棕櫚酸對小鼠胰島和INS-1E細(xì)胞作用的研究

張艷玲 鄒本良

棕櫚酸對小鼠胰島和INS-1E細(xì)胞作用的研究

張艷玲 鄒本良

目的：探討高脂對INS-1E細(xì)胞和小鼠胰島的慢性作用。方法：雌性NMRI小鼠6~10周齡,苯巴比妥腹腔麻醉，常規(guī)開腹，取小鼠胰腺組織，應(yīng)用膠原酶技術(shù)消化胰腺分離胰島。傳代培養(yǎng)的INS-1E細(xì)胞和分離的小鼠胰島分別在含與不含棕櫚酸的RPMI1640中培養(yǎng)72 h，然后在含3.3、16.7 mmol/L葡萄糖的Krebs-Ringer緩沖液中培養(yǎng)60 min，留取上清液行胰島素測定。INS-1E細(xì)胞在含不同濃度的棕櫚酸的RPMI1640中培養(yǎng)72 h，提取其總RNA，合成相應(yīng)的cDNA，再行RT-PCR檢測胰十二指腸同源異形盒1（Pdx1），胰島素1、胰島素2和葡萄糖轉(zhuǎn)運子2的基因表達(dá)。結(jié)果：高脂培養(yǎng)后INS-1E細(xì)胞和小鼠胰島的基礎(chǔ)胰島素分泌增加，糖刺激的胰島素分泌減少，INS-1E細(xì)胞的胰島素1，胰島素2和葡萄糖轉(zhuǎn)運子2的mRNA水平下降。結(jié)論：高脂顯示了對胰島B細(xì)胞的慢性毒性作用。

棕櫚酸 胰島 細(xì)胞,培養(yǎng)的 糖尿病,2型 基因表達(dá) 小鼠

棕櫚酸是人體內(nèi)最普遍的脂肪酸，大量研究表明腹型肥胖和代謝綜合征是2型糖尿?。═2DM）的前期，高血脂是腹型肥胖和代謝綜合征的特征之一，長期高血脂可能對胰島B細(xì)胞造成持續(xù)性損害，即B細(xì)胞功能不全，導(dǎo)致T2DM的發(fā)生。本研究應(yīng)用小鼠胰島和克隆的B細(xì)胞株INS-1E細(xì)胞，探討過多棕櫚酸可能對胰島B細(xì)胞的慢性毒性作用。

1 材料與方法

1.1 材料 棕櫚酸、葡萄糖、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、牛血清白蛋白、N-2-羥乙哌嗪-N’-2-乙烷磺酸（HEPES）、RPMI 1640均購自 Sigma公司；自行配制Krebs-Ringer緩沖液（主要成分115 mmol/L氯化鈉,4.7 mmol/L氯化鉀,1.28 mmol/L氯化鈣,5.0 mmol/L碳酸氫鈉,25 mmol/L HEPES，調(diào)至pH 7.4），INS-1E細(xì)胞由瑞士C.B.Wollheim教授饋贈。棕櫚酸的配制：同等摩爾量的棕櫚酸和氫氧化鈉混合溶解并加熱，加入蒸餾水，先制成500 mmol/L的溶液，再用5%的牛血清白蛋白溶液（不含脂肪酸）稀釋至50 mmol/L，過濾消毒，保存在-20℃?zhèn)溆?。依?jù)參考文獻[1]培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2 INS-1E細(xì)胞釋放胰島素 雌性NMRI小鼠6~10周齡,苯巴比妥腹腔麻醉，常規(guī)開腹，取小鼠胰腺組織，應(yīng)用膠原酶技術(shù)消化胰腺分離胰島。應(yīng)用胰酶消化，培養(yǎng)液稀釋，離心收集INS-1E細(xì)胞，種植在24孔板中，每孔1 mL，2.5×106個細(xì)胞，37℃培養(yǎng)箱(95%空氣、5%CO2)培養(yǎng)1 d，移出培養(yǎng)液，分別在無棕櫚酸（對照組）、0.4 mmol/L棕櫚酸（棕櫚酸組）的RPMI 1640 1 mL中培養(yǎng)72 h。而后INS-1E細(xì)胞在Krebs-Ringer緩沖液（37℃培養(yǎng)箱）預(yù)培養(yǎng)15 min，移出緩沖液；每個孔中分別加入含3.3、16.7 mmol/L葡萄糖的Krebs-Ring?er緩沖液。37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h，從每孔吸取300 μL上清液，1 000 r/min離心2 min，留取200 μL上清液-20℃保存。

1.3 INS-1E細(xì)胞計數(shù) 移出每孔中剩余的培養(yǎng)液，加入蒸餾水1 mL,在FLUOstar Galaxy細(xì)胞計數(shù)儀上進行本底測定,然后加入20 μL的SYTO24試劑（SYTO24溶解在二甲亞砜中，濃度0.01 mmol/L），在37℃培養(yǎng)箱（5%CO2，95%空氣）放置45 min對細(xì)胞核進行染色，再次在FLUOstar Galaxy細(xì)胞計數(shù)儀上進行細(xì)胞數(shù)測定。用細(xì)胞數(shù)來校正INS量。

1.4 INS-1E細(xì)胞的基因表達(dá) INS-1E細(xì)胞分別在無棕櫚酸（對照組）、0.4 mmol/L棕櫚酸（棕櫚酸組）的RPMI 1640中培養(yǎng)72 h，應(yīng)用RNeasy Mini試劑盒(Qiagen公司)，遵照試劑盒說明書，提取INS-1E細(xì)胞的總RNA，在NanoDrop ND-8000 UV-Vis Spectrophotometer上檢測RNA在260和280 nm的吸光度計算RNA的濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（re?verse transcription,RT）應(yīng)用iScriptTMcDNA合成試劑盒（Bio-Rad公司）進行，每20 μL RT體系中加入1 μg總RNA。在ABI 7500快速多聚酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）儀上進行RT-PCR。相關(guān)基因的探針和引物購自Ap?plied Biosystems（ABI），目錄如下：胰十二指腸同源異形盒1（pancreas-duodenum homeobox 1,Pdx1）,胰島素 1（insulin 1,Ins1），胰島素 2（insulin 2,Ins2），葡萄糖轉(zhuǎn)運子2（glucose transporter type 2,Glut2）。RT-PCR的反應(yīng)體系如下：5 μL 2× TaqMan Universal Master混合液，0.5 μL 20× TaqMan探針，含和50 ng總RNA相當(dāng)?shù)腸DNA水溶液。熱循環(huán)如下：95℃ 20 s，95℃ 40個循環(huán)（每個循環(huán)3 s），60℃ 30 s。對不同代的INS-1E細(xì)胞行RNA提取及RT，重復(fù)3次，每個條件有3個樣本行RT-PCR。應(yīng)用2-ΔΔCT的方法計算基因的相對表達(dá)，以真核細(xì)胞18S核糖體RNA作為管家基因。

1.5 小鼠胰島釋放胰島素 依據(jù)參考文獻[2]進行小鼠胰島的分離和培養(yǎng)。第2天小鼠胰島分別被轉(zhuǎn)移到無棕櫚酸（對照組）、0.4 mmol/L棕櫚酸（棕櫚酸組）的RPMI1640中培養(yǎng)72 h。加入Krebs-Ringer緩沖液10 mL，另加入0.1%牛血清白蛋白，3.3 mmol/L葡萄糖；37℃水浴箱預(yù)培養(yǎng)15 min。然后單個胰島分別小心地置入100 μL含3.3或16.7 mmol/L葡萄糖的Krebs-Ringer緩沖液中；37℃水浴箱培養(yǎng)1 h，從每孔胰島中小心吸取50 μL培養(yǎng)上清夜，-20℃保存待測。應(yīng)用大鼠胰島素（insulin,INS,Novo Nordisk）作標(biāo)準(zhǔn)，125I標(biāo)記的人INS（Novo Nordisk A/S）作示蹤劑，應(yīng)用豚鼠抗豬INS抗體（Novo Nordisk,Bagsvaerd,Denmark）進行放射免疫測定INS，應(yīng)用乙醇分離自由的和結(jié)合的放射活性，批內(nèi)變異系數(shù)5%，批間變異系數(shù)10%。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 4.03軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。正態(tài)分布的計量資料以表示，組間均數(shù)比較采用成組t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高濃度棕櫚酸對INS-1E細(xì)胞和小鼠胰島分泌INS的影響 經(jīng)過高濃度棕櫚酸培養(yǎng)后，INS-1E細(xì)胞和胰島的基礎(chǔ)INS分泌增加，葡萄糖刺激的INS分泌下降，見表1。

Table 1 Secretion changes of INS-1E cells and isolated mouse islets after palmitate incubation表1 高脂培養(yǎng)后INS-1E細(xì)胞和小鼠胰島INS分泌的變化（）

Table 1 Secretion changes of INS-1E cells and isolated mouse islets after palmitate incubation表1 高脂培養(yǎng)后INS-1E細(xì)胞和小鼠胰島INS分泌的變化（）

*P<0.05，**P<0.01

組別 胰島分泌INS（μg/L）n INS-IE細(xì)胞INS（ng/104細(xì)胞）對照組棕櫚酸組t 18 18基礎(chǔ)值9.09±0.80 14.31±1.03 3.983**高糖刺激31.11±1.71 22.91±1.11 4.017**基礎(chǔ)值2.38±0.30 3.85±0.26 2.450*高糖刺激20.59±1.67 15.96±1.12 2.309*

2.2 高濃度棕櫚酸培養(yǎng)后INS-1E細(xì)胞基因表達(dá)的改變 高濃度棕櫚酸培養(yǎng)后，INS-1E細(xì)胞Ins1、Ins2、Glut2的mRNA水平較對照組明顯下降,而Pdx1的基因表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

Table 2 Expression of INS-1E gene after palmitate incubation表2 高脂培養(yǎng)后INS-1E細(xì)胞基因表達(dá)的改變 （）

Table 2 Expression of INS-1E gene after palmitate incubation表2 高脂培養(yǎng)后INS-1E細(xì)胞基因表達(dá)的改變 （）

*P<0.05，**P<0.01

組別對照組棕櫚酸組t n3 3 Pdx1 1.002±0.045 0.974±0.081 0.304 Ins1 1.003±0.055 0.417±0.034 9.118**Ins2 1.001±0.023 0.896±0.006 4.385*Glut2 1.003±0.050 0.326±0.011 13.160**

3 討論

T2DM的患病率在全球范圍內(nèi)快速增長[3]。T2DM起病和進行性發(fā)展的根本原因是胰島B細(xì)胞功能的進行性減退[4]，腹型肥胖和代謝綜合征的高血脂被認(rèn)為是胰島B細(xì)胞功能減退的重要原因。但尚未得出一致性的結(jié)論。本研究應(yīng)用克隆的胰島B細(xì)胞株和分離的小鼠胰島，證實長期過量棕櫚酸的作用可以引起胰島B細(xì)胞功能異常，即B細(xì)胞的基礎(chǔ)INS分泌（basal insulin secretion,BIS）增加，葡萄糖刺激的INS分泌（glucose stimulated insulin secre?tion,GSIS）減退。

體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食的小鼠2個月后表現(xiàn)為肥胖、高脂血癥、輕度高血糖，小鼠胰島的GSIS較正常飲食小鼠的胰島明顯減退，這可能與胰島內(nèi)游離膽固醇的沉積有關(guān)[5]。人體內(nèi)的研究也顯示了高血脂對胰島B細(xì)胞的損害作用，伴與不伴T2DM家族史的正常個體，靜脈輸入脂類4 d后，伴T2DM家族史的個體對混合餐和靜脈葡萄糖刺激的INS分泌減退[6]。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，長期高濃度棕櫚酸的作用還引起胰島B細(xì)胞基因表達(dá)的改變。分離的大鼠胰島在添加與不添加棕櫚酸的RPMI中培養(yǎng)72 h后，核提取物經(jīng)電泳遷移率變動分析顯示棕櫚酸使Pdx1和INS啟動子的結(jié)合活性下降，導(dǎo)致INS基因表達(dá)減少[7]。大鼠間隔4 h分別靜脈滴注葡萄糖和乳脂持續(xù)72 h，其胰島的Pdx1 mRNA水平與靜脈滴注鹽水大鼠胰島的沒有差異，但實驗組胰島的Pdx1在細(xì)胞漿的含量增多，在核內(nèi)的含量減少，并且應(yīng)用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)實驗組胰島的Pdx1和INS啟動子的結(jié)合活性明顯下降[8]。

T2DM患者分離的胰島也具有GSIS減退的特征[9]，并且Glut1、Glut2 mRNA的表達(dá)下降，結(jié)合本研究的結(jié)果，棕櫚酸引致的葡萄糖在胰島B細(xì)胞的轉(zhuǎn)運下降也是其導(dǎo)致GSIS減退的一種原因。

綜上所述，長期過多棕櫚酸可能通過下調(diào)葡萄糖在胰島B細(xì)胞的轉(zhuǎn)運、減少葡萄糖氧化代謝、改變Pdx1在細(xì)胞內(nèi)的分布及其和INS啟動子的結(jié)合，從而影響INS基因的表達(dá)，導(dǎo)致胰島B細(xì)胞功能減退，此因素可能是T2DM發(fā)病和進行性發(fā)展的重要原因。

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The Effect of Palmitate on the Function of Isolated Mouse Islets and INS-1E Cells

ZHANG Yanling,ZOU Benliang

Department of Education,Xiyuan Hospital,Chinese Academy of Chinese Medicine,Beijing 100091,China

Objective:To explore the chronic effect of excess palmitate on INS-1E cells and isolated mouse islets.Methods:Islets were isolated by the collagenase digestion technique from female NMRI mice(6-10-week).Both passaged INS-1E cells and isolated mouse islets were incubated in RPMI 1640 supplemented with 0 or 0.4 mmol/L palmitate for 72 h,respectively.After preincubation,both INS-1E cells and islets were incubated in Krebs-Ringer buffer containing 3.3 or 16.7 mmol/L glucose for 1 h,respectively.The correspondingly upper medium was taken for insulin assay.Total RNA was extract?ed from INS-1E cells after 72 h incubation with 0 or 0.4 mmol/L palmitate.cDNA was synthesized.Pdx1,Insulin 1,Insulin 2,and glucose transporter(GLUT)2 mRNA expressions were tested by RT-PCR in INS-1E cells.Results:The basal insulin secretion was increased,and glucose-stimulated insulin secretion was impaired in both INS-1E cells and isolated mouse is?lets after long-term palmitate incubation.Levels of insulin 1,insulin 2 and GLUT2 mRNA were diminished in INS-1E cells.Conclusion:Long-term exposure to higher level of palmitate may cause dysfunction of pancreatic islet cells.

palmitic acid islets of langerhans cells,cultured diabetes mellitus,type 2 gene expression mice

10.3969/j.issn.0253-9896.2012.08.019

100091北京市，中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院教育處（張艷玲），內(nèi)分泌科（鄒本良）

（2011-10-31收稿 2012-03-08修回）

（本文編輯 魏杰）