-514 bp及-250 bp位點基因多態(tài)性對肝脂酶轉(zhuǎn)錄活性的影響

蔡澤園 趙莉莉 張 蕊 毛用敏 崔讓莊

-514 bp及-250 bp位點基因多態(tài)性對肝脂酶轉(zhuǎn)錄活性的影響

蔡澤園 趙莉莉 張 蕊 毛用敏 崔讓莊

目的：探討同時含肝脂酶（HL）啟動子-514 bp和-250 bp多態(tài)位點的野生型及變異純合子型的熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒對HL轉(zhuǎn)錄活性的影響。方法：PCR法擴(kuò)增含不同目的基因的DNA片段，將目的基因插入到pUCm-T質(zhì)粒中，獲取含SacI及BglⅡ酶切位點的目的基因，將該基因與含熒光素報告基因的pGL2質(zhì)粒相連，構(gòu)建pGL2-HL/-514T+-250A變異純合型以及pGL2-HL/-514C+-250G野生型熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測不同重組質(zhì)粒熒光素酶報告基因的活性。結(jié)果：（1）實驗成功構(gòu)建了同時含HL啟動子部位-514/-250位點的野生型和變異純合型的熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒。（2）pGL2-HL/-514T+-250A變異純合型的熒光素酶相對表達(dá)活性明顯低于野生型熒光素酶表達(dá)活性（P<0.01）。結(jié)論：HL啟動子-514及-250位置基因的聯(lián)合變異可直接影響HL的轉(zhuǎn)錄活性。

肝脂酶 啟動區(qū)（遺傳學(xué)） 多態(tài)現(xiàn)象,遺傳 雜合子 純合子 轉(zhuǎn)錄,遺傳 基因表達(dá)

肝脂酶（HL）是脂蛋白代謝的關(guān)鍵酶之一，HL基因啟動子區(qū)單核苷酸基因多態(tài)性與糖尿病、動脈粥樣硬化等多種疾病有相關(guān)性[1-3]，并與HL活性下降有關(guān)，尤其是-514T和-250A等位基因攜帶者存在HL活性下降的現(xiàn)象[4]。由于HL上述4個位點基因多態(tài)性存在著連鎖不平衡[5]，本研究擬構(gòu)建同時含HL基因啟動子-514多態(tài)性位點與-250多態(tài)性位點的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，通過檢測熒光素酶報告基因的熒光強(qiáng)度，以探討啟動子不同位點的基因變異對轉(zhuǎn)錄活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 Taq DNA聚合酶、大腸桿菌菌株DH5α、pUCm-

Teasy載體、pGL2-Basic載體（上海生工生物工程有限公司）；人肝癌細(xì)胞系細(xì)胞（HepG2）購自中科院上海細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基（HG-DMEM）、胎牛血清、0.5%胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素（GIBCO公司）；DNA Marker DL2000、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶SacⅠ、BglⅡ（大連寶生物工程有限公司）；胰蛋白胨（天津市東方衛(wèi)生材料廠）；酵母菌提取物（華美生物工程公司）；細(xì)菌瓊脂粉、瓊脂糖（上?；蚩萍加邢薰荆籔CR儀（Gene Amp PCR system 9600）、光度測定計（Eppen?dorf公司）；ZF型紫外透射反射分析儀（上?？等A生化儀器制造廠）；倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；層流超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；熒光化學(xué)發(fā)光測定儀（Applied Biosystems公司）。

1.2 方法 模板：含HL-514C+-250G野生型以及HL-514T+-250A變異純合子的基因組DNA標(biāo)本由本室保存。引物：上游 5'-TCTAGGATCACCTCTCAATGGGTCA-3'，下游5'-GGGGTCCAGGCTTTCTTGG-3'，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系及參數(shù)：25 μL反應(yīng)體系中各物質(zhì)的濃度為 300 mmol/L Tris-HCl，75 mmol/L（NH4）2SO4，pH 9.5，12.5 mmol/L MgCl2，20 μmol/L上游引物和下游引物，10 mmol/L dNTP，0.25 μL Taq酶；0.5 μL DNA，反應(yīng)條件：95 ℃5 min。以下步驟35個循環(huán)：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72℃7 min。純化回收PCR產(chǎn)物，與pUCm-T連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，堿裂解法提取質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶MvaI對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，進(jìn)行DNA序列測定（三博遠(yuǎn)志生物公司）。利用pUCm-T和pGL2-Basic共有的限制性內(nèi)切酶SacⅠ和BglⅡ酶切pUC-HL/-514C+-250G及pUC-HL/-514T+-250A重組質(zhì)粒和pGL2-Basic，隨后進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶SacⅠ、BglⅡ?qū)χ亟M質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并進(jìn)行DNA序列測定。用陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000將pGL2-HL/-514C+-250G及pGL2-HL/-514T+-250A重組質(zhì)粒（1 μg/孔）分別和內(nèi)參質(zhì)粒PRL-nuL l（0.025 μg/孔）共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞（按Lipofectamine 2000操作說明書進(jìn)行）。細(xì)胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后裂解細(xì)胞，收集裂解液，細(xì)胞裂解液20 μL與LARⅡ100 μL混合，在熒光發(fā)光檢測儀讀取10 s的發(fā)光值，此為螢火蟲熒光素酶催化產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度。再加入Stop＆Glo 100 μL終止螢火蟲熒光素酶活性，讀取10 s發(fā)光值，即為海腎熒光素酶催化產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度。記錄檢測數(shù)據(jù)，計算不同重組質(zhì)粒熒光素酶相對活性。熒光素酶相對活性的計算公式如下：熒光素酶相對活性=（螢火蟲熒光素酶發(fā)光強(qiáng)度-空白孔發(fā)光強(qiáng)度）÷（海腎熒光素酶發(fā)光強(qiáng)度-空白孔發(fā)光強(qiáng)度）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料數(shù)據(jù)以表示，2組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pUC-HL/-514C+-250G及pUC-HL/-514T+-250A重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 構(gòu)建成功的pUC-HL/-514C+-250G及pUC-HL/-514T+-250A重組質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，由于pUCm-T質(zhì)粒上有2個MvaI的酶切位點，同時插入的目的片段中亦存在1個MvaI的酶切位點，故正向插入的重組質(zhì)粒酶切后產(chǎn)生546 bp和212 bp兩條片段，見圖1。DNA測序顯示，重組質(zhì)粒中含有相應(yīng)的基因多態(tài)性位點，其他序列無變異，pUC-HL/-514C+-250G及pUC-HL/-514T+-250A重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，見圖2。

2.2 pGL2-HL/-514C+-250G及pGL2-HL/-514T+-250A重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 構(gòu)建好的pGL2-HL/-514C+-250G和pGL2-HL/-514T+-250A質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶SacⅠ、BglⅡ進(jìn)行雙酶切，切下與插入片段大小（696 bp）一致的DNA片段，見圖3。DNA測序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒中含有相應(yīng)的基因多態(tài)性位點，其他序列無變異，pGL2-HL/-514C+-250G和pGL2-HL/-514T+-250A質(zhì)粒構(gòu)建成功，見圖4。

Figure 1 Electrophoresis of enzyme digestion of pUC-HL/-514+-250 recombinant plasmid DNA圖1 pUC-HL/-514+-250重組質(zhì)粒酶切電泳圖

Figure 3 Electrophoresis of enzyme digestion of pGL2-HL/-514+-250 recombinant plasmid圖3 pGL2-HL/-514+-250重組質(zhì)粒酶切電泳圖

2.3 熒光素酶報告基因活性檢測 pGL2-HL/-514C+-250G質(zhì)粒中的熒光素酶相對活性高于pGL2-HL/-514T+-250A質(zhì)粒中的熒光素酶相對活性（9.835±2.462 vs 4.726±1.077），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.658，P ＜ 0.01）。

3 討論

肝脂酶基因啟動子區(qū)域有4種常見的基因多態(tài)性，在不同種族人群中此4個多態(tài)性位點幾乎成完全連鎖不平衡。研究證實，其中的-514T位點與-250位點基因多態(tài)性與肝脂酶活性降低及血漿HDL-C濃度變化相關(guān)[6-7]。Deeb等[8]通過瞬時轉(zhuǎn)染實驗，將含有HL基因啟動子-514C與-250G及HL基因啟動子-514T與-250A的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染進(jìn)人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞及大鼠的肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12細(xì)胞，比較野生型HL基因啟動子與-514位點及-250位點均為變異型的HL基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，結(jié)果顯示，2種重組質(zhì)粒在HepG2細(xì)胞中的活性很低以至于很難區(qū)分2種重組體的轉(zhuǎn)錄活性，可是2種重組質(zhì)粒在AML12細(xì)胞中卻表現(xiàn)出很高的活性，HL-514T/-250A的活性比HL-514C/-250G要低30%。目前國內(nèi)通過瞬時轉(zhuǎn)染實驗方法對HL啟動子區(qū)基因多態(tài)性與轉(zhuǎn)錄活性的研究尚少見報道。本實驗構(gòu)建了pGL2-HL/-514C+-250G及pGL2-HL/-514T+-250A重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞中以檢驗兩者的轉(zhuǎn)錄活性及差別，與Deeb等[8]研究不同的是2種重組質(zhì)粒在HepG2細(xì)胞中都得以高效地表達(dá)，分析原因可能是本實驗采用了含熒光素酶報告基因的pGL2-Basic載體，而Deeb等采用的是pXP1載體，由于載體不同而導(dǎo)致在同樣的細(xì)胞內(nèi)其轉(zhuǎn)錄活性卻相差巨大。

本研究通過構(gòu)建pGL2含多態(tài)性目的片段的重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞中，可能為體外研究目的基因啟動子多態(tài)性與轉(zhuǎn)錄功能的關(guān)系找到一種有效的途徑，但本研究只對HL基因啟動子區(qū)-514及-250兩個位點的多態(tài)性與轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)系做了比較，常見的其他兩個位點的研究尚有待深入。

[1] Wei M,Lu YS,Li PP,et al.Association of the hepatic lipase gene-250G/A promoter polymorphism with the susceptibility to type 2 diabetes mellitus combining with coronary heart disease[J].Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi，2009,26(2):219-222.

[2]Soyal SM,Sandhofer A,Hahne P,et al.Cholesteryl ester transfer protein and hepatic lipase gene polymorphisms:effects on hepatic mRNA levels,plasma lipids and carotid atherosclerosis[J].Athero?sclerosis,2011,216(2):374-380.

[3] Gündogdu F,Gurlertop Y,Pirim I,et al.Association between-514C-->T polymorphism of the hepatic lipase gene and coro?nary artery disease in a Turkish population[J].Acta Cardiol，2008,63(2):197-202.

[4]Grarup N,Andreasen CH,Anderson MK,et al.The-250G>A pro?moter variant in hepatic lipase associates with elevated fasting se?rum high-density lipoprotein cholesterol modulated by interaction with physical activity in a study of 16,156 Danish subjects[J].J Clin Endocrinol Metab，2008,93(6):2294-2299.

[5]Li M,Yin R,Li Y,et al.Association of LIPC-250G>A polymor?phism and several environmental factors with serum lipid levels in the Guangxi Bai Ku Yao and Han populations[J].Lipids Health Dis，2010,9(1):28.

[6]Johannsen TH,Kamstrup PR,Andersen RV,et al.Hepatic lipase,genetically elevated high-density lipoprotein,and risk of ischemic cardiovascular disease[J].J Clin Endocrinol Metab，2009,94(4):1264-1273.

[7]Lindi V,Schwab U,Louheranta A,et al.The G-250A polymor?phism in the hepatic lipase gene promoter is associated with chang?es in hepatic lipase activity and LDL cholesterol:The KANWU Study[J].Nutr Metab Cardiovasc Dis,2008,18(2):88-95.

[8]Deeb SS,Peng R.The C-514T polymorphism in the human hepatic lipase gene promoter diminishes its activity[J].J Lipid Res，2000,41(1):155-158.

The effect of Hepatic Lipase Gene Promoter Polymorphisms on the Transcriptional Activity

CAI Zeyuan,ZHAO Lili,ZHANG Rui,MAO Yongmin,CUI Rangzhuang

Tianjin Chest Hospital,Tianjin 30051,China

Objective:To investigate the effect of recombinant plasmids containing the double luciferase report gene and the hepatic lipase(HL)promoter-514/-250 sites on HL transcriptional activity.Methods:DNA fragments containing different target genes were amplified by PCR.Target genes were inserted into the plasmid pUCm-T to obtain the target gene containing SacI and BglⅡrestriction sites.The luciferase reporter vectors containing HL promoter-514T/-250A and-514C/-250G polymorphisms were constructed,and tested by Dual Luciferase Reporter Assay System.Results:The lu?ciferase reporter vector containing HL promoter-514T+-250A presented higher HL transcriptional activity than that of vec?tor with-514C+-250G（P<0.01）.Conclusion:HL promoter-514C together with-250G alleles were associated with high?er HL transcriptional activity,which proved that HL promoter polymorphisms can influence the HL transcriptional activity in the molecular mechanism.

hepatic lipase promoter regions(genetics) polymorphism,genetic heterozygote homozygote tran?scription,genetic gene expression

10.3969/j.issn.0253-9896.2012.08.016

300051 天津市胸科醫(yī)院心血管病研究所

（2011-09-01收稿 2011-12-01修回）

（本文編輯 陸榮展）