水飛薊賓對阿爾茨海默病模型大鼠學習記憶功能及對神經(jīng)細胞內(nèi)活性氧的影響

畢鵬翔，張忠敏，周小莉，郭艷芹

(1．牡丹江醫(yī)學院 附屬紅旗醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 牡丹江 157011;2．寧夏醫(yī)科大學 附屬心腦血管醫(yī)院，寧夏 銀川 750004)

水飛薊賓對阿爾茨海默病模型大鼠學習記憶功能及對神經(jīng)細胞內(nèi)活性氧的影響

畢鵬翔1，張忠敏1，周小莉2，郭艷芹1

(1．牡丹江醫(yī)學院 附屬紅旗醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 牡丹江 157011;2．寧夏醫(yī)科大學 附屬心腦血管醫(yī)院，寧夏 銀川 750004)

目的 探討水飛薊賓對阿爾茨海默病(AD)大鼠行為的改善作用及對神經(jīng)細胞內(nèi)自由基的清除情況。方法 大鼠60只，采用皮下注射東莨菪堿致AD模型，隨機分為模型組、空白對照組、水飛薊賓高中低劑量組及陽性對照多奈哌齊組，用Morris水迷宮法，檢測大鼠的學習記憶能力。另外采用過氧化試劑誘導人神經(jīng)母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)過氧化損傷通過流式細胞儀檢測水飛薊賓對活性氧自由基的清除能力。結(jié)果 模型組與空白對照組比學習記憶能力顯著下降，治療組與模型組比學習記憶能力得到顯著改善，同時體外實驗證實水飛薊賓能顯著降低細胞內(nèi)的自由基水平。結(jié)論 水飛薊賓對AD有較好的改善作用，其機制可能與其抗自由基活性有關(guān)。

水飛薊賓;阿爾茨海默病;水迷宮;自由基

隨著社會的發(fā)展，人口老齡化的加劇，阿爾茨海默病(Alzheimer'Disease，AD)的患病率和發(fā)病率呈指數(shù)上升。AD是一種神經(jīng)退行性疾?。?］，神經(jīng)元進行性的退化，喪失功能并死亡，被AD破壞的大腦隨著疾病破壞神經(jīng)組織，其體積和重量都會縮小。其顯著特征是嚴重的記憶喪失和個性改變，患者生活不能自理，壽命明顯縮短［2］。本研究通過水飛薊賓對 AD大鼠模型的干預，及對神經(jīng)細胞(SHSY5Y)的作用，探討水飛薊賓對 AD大鼠及 SHSY5Y 內(nèi)自由基的影響［3］。

1 材料

SH-SY5Y細胞，American Type Culture Collection，ATCC，Rockville，MD，USA。

東莨菪堿，成都瑞芬思生物科技有限公司;水飛薊賓，天津天士力制藥股份有限公司;多奈哌齊，天津力生制藥股份有限公司。

胎牛血清，杭州四季青公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)，Sigma公司;RPMI 1640培養(yǎng)基，Gibco公司。

MCO-15AC二氧化碳培養(yǎng)箱，三洋公司;KQ-500DE超聲波清洗器，昆山市超聲儀器公司;IX70-142倒置式生物顯微鏡，日本奧林巴斯;Morris水迷宮分析系統(tǒng)，上海欣欣信息科技有限公司;流式細胞儀，美國BD公司。

健康雄性Wistar大鼠60只，體重(200±20)g，由牡丹江醫(yī)學院動物中心提供，實驗動物合格證號:SCXK(黑)2006-010。

2 方法

2．1 動物分組及給藥

隨機分為6組，每組10只?？瞻讓φ战M皮下注射生理鹽水;模型組皮下注射東莨菪堿0．4 mg/kg;水飛薊賓高中低劑量組(100，200，400 mg/kg)口服給藥2 h后給予東莨菪堿［4］;陽性對照組皮下注射多奈哌齊1．2 mg/kg，30 min后給予東莨菪堿。各組動物30 min后進行Morris水迷宮檢測。

2．2 AD大鼠學習記憶功能測定

應用Morris水迷宮法［5］。實驗于造模前訓練2 d，動物每天4次下水訓練、造模后給藥后連續(xù)3 d實驗動物同樣每天下水4次，每次分別從池壁4個不同起始點將大鼠面向池壁放入水池，記錄每次找到平臺的時間即為逃避潛伏期，記錄動物的潛伏期。第5天實驗撤掉站臺檢測動物穿越站臺區(qū)域的次數(shù)［6］。

2．3 細胞培養(yǎng)及藥物處理

SH-SY5Y細胞接種在含5%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分為空白組;模型組給予過氧化叔丁基醇(tBHP)500 μmol;水飛薊賓組在給予tBHP 1 h后給予水飛薊賓 15 μmol，12 h 后 DCFH-DA(2，7，-dihydro-dichloro fluorescein diacetate)染色30 min，形態(tài)學觀察及流式細胞儀檢測活性氧(ROS)的水平［7］。

3 結(jié)果

3．1 大鼠行為能力

各組大鼠在Morris水迷宮中定向航行試驗模型組與空白組相比動物的潛伏期顯著增加，模型組的大鼠喪失學習記憶能力，平均逃避潛伏期改變不大。而給予水飛薊賓的AD大鼠，平均逃避潛伏期時間明顯縮短(P＜0．05)。說明經(jīng)過水飛薊賓治療的AD大鼠，空間記憶學習能力明顯提高，見表1。

3．2 空間探索試驗

拆去水下平臺后，以原站臺位置(第3象限)的動物穿梭次數(shù)為指標，模型組在第3象限穿越站臺次數(shù)明顯降低，而給予高劑量水飛薊賓治療的AD大鼠則顯著增加，與陽性對照組相當。見表1。

3．3 流式細胞術(shù)檢測SH-SY5Y細胞產(chǎn)生ROS

tBHP可以誘導SH-SY5Y細胞ROS的產(chǎn)生，水飛薊賓組ROS的產(chǎn)生量顯著降低。見圖1。模型組的ROS陽性細胞為(19．83±1．68)%，明顯高于對照組的(3．03 ±0．32)%(P ＜0．01);水飛薊賓組為(7．77 ±0．40)%，明顯低于模型組(P ＜0．01)。

表1 大鼠在Morris水迷宮中逃避潛伏期穿越站臺次數(shù)(n=10，x±s)

圖1 流式細胞術(shù)檢測儀檢測ROS的結(jié)果

4 討論

本研究顯示，造模后模型組大鼠認知能力較空白對照組明顯下降;治療后，各給藥組與模型組比較認知能力明顯改善，表明水飛薊賓可改善AD大鼠的學習記憶能力。

SH-SY5Y源于SH-N-SH的神經(jīng)瘤型亞系，被廣泛應用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制和防止措施的研究中。自由基代謝異常是AD等神經(jīng)退行性疾病發(fā)生發(fā)展的主要機理之一。

ROS誘導的神經(jīng)細胞損傷參與了一系列的神經(jīng)病理學過程，包括腦缺血，神經(jīng)退行性疾病等。水飛薊賓能通過消除氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化及5-脂氧酶活性來降低被損傷腦組織中丙二醛及白三烯含量，升高超氧化歧化酶含量。本實驗給予藥物干預后ROS水平明顯下降。

本研究提示，黃酮類化合物水飛薊賓對AD大鼠的腦神經(jīng)細胞具有保護作用，可能是通過清除細胞內(nèi)過多的自由基，降低細胞的應激反應而實現(xiàn)的，從而改善AD大鼠的學習記憶能力，對AD的防治和改善具有現(xiàn)實意義，但具體機制有待進一步研究。

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The impact of silibinin on learning and memory in rats with Alzheimer's and the reactive of oxygen in nerve cells

BI Peng-xiang1，ZHANG Zhong-min1，ZHOU Xiao-li2，GUO Yan-qin1
(1．Hongqi Hospital of Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China;2．The Cerebrovascular Hospital Affilated to Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China)

Purpose To investigate the protecting effects of silibinin on the behavior of Alzheimer's(AD)rats and on tert-Butylhydroperoxide(tBHP)-induced reactive oxygen species(ROS)in neuroblastoma cells(SH-SY5Y)．Methods 60 rats modeled with injection of scopolamine were randomly divided into model group，control group，silibinin(high-mid-low dose)groups，and the positive control group with donepezil treatment．The ability of learning and memory was appraised by water maze test．SH-SY5Y cells peroxidation damage was induced by peroxide reagent and eliminating effects of ROS were in valued by flow cytometry．Results Compared with control group，the learning and memory ability of scopolamine group was much declined，but it became much better in silibinin treatment group．Besides，experiments in vitro confirmed that silibinin could reduce the intracellular level of free radical significantly．Conclusion-Silibinin plays an important role in improvement of AD and the mechanism may attribute to with its antifree radical activity．

silibinin;Alzheimer's disease;water maze;ROS

R285．5

A

1005-1678(2012)06-0802-03

2012-08-02

國家自然科學基金(NO．81141080);黑龍江省自然科學基金項目(NO．D2007-100)

畢鵬翔，男，講師，碩士;郭艷芹，女，通信作者，教授，Email:yanqinguo@sina．com。