早食李離體胚培養(yǎng)體系的建立

謝志亮，吳振旺，彭 兵，何業(yè)華

（1.溫州科技職業(yè)學院，浙江 溫州 325006；2.華南農(nóng)業(yè)大學 園藝生物技術研究所，廣東 廣州 510640）

早食李離體胚培養(yǎng)體系的建立

謝志亮1.2，吳振旺1，彭 兵2，何業(yè)華2

（1.溫州科技職業(yè)學院，浙江 溫州 325006；2.華南農(nóng)業(yè)大學 園藝生物技術研究所，廣東 廣州 510640）

以早食李胚為研究材料，分析了基本培養(yǎng)基、6-BA、?BA、種皮以及AgNO3、GA3、СH、AС等幾種添加物對李胚離體培養(yǎng)的影響，初步建立了早食李胚離體培養(yǎng)體系。李胚萌發(fā)成苗培養(yǎng)基為F14+6-BA 0.5mg/L+?BA 0.3mg/L+瓊脂7g/L+3%蔗糖，并可作為壯苗培養(yǎng)基；叢生芽增殖培養(yǎng)基為F14+6-BA 1-2mg/L+?BA 0.3mg/L+瓊脂7g/L+3%蔗糖；生根培養(yǎng)基為1/2MS+?BA 3mg/L+瓊脂7g/L+3%蔗糖。其中，早食李胚種皮的剝除與否是其萌發(fā)的關鍵。單獨添加AgNO3、GA3、СH、AС等4種附加物對早食李的萌發(fā)成苗率沒有作用，而同時添加卻能提高其成苗率。

早食李；胚培養(yǎng)；不定芽誘導；增殖

三華李是中國李P. salicina系統(tǒng)中的一個特殊栽培群體，其需冷量低、品質(zhì)較好，為我國南亞熱帶地區(qū)栽培最廣和面積最大的李優(yōu)良品種群[1]。三華李自花不結實或少量結實，自然雜交種子田間播種難萌發(fā)，即使是經(jīng)低溫、濕沙等處理后再在WPM培養(yǎng)基上播種也很難萌發(fā)。目前三華李（品種群）主要采用常規(guī)的嫁接方法進行繁殖，效率低下。利用成熟胚離體培養(yǎng)技術可大大提高胚的萌發(fā)成苗率，且不受季節(jié)等限制，能在短時間內(nèi)產(chǎn)生大量的具有優(yōu)良遺傳性狀的苗木，滿足市場的各種需求，也可進一步為組織培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)及遺傳轉化提供原始材料。因此，建立穩(wěn)定的三華李胚培養(yǎng)體系，利用生物技術手段將一些抗性、高產(chǎn)等目的基因?qū)肴A李品種中，是促進三華李品種改良進程和三華李產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一種有效手段。

本研究以三華李品種群中的早熟品種-早食李的成熟種子為材料，分析早食李成熟胚萌發(fā)的影響因子，建立早食李胚離體培養(yǎng)體系，以對三華李的工廠化組培育苗、品種改良以及種質(zhì)資源的保存等的研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

于2008年5月在華農(nóng)大園藝學院果園采取青中帶黃的早食李果實作為試驗材料。

1.2 方 法

1.2.1 消毒

將采集的果實用刀削掉外層果肉，用鐵錘沿縫合線敲開內(nèi)果皮，置于無菌接種瓶內(nèi)，放入接種臺里，用75%酒精消毒1 min，再用0.1%的升汞消毒8～10 min，最后用無菌水洗5次，取出置于無菌紙上，用滅菌過的鑷子小心將種皮剝掉，接種于培養(yǎng)基中。如種皮仍難剝除，則將其置于無菌水中放置1～2d，待種皮軟化后再剝除種皮接種。

1.2.2 基本培養(yǎng)基的篩選

以MS、1/2 MS、1/4 MS、1/8 MS、WPM、F14（分別為處理1、2、3、4、5、6）為基本培養(yǎng)基，接種后先在全黑暗條件下培養(yǎng)7 d，然后再轉到正常光條件下培養(yǎng)。

1.2.3 不同BA濃度對成熟胚培養(yǎng)的影響

以F14+7 g/L瓊脂+3%蔗糖+0.3 mg/L ?BA為培養(yǎng)基，附加不同濃度的6-BA，6-BA濃度設置為0.5，1.0，2..0，4.0，8.0 mg/L（分別為處理1、2、3、4、5），以不添加6-BA作對照，接種后先在全黑暗條件下培養(yǎng)7 d后再轉到正常光條件下培養(yǎng)。

1.2.4 添加附加物對種子萌發(fā)的影響

將剝除種皮的種子接種到分別添加不同附加物的F14培養(yǎng)基上，附加物分別為AgNO35.0 mg/L、GA35.0 mg/L、СH 500 mg/L、1%AС以及AgNO3500 mg/L+GA3500 mg/L +СH 500 mg/L+1%AС（分別為處理1、2、3、4、5），以不添加任何物質(zhì)作為對照。

1.2.5 生根培養(yǎng)

將高2 cm以上的粗壯苗接種在含不同?BA濃度的1/2MS培養(yǎng)基上。?BA濃度設置為0.1、0.3、0.9、3.0、9.0 mg/L 的5個濃度梯度（分別為處理1、2、3、4、5）。接種30 d天后進行生根率的統(tǒng)計。

1.2.6 培養(yǎng)條件與統(tǒng)計方法

培養(yǎng)室溫度為25±2℃，相對濕度保持在60%～80%，光強為1 500～3 000 LX，光照時間為14 h/d。正常光條件下培養(yǎng)指在培養(yǎng)室條件下培養(yǎng)。

接種30 d后對材料的萌動率、成苗率等情況進行觀測和統(tǒng)計。

2 結果與分析

2.1 不同基本培養(yǎng)基對胚萌發(fā)的影響

不同基本培養(yǎng)基成分、比例不同，對早食李胚的萌發(fā)率與成苗率影響也不一樣（表1）。在所供試的6種培養(yǎng)基中，早食李的萌動率以F14最高，為95.5%；以WPM最差，為75.0%。成苗率也以F14最高，為27.3%，其次為1/4 MS（26.7%），兩者間差異不顯著，最低為MS，僅13.3%。綜合考慮，早實李成熟胚培養(yǎng)以F14培養(yǎng)基最為適宜。

表1 不同培養(yǎng)基對早食李胚萌發(fā)的影響?Table 1 Effects of different culture medium on germination of “zaoshi” plum

2.2 不同BA濃度對胚萌發(fā)的影響

一定濃度的6-BA有利于早食李胚芽萌發(fā)，以0.5 mg/L 6- BA時效果最好，萌動率和成苗率分別為94.5%和77.3%，苗木長勢較好、生長粗壯。但6-BA濃度超過0.5 mg/L 時，不定芽誘導率提高，以6-BA濃度1～2 mg/L最高，不定芽誘導率可達85%以上，但不定芽較矮小，胚根逐漸褐變并死亡，且萌動率和成苗率有所下降。當6-BA濃度達到4 mg/L時，萌動率和成苗率比對照顯著下降。而當6-BA濃度達到8 mg/L時，成苗率為零。如表2所示。

故早食李胚的萌發(fā)成苗以 6-BA濃度0.5 mg/L為宜，并可作為壯苗培養(yǎng)基用。增殖培養(yǎng)時可采用6-BA濃度1-2mg/L。如圖1所示。

表2 BA濃度對早食李胚萌發(fā)的影響Table 2 Effects of different concentrations of BA on germination of “zaoshi” plum

圖1 早食李不定芽的誘導Fig. 1 Adventitious bud induction of “zaoshi” plum

2.3 不同添加物對胚萌發(fā)的影響

以F14為基本培養(yǎng)基，添加AgNO3、GA3、СH、AС等附加物不能提高早食李種胚的萌發(fā)成苗率，反而有所降低。但幾種附加物組合到一起添加時，雖降低了早食李的萌動率，但成苗率卻顯著提高。如表3所示。

表3 培養(yǎng)基中不同添加物對早食李胚萌發(fā)的影響Table 3 Effects of culture medium of different additives on germination of “zaoshi” plum

2.4 ?BA濃度對不定根發(fā)生的影響

將高于2 cm的粗壯小苗接種在含有?BA的生根培養(yǎng)基上，8天后開始有不定根的發(fā)生，剛開始時從切口處皮層開裂，乳白色的不定根逐漸發(fā)生，呈輻射狀延伸，隨后須根逐漸發(fā)生，并隨濃度的升高，不定根的數(shù)量增多，變粗壯。但不含?BA的培養(yǎng)基不發(fā)生根。從表4可知，在一定濃度范圍內(nèi)，隨?BA濃度的升高，不定根誘導率也升高，以3.0 mg/L時達到最高，為84.6%，與其他濃度相比達到顯著水平；超過此濃度，不定根的發(fā)生率反而下降。故促進早食李生根的?BA濃度以3.0 mg/L為宜。如圖2所示

表4 ?BA濃度與不定根的發(fā)生Table 4 Relations of concentration of IBA and adventitious root rate of “zaoshi” plum

圖2 早食李不定根的誘導Fig. 2 Adventitious root induction of “zaoshi” plum

2.5 煉苗及移栽

將已生根的粗壯苗移到室外鍛煉20 d左右，再逐步打開瓶蓋，2～4 d后再移栽。移栽前用清水洗除培養(yǎng)基，20%百菌清殺菌2～3 min，栽入草炭︰珍珠巖為1︰1的基質(zhì)中，澆透水，保持小苗周圍空氣相對濕度在85 %以上，溫度20～30 ℃，遮蔭網(wǎng)覆蓋。在此條件下，試管苗成活率可達70 %以上。

3 結論與討論

造成種子的休眠主要是由于種皮的不透水性、不透氣性、機械阻礙及種皮內(nèi)含有的抑制物質(zhì)[3]，種皮的不透性也將阻止種皮抑制物的滲出而阻礙種子萌發(fā)，一般胚的萌發(fā)需經(jīng)低溫處理或加進一些生長調(diào)節(jié)物質(zhì)才能打破種子的休眠[2]。種皮是抑制三華李胚萌發(fā)的關鍵因子。在實際生產(chǎn)育苗中，三華李種子其萌發(fā)率幾乎為零。在實驗室中，未剝除種皮的三華李種子（華蜜大蜜李和白脆雞麻李）在培養(yǎng)基上不萌發(fā)，種皮去除后則能達到65.9%的萌動率，即使是去皮直接種植于營養(yǎng)土中也能萌芽。

此外，不同植物對營養(yǎng)成分的需求也不同，不同培養(yǎng)基所含有的營養(yǎng)物質(zhì)組成有差別，選擇合適的培養(yǎng)基對于組織培養(yǎng)的成敗至關重要。早食李成熟胚胚培養(yǎng)以低鹽的培養(yǎng)基為好，這與陳穎等的研究結果相似[4]。但幾種低鹽培養(yǎng)基中，以F14培養(yǎng)基為最佳，這可能與其中的比值不同有關。

早食李屬于三華李品種群中的早熟品種，五月初果實成熟時采集其胚可能尚未發(fā)育完全或需要一段時間的后熟才能發(fā)育完全。因此，在培養(yǎng)過程中加入一定量的外源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)（6-BA）有利于早食李胚的萌發(fā)成苗及不定芽的分化，但苗長勢、高度等不同，應根據(jù)目的選擇合適的6-BA濃度。添加AgNO3、GA3、СH、AС等附加物不能提高早食李胚的萌發(fā)成苗率，反而有所降低，但幾種附加物同時添加卻又提高成苗率，可能與所試用的濃度、品種等有關，具體有待分析。

通過本試驗研究表明，李胚萌發(fā)成苗以F14+6-BA 0.5 mg/L+?BA 0.3 mg/L瓊脂7 g/L+3%蔗糖最為適宜，并可作為壯苗培養(yǎng)基；增殖培養(yǎng)基為F14+6-BA 1～2 mg/L+?BA 0.3 mg/L+瓊脂7 g/L+3%蔗糖；生根培養(yǎng)基為1/2MS+?BA 3 mg/L+瓊脂7 g/L+3%蔗糖。在離體培養(yǎng)中，早食李胚種皮的剝除與否是其萌發(fā)的關鍵。單獨添加AgNO3、GA3、СH、AС等4種附加物對早食李胚萌發(fā)率和成苗率沒有作用，而同時添加時卻能提高成苗率。

[1] 何業(yè)華，韓景忠，謝志亮，等. 兩個三華李新品種的選育[С]// 張加延主編:李杏資源研究與利用進展（五）．北京：中國林業(yè)出版，2008：174-176.

[2] 李會芳，許 正，楊 英，等. 影響野生櫻桃李種子萌發(fā)相關因素研究初報[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學，2007，44（1）：27-30.

[3] 王利寶，董麗芬. 油松種胚休眠特性及解除胚休眠的方法[J].中南林學院學報，2006，26（3）：19-23.

[4] 陳 穎，曹福亮，謝寅峰, 等. 5個銀杏優(yōu)良品種成熟胚離體繁殖培養(yǎng)基的選擇研究[J].西北植物學報，2004, 24( 11) :2025-2032.

Establishment of in vitro embryo culture system in Prunus salicina cv. zaoshi

X?E zhi-liang1,2,WU Zhen-wang1,PENG Bing2,HE Ye-hua2
(1.Wenzhou Vocational Сollege of Science & Technology ,Wenzhou 325006 ,Zhejiang ,Сhina ;2.?nstitute of Biotechnology for Horticuhural Сrops ,South Сhina Agricultural University ,Guangzhou 510640 ,Guangdong ,Сhina)

By taking Prunus salicina cv. zaoshi as testing materials, the effects of various additives such as basic medium, 6-BA, ?BA,seed capsule, AgNO3, GA3, СH and AС on in vitro embryo culture of P. salicina cv. zaoshi were studied, and the system of mature P.salicina cv. zaoshi embryo culture was established. The optimal medium for germination and seedling was F14+6-BA 0.5 mg/L+?BA 0.3mg/L+sugar 3%+agar 7g/L, which also was suitable for strong seeding; The optimal medium for shoot generation was F14+6-BA 1-2mg/L+?BA 0.3mg/L+sugar 3%+agar 7g/L; The optimal medium for rooting was 1/2MS+?BA 3mg/L+sugar 3%+agar7 g/L; While the decorticate of seed capsule was key factor which affected the germination of P. salicina cv. zaoshi embryo. The accessories of AgNO3,GA3, СH and AС that were only added to the additives were no effect on germination at all, but that all four accessories were added to the additives could increase the seeding rate.

Prunus salicina cv. zaoshi；embryo culture；induction of adventitious buds；proliferation

S722.1+9；S662.3

A

1673-923X (2012)05-0076-04

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(No.201003058)資助.

謝志亮(1982-)，男，碩士，助教，從事園藝植的組織培養(yǎng)、園藝植物栽培教學及生產(chǎn)技術推廣工作；電話：(0577)88429211；E-mail: zlxie06@163.con

何業(yè)華(1960-)，博士，教授；電話：(020)85288262，E-mail：heyehua@hotmail.tom

[本文編校：歐陽欽]