STR和1個(gè)性別基因位點(diǎn)并經(jīng)遺傳分析儀進(jìn)行電泳檢測，獲得基因位點(diǎn)的基本資料，了解基因位點(diǎn)焚燒后的存留情況，利用存留基因位點(diǎn)圖譜比對，進(jìn)行個(gè)人識別力(discrimination power，DP)和累積識別力(total discrimination power，TDP)、RMP、LR的計(jì)算，為炭化骨骼個(gè)人識別提供有效的檢測方法和判定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1樣本采集與處理 新鮮成人尸體，男、女各1具，分別取出一側(cè)股骨，清除骨骼表面組織，紫外光照射2 h，鋸取股骨干3塊，隨機(jī)取1塊做對照，余2塊分別置于馬弗爐中，常大氣壓下以300 ℃焚燒1 h，標(biāo)記備用。

1.2主要試劑(盒)、儀器設(shè)備和軟件 主要試劑(盒)：相對分子質(zhì)量內(nèi)標(biāo)、二硫蘇糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸(EDTA)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、飽和酚、正丁醇、異戊醇、液氮；AmpFlSTR ID Kit、PCR reagents、QIAquick?PCR Purification Kit、DNA tapy TM15 Kit、Amp FLSTR Identifiler Kit。主要儀器設(shè)備：SX型馬弗爐、生物冷凍研磨器、GeneAmp PCR System9700、3100xl Genetic Analyzer、高速冷凍離心機(jī)。主要軟件：Data Colletion(Version 2.0)軟件、Gene Mapper(Version 3.2)軟件、SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。

1.3樣本基因組DNA提取與檢測

1.3.1提取 每一樣本機(jī)械粉碎后，液氮下磁性振蕩研磨20 min。分析天平稱取每份樣本2.00 g置于EP管，EDTA脫鈣。加入裂解液，50 ℃水浴16～24 h。冷凍離心后取上液加入飽和酚、三氯甲烷、異戊醇混液，離心，取上層液。加入正丁醇，混勻離心，棄上清液，加入乙醚，混勻離心，棄上清液。

1.3.2純化 有機(jī)法聯(lián)合QIAquick?PCR Purification Kit。Buffer PB 5 mL，RNA 1 μL，離心后取上層液，硅膜濾過，離心。Buffer PB復(fù)洗，PE洗液混勻離心，重復(fù)2～3次。加入溴化乙啶(EB)30 μL，52 ℃ 5 min，冷凍離心。

1.3.3PCR復(fù)合擴(kuò)增 按照Amp FlSTR IdentifilerTM試劑盒的說明書，在GeneAmp PCR System 9700進(jìn)行16個(gè)基因位點(diǎn)的復(fù)合擴(kuò)增。反應(yīng)體系10 μL，反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 11 min，94 ℃ 1 min，59 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，60 ℃ 60 min。共30個(gè)循環(huán)。

表1 300 ℃焚燒成人股骨存留基因位點(diǎn)的個(gè)Pm、DP及TDP

Pm：偶合概率；+：檢出；-：未檢出。

1.3.4檢測 PCR產(chǎn)物 用ABI-3100xl型基因分析儀電泳，電泳信息由軟件Data Colletion V 3.0收集，電泳條件為時(shí)間2 h，溫度60 ℃，電壓15 kV，電流140 μA。Gene Mapper Idv 3.2軟件把收集的電泳圖譜信息經(jīng)計(jì)算機(jī)處理成數(shù)據(jù)信息，與等位基因分子內(nèi)標(biāo)比對。

圖1 樣本(男)基因位點(diǎn)檢測結(jié)果

圖2 樣本(女)基因位點(diǎn)檢測結(jié)果

2 結(jié) 果

2.1基因位點(diǎn)檢測結(jié)果 兩例樣本均成功提取出DNA，男尸樣本DNA圖譜有9個(gè)位點(diǎn)讀出，D8S1179、D21S11、D3S1358、TH01、D19S433、vWA、TPOX、D5S818、FGA，見圖1；女尸樣本DNA圖譜有15個(gè)位點(diǎn)讀出，D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、D19S433、vWA、TPOX、D18S51、D5S818、FGA，見圖2。與相應(yīng)未燒骨組織的基因位點(diǎn)相比，位點(diǎn)D2S1338沒有檢出，相對熒光單位(relative fluorescence units，RFU)值在1 000以下。計(jì)算基因位點(diǎn)檢出率，男、女例分別為56.25%、93.75%。

2.2個(gè)人識別統(tǒng)計(jì)分析 按照所述公式計(jì)算所檢各樣本Pi、Pm，以法醫(yī)DNA分析表作為參照[9]，計(jì)算出不同溫度焚燒后DP、TDP，見表1。由表1可見，300℃，TDP(男)：0.999 999 980 3，TDP(女)：>0.999 999 999 999 99。計(jì)算RPM和LR值，RPM(男)：2.322 5×10-12，RPM(女)：4.931 3×10-24；LR(男)：4.305 7×1011；LR(女)：2.027 9×1023。

3 討 論

3.1RMP與LR概率及意義[9]偶合概率是指從同一群體中隨機(jī)抽取兩名個(gè)體的遺傳基因型不相同的概率即遺傳標(biāo)記識別無關(guān)個(gè)體的能力，也是遺傳標(biāo)記對于個(gè)人識別效能的定量評估。TDP反映多個(gè)遺傳標(biāo)記的識別能力。所用遺傳標(biāo)記數(shù)目越多，識別概率越高，鑒別能力越強(qiáng)。偶合概率或叫匹配概率，指人群中隨機(jī)抽取二無關(guān)個(gè)體在特定基因座二者的基因型純粹由于機(jī)會一致的概率。LR是假設(shè)比對樣品個(gè)體就是物證DNA的供體的概率與假設(shè)人群中隨機(jī)個(gè)體是物證DNA供體的概率比。利用DNA技術(shù)，對現(xiàn)場檢材與比對樣本的基因型比對，計(jì)算被檢出基因座在人群中的TDP、RMP和LR，可使識別率達(dá)到1×1011以上，盡可能地利用基因位點(diǎn)來判定已成為個(gè)人識別的主流發(fā)展方向。

3.2溫度對炭化骨骼DNA完整性的影響 骨骼屬于硬組織，相對于人體的其他組織抗焚燒能力強(qiáng)且保存時(shí)間長[10]，對各種因素有較高的抵抗性，能夠保護(hù)內(nèi)部DNA結(jié)構(gòu)，減緩DNA降解和污染，因而成為與焚燒有關(guān)的案件和事故中物證缺乏情況下的首選檢材。溫度升高，加速了遺傳物質(zhì)水解反應(yīng)，DNA解鏈、斷裂；當(dāng)升至一定溫度，致使模板量嚴(yán)重不足，無法提取出DNA而導(dǎo)致檢材無法判定。炭化骨骼微量的DNA的提取，國內(nèi)外學(xué)者一直就沒有停止探索，本研究中采用改良的酚-氯仿法對其進(jìn)行提取，效果令人滿意[5,10-15]。炭化骨骼DNA位點(diǎn)的檢出率及檢測效果明顯受焚燒程度的影響，焚燒程度越重DNA檢出成功率越低，DNA檢驗(yàn)圖譜就存在不同程度的位點(diǎn)缺失[4]。本研究表明在300℃大部分位點(diǎn)能夠檢出，表明存留基因位點(diǎn)對溫度升高的耐受力表現(xiàn)相對穩(wěn)定。在法醫(yī)實(shí)踐中，因受熱順序和時(shí)間差異，不同溫度焚燒所遺骨骼表面顏色不同，就目前技術(shù)水平，實(shí)踐應(yīng)用中，據(jù)此大致推斷焚燒時(shí)的溫度，估計(jì)DNA的存留情況，再取舍樣本，可提高檢測的準(zhǔn)確性。

3.3個(gè)人識別的分析 法醫(yī)DNA分析最大的一個(gè)領(lǐng)域是對生物物證進(jìn)行個(gè)體識別。在保證受檢樣本結(jié)果正確的前提下，如果比對圖譜的分型結(jié)果不同，可以排除兩個(gè)DNA來自同一個(gè)體；如果分型相同則有兩種可能，一是來自同一個(gè)體，二是來自不同個(gè)體，只是所檢的標(biāo)記分型一致，此時(shí)需要增加DNA標(biāo)記，當(dāng)檢驗(yàn)的RMP在1×10-11以下時(shí)，可以認(rèn)定來自同一個(gè)體。進(jìn)行個(gè)人識別和同一認(rèn)定，最重要的是需對現(xiàn)場檢材與比對樣本的基因型，計(jì)算被檢出基因座的TDP、RMP。在沒有近親關(guān)系存在、嚴(yán)格遵守質(zhì)量控制、無突變、分型正確的前提下，保守地估算，偶合概率達(dá)到地球人口的百倍時(shí)，可以作出個(gè)體同一的認(rèn)定。在本研究中，選取的男例樣本RMP為2.322 5×10-12，女例樣本為4.931 3×10-24，均小于1×10-11，和他(她)本人的LR分別達(dá)到了4.305 7×1011和2.027 9×1023，完全可以認(rèn)定為同一個(gè)體。由此，提示炭化骨骼作為物證，不要輕易棄之，內(nèi)部極有可能存留有完全可以作出個(gè)人識別的DNA。

綜上所述，采用基因分析儀檢測存留位點(diǎn)，計(jì)算TDP、RMP、LR值可以對炭化骨骼進(jìn)行個(gè)人識別，有較高的法醫(yī)學(xué)實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值。

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