辛伐他汀組織工程骨材料的制備及性能研究*

梁 軍 曹紅彬 辛景義

辛伐他汀組織工程骨材料的制備及性能研究*

梁 軍 曹紅彬 辛景義

目的：探討制備的辛伐他汀組織工程骨復(fù)合支架材料的理化性質(zhì)及力學(xué)強(qiáng)度。方法：將同種異體骨、Ⅰ型膠原、辛伐他汀進(jìn)行系列理化處理，制備成單純組織工程骨材料、膠原組織工程骨材料、辛伐他汀組織工程骨復(fù)合材料。制備后的材料用掃描電鏡觀察其形貌特征，用X線衍射分析材料成分，并對(duì)材料的力學(xué)性能進(jìn)行分析測(cè)定。結(jié)果：單純組織工程骨材料具有天然骨的網(wǎng)狀孔隙系統(tǒng)；膠原組織工程骨材料具有天然骨的網(wǎng)狀孔隙系統(tǒng)，微孔表面覆蓋膠原膜；辛伐他汀組織工程骨復(fù)合材料具有骨組織的天然網(wǎng)狀孔隙系統(tǒng)，微孔表面可見膠原膜覆蓋；單純組織工程骨材料、膠原組織工程骨材料、辛伐他汀組織工程骨復(fù)合材料主要成分均為羥基磷灰石[HA,Ca10（OH）2（PO4）6]，3種材料的孔徑大小、空隙率、彎曲強(qiáng)度和壓縮強(qiáng)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：辛伐他汀組織工程骨復(fù)合材料與其他2種材料理化性質(zhì)和力學(xué)強(qiáng)度相同，可作為一種有效的天然組織工程骨支架材料。

人工器官 骨和骨組織 組織工程 生物力學(xué) 辛伐他汀

組織工程骨材料包括天然骨材料和合成高分子材料等，這些組織工程骨植入后，基本上只是作為填充材料應(yīng)用于臨床，也有部分材料是應(yīng)用異種骨復(fù)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）促進(jìn)骨再生。Wang等[1]研究證實(shí)他汀類藥物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)促進(jìn)局部骨組織再生是可能的。Gutierrez等[2]研究證實(shí)他汀類藥物可能成為一種新的有效的促進(jìn)骨折愈合的藥物。本研究旨在構(gòu)建既能作為骨組織工程支架填充骨缺損，又能在局部促進(jìn)骨組織再生的復(fù)合支架材料。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）單純組織工程骨支架材料（A組）的制備：取新鮮人尸體骨，去除周圍軟組織、骨膜和關(guān)節(jié)軟骨，并保留一側(cè)皮質(zhì)，制成1.5 cm×0.5 cm×0.5 cm骨條，生理鹽水反復(fù)沖洗，去除骨髓和殘血。經(jīng)過脫脂、脫細(xì)胞和脫蛋白等過程，蒸餾水沖洗干凈，-80℃深低溫冰箱（日本SANYO公司）冰凍，經(jīng)真空低溫冷凍干燥機(jī)（德國Heto公司）凍干備用，共制備60塊材料，單個(gè)骨條均質(zhì)量250.4 mg。（2）膠原組織工程骨復(fù)合支架材料（B組）的制備：配制0.05 mol/L冰醋酸100 mL，取Ⅰ型膠原（美國Sigma公司）250 mg，放入0.05 mol/L的100 mL冰醋酸溶液中，在震蕩器上充分溶解成0.25%的Ⅰ型膠原溶液。將凍干的組織工程骨浸入膠原溶液中1 h，取出骨塊，用蒸餾水沖洗3遍，-80℃深低溫冰箱冰凍，經(jīng)真空低溫冷凍干燥機(jī)凍干備用，共40塊材料，單個(gè)復(fù)合材料質(zhì)量為253.9 mg，吸附膠原量3.5 mg。（3）辛伐他汀組織工程骨復(fù)合支架材料(C組)的制備：配制0.05 g/L濃度的辛伐他汀溶液，取凍干備用的膠原組織工程骨復(fù)合材料，放入辛伐他汀溶液中30 min后取出，重復(fù)以上凍干過程，制得辛伐他汀組織工程骨材料，共20塊材料，單個(gè)材料質(zhì)量為254.1 mg，吸附辛伐他汀量0.2 mg。

1.2 方法

1.2.1 大體標(biāo)本觀察 肉眼觀察所制備的組織工程骨、膠原組織工程骨復(fù)合材料、辛伐他汀組織工程骨復(fù)合材料的形貌特征以及結(jié)構(gòu)。

1.2.2 掃描電鏡觀察 用X-650型掃描電子顯微分析儀（日本日立公司）對(duì)所制備的以上3種材料進(jìn)行形貌特征觀察，每種材料用4個(gè)樣品分析，并用CA6300型圖像處理分析系統(tǒng)（中國科學(xué)院自動(dòng)化研究所）對(duì)其孔徑大小、孔隙率進(jìn)行測(cè)定，由四川大學(xué)分析測(cè)試中心測(cè)定。

1.2.3 X線衍射分析 用日本D/Max-Ⅲ型X線衍射分析儀對(duì)所制備的3種材料行X線衍射物相分析，每種材料用4個(gè)樣品，在銅靶工作電壓40 kV工作電流40 mA掃描速度1°/min走紙速度5 mm/min的條件下進(jìn)行分析，由四川大學(xué)分析測(cè)試中心測(cè)定。

1.2.4 材料力學(xué)性能測(cè)定 用日本島津AG-107A型電子式萬能材料試驗(yàn)機(jī)對(duì)所制備的3種材料進(jìn)行壓縮強(qiáng)度、彎曲強(qiáng)度測(cè)試，每種檢測(cè)用4個(gè)樣品分析，加載速度為1.0 mm/min，由四川大學(xué)分析測(cè)試中心測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.5軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察 單純組織工程骨材料呈白色，微孔壁光滑，具有天然骨的三維結(jié)構(gòu)；膠原組織工程骨復(fù)合材料呈白色，微孔壁表面粗糙，在孔隙內(nèi)可見到網(wǎng)狀物，類似天然骨的三維結(jié)構(gòu)；辛伐他汀組織工程骨復(fù)合材料呈淡黃色，微孔壁表面粗糙，在孔隙內(nèi)可見到網(wǎng)狀物，類似天然骨的三維結(jié)構(gòu)。

2.2 掃描電鏡觀察 單純組織工程骨材料具有天然骨組織的三維網(wǎng)狀孔隙結(jié)構(gòu)，孔隙之間互相連通，見圖1A；膠原組織工程骨復(fù)合材料保留了天然骨組織的網(wǎng)狀孔隙結(jié)構(gòu)，但在孔隙周圍框架表面覆蓋了一層膠狀物，孔隙內(nèi)有膠原交聯(lián)形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，見圖1B；辛伐他汀組織工程骨復(fù)合材料同樣保留了天然骨組織的網(wǎng)狀孔隙結(jié)構(gòu)，孔隙周圍框架表面覆蓋了一層膠狀物，孔隙內(nèi)有膠原交聯(lián)形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，見圖1C。

2.3 3種材料的孔隙率、孔徑大小及生物力學(xué)性能測(cè)定 3組骨復(fù)合材料的孔徑大小、空隙率、壓縮強(qiáng)度和彎曲強(qiáng)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05），見表1。

Table 1 Results of pore diameter and porosity in three materials表1 3種材料的孔徑、空隙率及生物學(xué)性能測(cè)定結(jié)果分析（）

Table 1 Results of pore diameter and porosity in three materials表1 3種材料的孔徑、空隙率及生物學(xué)性能測(cè)定結(jié)果分析（）

均P＞0.05

組別 n A組B組C組F 60 40 20孔徑大?。é蘭）357.64±6.80 362.42±6.30 374.28±7.13 3.357空隙率（%）86.24±2.26 82.90±1.78 88.56±2.59 3.427壓縮強(qiáng)度（MPa）2.125±1.488 2.912±2.263 2.632±1.721 1.972彎曲強(qiáng)度（MPa）11.670±2.658 12.605±3.263 13.226±3.305 1.739

2.4 X線衍射分析 3組骨復(fù)合材料的X線衍射圖譜均為曲線型羥基磷灰石[HA，Ca10（OH）2（PO4）6]，見圖2。

3 討論

生物衍生骨支架材料是應(yīng)用生物體的組織，經(jīng)過一系列物理、化學(xué)方法，如脫脂、脫細(xì)胞、脫抗原等處理后形成的支架材料。目前較多的天然骨有燒結(jié)骨、同種異體骨、凍干骨及脫蛋白骨等。同種異體骨與自體骨具有相同的成分和結(jié)構(gòu)，一直以來都是替代自體骨移植的首選材料，以同種異體骨為支架材料，復(fù)合生物因子和干細(xì)胞等材料應(yīng)用于骨移植，已經(jīng)取得了一些成就。同種異體骨作為移植物本身不能促進(jìn)骨形成，但可為自身骨形成提供支架，并且有骨誘導(dǎo)的作用。異體骨經(jīng)去細(xì)胞、去抗原、部分脫鈣和凍干處理,制成的保留天然框架的生物衍生骨支架，臨床用于修復(fù)骨缺損，取得了滿意的效果。目前應(yīng)用的人工組織工程骨材料，如聚乙酸、聚乳酸、羥基磷灰石等，因其細(xì)胞相容性差，立體空間結(jié)構(gòu)紊亂，無成骨誘導(dǎo)因子等，其進(jìn)一步應(yīng)用受到限制。目前國內(nèi)臨床常用的同種骨材料大部分取自捐獻(xiàn)骨，經(jīng)過處理后只具有填充骨缺損的作用，沒有促進(jìn)骨組織再生的作用。人工骨材料基本由硫酸鈣等構(gòu)成，均沒有促進(jìn)骨組織再生的作用。本研究構(gòu)建的辛伐他汀生物衍生骨復(fù)合支架材料是以骨為支架基質(zhì)材料，覆蓋膠原膜后復(fù)合材料具有促進(jìn)骨組織再生的作用，其應(yīng)用使材料本身具有骨誘導(dǎo)作用，避免了自體骨以及人工骨的不足之處，易被患者接受。

骨組織中含有多種參與調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育及生長的多肽類生長因子，由于許多因素的影響，生長因子的應(yīng)用受到極大的限制。他汀類藥物能夠增強(qiáng)骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）-2啟動(dòng)子的活性，他汀類藥物能夠參與調(diào)控骨代謝的整個(gè)過程。他汀類藥物對(duì)骨吸收和骨改建也有影響，他汀類藥物阻止骨量丟失是抑制破骨細(xì)胞，而不是增加骨形成[3]。辛伐他汀結(jié)合鈣磷酸鹽植入兔臨界顱骨缺損，2~4 d炎癥反應(yīng)明顯，8周骨形成明顯，盡管有炎癥反應(yīng)，但可明顯刺激骨形成[4]。辛伐他汀凝膠復(fù)合物在兔骨缺損模型可刺激BMP-2生成，提高局部骨形成速率[5]。兔股骨截骨后喂食辛伐他汀，可早期促進(jìn)骨折愈合[6]。有研究表明，兔脛骨骨折模型局部應(yīng)用辛伐他汀1、2、4周后，實(shí)驗(yàn)組骨折愈合速度加快[7]。洛伐他汀復(fù)合可降解物植入兔股骨骨折模型可以促進(jìn)骨折愈合，5 μg/L洛伐他汀可明顯刺激骨形成[8]。Pagkalos等[9]研究表明辛伐他汀類藥物可以成為組織工程骨的重要成分，能夠顯著促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化。Zhou等[10]研究表明辛伐他汀組織工程骨明顯促進(jìn)骨缺損的再生。體外試驗(yàn)顯示其可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化，并促進(jìn)成骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)。Lee等[11]研究認(rèn)為局部注射和局部植入辛伐他汀藥物復(fù)合材料均可促進(jìn)骨折愈合，局部植入辛伐他汀復(fù)合材料效果顯著。辛伐他汀是小分子化合物，常作為心血管系統(tǒng)藥物應(yīng)用于臨床。本研究將辛伐他汀吸附于生物衍生骨復(fù)合材料，辛伐他汀復(fù)合材料的力學(xué)特性未因處理程序而改變。辛伐他汀生物衍生骨材料既有同種骨材料的優(yōu)越性，又增加了他汀類藥物在局部促進(jìn)骨組織再生的作用，各種因素協(xié)同發(fā)揮作用。因此，辛伐他汀生物衍生骨是一種具備多種功能的理想支架材料。本研究構(gòu)建的辛伐他汀生物衍生骨復(fù)合材料是一種天然生物活性支架，可為骨組織工程提供有效的支架材料。

[1]Wang W,Nyman JS,Mose HE,et al.Local low-dose lovastatin de?livery improves the bone healing defect caused by NF1 loss of func?tion in osteoblasts[J].J Bone Miner Res,2010,25(7):1658-1667.

[2]Gutierrez GE,Edwards JR,Garretti IR,et al.Transdermal lovastatin enhances fracture repair in rats[J].J Bone Miner Res,2008,23(11):1722-1730.

[3]Yamasshita M,Otsuka F,Mukai T,et al.Simvastatin inhibits osteo?clast differentiation induced by bone morphogenetic protein-2 and RANKL through regulating MAPK,AKT and Src signaling[J].Regul Pept,2010,162(1-3):99-108.

[4]Nyan M，Sato D，Oda M，et al.Bone formation with combination of simvastatin and calcium sulfate in critical-sized rat calvarial defect[J].J Pharmacol Sci,2007,104(4):384-396.

[5]Bradley JD，Cleverly DG，Burns Am，et al.Cyclooxygenaoe-z inhib?itor reduces simvastatin-induced bone morphogentic protein-2 and bone formation in vivo[J].J periodontal Res,2007,42(3):267-273.

[6]Sarat SK，Singh A，garbyal RS,et al.Effect of simvastatin on frac?ture healing-an experimental study[J].Indin J Exp Biol,2007,45(5):444-449.

[7]Wang JW，Xu SW，Yang DS，et al.Locally applied simvastatin pro?motes fracture healing in ovariectomized rat[J].Osteoporos Int，2007,18(12):1641-1650.

[8]Garrett IR,Gutierez GE,Rossini G,et al.Locally delivered lovas?tatin nanoparticles enhanced fracture healing in rats[J].J Orthop Res,2007,25(10):1351-137.

[9]Pagkalos J,Cha JM,Kang Y,et al.Simvastatin induces osteogenic differentiation of murine embryonic stem cells[J].J Bone Miner Res,2010,25(11):2470-2478.

[10]Zhou Y,Ni Y,Zeng B,et al.The role of simvastatin in the osteogene?sis of injectable tissue-engineered bone based on human adi?pose-derived stromal cells and pallet-rich plasma[J].Biomaterials,2010,31(20):5325-5335.

[11]Lee Y,Schmid MJ,Marx DB,et al.The effect of local simvastation delivery strategies on mandibular bone formation in vivo[J].Bioma?terials,2008,29(12):1940-1949.

Experimental Studies on Preparation and Property of Scaffold Materials of Simvastatin Loaded Bio-Derived Bone

LIANG Jun,CAO Hongbin,XIN Jingyi

Tianjin Hospital,Tianjin 300211,China

Objective:To investigate physical and chemical properties and mechanical strength of simvastatin loaded collagen tissue engineering bone scaffold materials.Methods:Pure tissue engineering bone scaffold materials,collagen load?ed tissue engineering bone scaffold materials and simvastatin loaded tissue engineering bone scaffold materials were pro?cessed using allograft,type-I collagen and simvastatin.The morphological features,constitute components and mechanical properties of these materials were examined by scanning electron microscopy,X-rays diffraction and mechanical assay.Re?sults:Pure tissue engineering bone scaffold materials maintained natural network pore system.Collagen loaded tissue engi?neering bone scaffold materials maintained natural network pore system.The surface of network pore system was coated by collagen membrane.Simvastatin loaded collagen tissue engineering bone scaffold materials maintained natural network pore system.The surface of network pore system was coated by collagen membrane.Pure tissue engineering bone materials,colla?gen loaded tissue engineering bone materials,simvastatin loaded tissue engineering bone scaffold materials were consisted of[HA,Ca10(OH)2(PO4)6].There were no significant differences in pore size,porosity,bending strength and compressive strength between three scaffolds materials.Conclusion:There were similar physical and chemical properties and mechanical strength in simvastatin loaded tissue engineering bone scaffold materials and other two scaffold materials.Simvastatin loaded tissue en?gineering bone scaffold material is a kind of effective scaffold materials for tissue engineering bone.

artificial organs bone and bones tissue engineering biomechanics simvastatin

10.3969/j.issn.0253-9896.2012.08.005

*天津市衛(wèi)生局科研基金資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：06ky05）

300211 天津市天津醫(yī)院創(chuàng)傷骨科

（2011-06-10收稿 2011-09-07修回）

（本文編輯 陸榮展）

臨床論叢