香樟樹新病原菌
——二年殘孔菌的形態(tài)學(xué)鑒定及ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析

鄭俊娟，商圓圓，霍存錄，方英杰，賀新生

（西南科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621010）

香樟樹新病原菌
——二年殘孔菌的形態(tài)學(xué)鑒定及ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析

鄭俊娟，商圓圓，霍存錄，方英杰，賀新生

（西南科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621010）

報道了香樟樹的一種新病原菌，對采集的標(biāo)本及其培養(yǎng)物的形態(tài)特征進行觀察，對其?TS區(qū)序列進行測定和系統(tǒng)發(fā)育分析，將所測得的序列提交至Genbank獲得序列號為JN182923。通過Blast比對獲得同屬近緣的序列后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并進行同源性分析。形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定相結(jié)合將標(biāo)本鑒定為二年殘孔菌Abortiporus biennis，由系統(tǒng)發(fā)育樹推斷，二年殘孔菌是多元進化的。

二年殘孔菌；形態(tài)特征；?TS rDNA；系統(tǒng)發(fā)育

在2009～2010年秋冬季于綿陽市江油方水鎮(zhèn)、綿陽市涪城區(qū)香樟樹樹干基部多次采集到一種殘孔菌標(biāo)本（見圖1）。本研究從采集的子實體中分離獲得純菌絲體，進行平板培養(yǎng)獲得菌落形態(tài)，在實驗室成功培養(yǎng)出子實體，對其形態(tài)特征進行觀察，確定其分類地位；測定分析其?TS序列，與基因庫(GenBank)中同屬近緣序列進行比對，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1 材料與方法

1.1 形態(tài)特征觀察

2009年11月10日在綿陽市江油方水鎮(zhèn)，在香樟樹根部采集到真菌子實體，保存在西南科技大學(xué)菌物標(biāo)本室（SWUST2009111001）。先對其外部形態(tài)特征進行描述，再取少量菌肉組織制成水浸片，在側(cè)置顯微鏡下進行顯微結(jié)構(gòu)觀察。從野生子實體中分離獲得純菌絲，進行平板培養(yǎng)獲得菌落形態(tài)。

1.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

1.2.1 供試菌株

本研究供試菌株包括25份材料(見表1)，其中二年殘孔菌Abortiporus biennis菌株分離自四川省綿陽市江油方水鎮(zhèn)生長在香樟樹根部的真菌子實體標(biāo)本，分離菌株編號Ab.1，保存在西南科技大學(xué)菌種保藏管理中心。本實驗測定了它的?TS序列，其余序列均來自基因庫(GenBank)。

表1 供試菌株Table 1 Strains used in the study

1.2.2 DNA的提取

稱取少量采樣分離培養(yǎng)的Ab.1菌株的菌絲，加液氮充分研磨后，迅速轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，用Universal DNA Genomic Extraction Kit Ver3.0 (大連TaKaRa, Сat#DV811A)按照其使用說明提取基因組DNA。

1.2.3 ?TS區(qū)域的特異性PСR擴增

選擇?TS-1和?TS-4這兩個引物擴增?TS的全長序列,它們由上海生工生物公司合成。引物序列、PСR反應(yīng)體系以及PСR反應(yīng)條件和?TS序列的測定均參考文獻[1]。

1.2.4 ?TS 序列的分析

將測得的Ab.1菌株的rDNA-?TS序列提交到美國NСB?的GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得基因號，并進行Blast比對，獲得指標(biāo)靠前的24條相似序列，將這24個菌株的rDNA序列通過Blast工具和DNAMAN軟件（6.0.40版本）進行比對分析，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。在Multiple Sequence Alignment的 Method中 選擇“ Full Alignment”和 “Try both strands”；在Output的Tree /Homology Tree中選擇“Observed Divergency”和“Toss gaps”，輸出樹形圖。樹形圖上的百分?jǐn)?shù)表示比較菌株之間的相似度。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)鑒定

該菌株子實體一年生，蓋狀，無柄或有短柄，柄側(cè)生或偏生，菌蓋單生或覆瓦狀疊生，新鮮時間軟木栓質(zhì)，味淡，干后木栓質(zhì)，質(zhì)量明顯減輕；菌蓋半圓形、圓形或扇形，單個菌蓋3～12 cm長，寬2～15 cm，厚5～11 mm；菌蓋表面新鮮時粉紅色、火烈鳥色，有不明顯的環(huán)紋，被有細而短的絨毛，干后灰白、灰褐色；邊緣新鮮時與菌蓋表面同色或顏色稍淺，干后同色，內(nèi)卷。菌肉木栓質(zhì)，木材色，厚2～8 mm。菌柄不規(guī)則，長0.1～10 cm，如果有枯葉或腐爛的木屑覆蓋，可以形成分枝狀的菌柄，粉紅色，木栓質(zhì)。子實層體近菌管狀，孔口表面新鮮時淺褐色至粉紅色，手觸后變黑色，干后木材色或淺黑褐色；不育邊緣不明顯；孔口多角形至迷宮狀，有時幾乎為菌褶狀，每毫米1～4個；管口邊緣薄，撕裂狀；菌管淺木材色，單層，木栓質(zhì)，長度3～6 mm。孢子印粉白色。孢子寬橢圓形、卵圓形，無色，光滑，大小為4.5～6.0×3.0～4.5 μm。上述形態(tài)特征與國內(nèi)外已發(fā)表的該菌的研究進行對比[2-5]，將其鑒定為二年殘孔菌Abortiporus biennis。

圖1 二年殘孔菌的子實體和菌絲體形態(tài)Fig. 1 Fruiting body and mycelium morphology of Abortiporus bienni

該菌菌絲體白色，氣生菌絲旺盛，具有明顯的爬壁性，無色素分泌；生殖菌絲管狀，透明，有明顯的鎖狀聯(lián)合。可以在瓊脂或其他固體培養(yǎng)基上直接形成子實層。在水平向上的培養(yǎng)基表面只發(fā)育子實層，不形成菌蓋。在空間位置適當(dāng)時才形成菌蓋，如垂直于地面的培養(yǎng)基表面，或向下有空間的基物表面。與培養(yǎng)皿內(nèi)污染的雜菌形成明顯的拮抗線，表明有一定的抗雜菌能力。在子實體發(fā)生過程中，在形成菌管后分泌出大量琥珀色的液滴。

圖2 菌 落Fig. 2 Colony

2.2 親緣關(guān)系比較

將標(biāo)本Ab.1測定的DNA序列提交到NСB?的Genbank數(shù)據(jù)庫獲得基因號為JN182923。該序列671 bp,其中18S rDNA部分序列14 bp，?TS1 rDNA序列267 bp，5.8S rDNA序列143 bp，?TS2 rDNA序列221 bp，28S rDNA部分序列27 bp。供比較的?TS rDNA序列長度不一致，最長為Podoscypha multizonata(EU118663) 986 bp，最短為Hypochnicium lundellii(AY781277)菌株557 bp。

利用DANMAN軟件分析25個菌株的?TS rDNA序列，得到系統(tǒng)進化樹（圖3）。與Ab.1（JN182923）親緣關(guān)系較近近的菌株是A.biennis（FJ608589）、A. biennis（EU232187）和Podoscypha multizonata（EU118663）， 與Genbank中FJ608589和EU232187序列相似度達到100%，確定Ab.1菌株是殘孔菌屬的二年殘孔菌（A. biennis），由系統(tǒng)發(fā)育樹推斷二年殘孔菌（A.biennis）是多元進化的。

3 討 論

圖3 基于?TS rDNA序列的Abortiporus系統(tǒng)進化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of Abortiporus based on ITS rDNA sequences

二年殘孔菌Abortiporus biennis(Bull.)Singer屬于菌物界Fungi，擔(dān)子菌門Basidiomycota，傘菌亞門Agaricomycotina，傘菌綱Agaricomycetes，多孔菌目Polyporales，干朽菌科Meruliaceae，殘孔菌屬Abortiporus（Murrillet al.1904）。二年殘孔菌Abortiporus biennis的同物異名有：Abortiporus distortus(Schwein.) Murrillet al.、Daedalea albidaPurton.、Grifola biennis(Bull.) Zmitr. &Malysheva.、PolyporussericellusSacc.、Polystictus rufescens(Pers.) P. Karst.、Trametesrufescens(Pers.)G.H. Otth.。主要分布在中國、日本以及西歐等國家，稀生于針葉樹上，寄生于許多種類的闊葉樹上或地下埋有腐木的地上，導(dǎo)致木材白色腐朽。生長在抗真菌能力很強的香樟樹上還是首次發(fā)現(xiàn)，造成樹葉提前發(fā)黃、落葉，生長緩慢，逐漸枯萎、死亡。世界分布廣泛：中國、日本、挪威、丹麥、瑞典、英國、澳大利亞、美國；在中國，江蘇、浙江、福建、山西、廣西、海南等地均有該菌的報道[2-3]，該菌對園林植物造成的危害也越來越嚴(yán)重，逐漸受到關(guān)注。對該菌的研究大都是對其進行形態(tài)學(xué)描述和生態(tài)分布調(diào)查[2-5]；也有研究發(fā)現(xiàn)二年殘孔菌A. biennis具有藥用價值，能夠抑制腫瘤[6]；二年殘孔菌A. biennis通過分泌草酸而對有毒的金屬氧化物有一定的耐受力[7-9]。

系統(tǒng)進化樹中所選取的對比菌株屬于不同的屬，親緣關(guān)系較近的聚類在一起，但?TS rDNA序列都在80%的同源水平上與二年殘孔菌A. biennis相似。本研究是首次將二年殘孔菌A. biennis進行詳細的形態(tài)描述、實驗室培養(yǎng)及其?TS區(qū)序列的PСR擴增測序，根據(jù)其?TS序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。對二年殘孔菌A. biennis在國內(nèi)的分布、子實體和菌落形態(tài)特征方面提供了重要的新信息，其分子結(jié)果有助于更大規(guī)模干朽菌科的系統(tǒng)發(fā)育研究，為該菌的鑒定提供可靠的依據(jù)，同時對該種病原菌的生物防治也有一定的意義。根據(jù)形態(tài)特征和分子系統(tǒng)分析相結(jié)合將Ab.1菌株鑒定為二年殘孔菌A. biennis是比較科學(xué)的。

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A new pathogenic fungi of Cinnamomum camphora: morphological identif i cation and ITS phylogenetic analysis of Abortiporus biennis

ZHENG Jun-juan, SHANG Yuan-yuan, HUO Сun-lu, FANG Ying-jie, HE Xin-sheng
(School of Life Science and Engineering, Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621010, Sichuan, Сhina)

A new pathogenic fungi of Cinnamomum camphora was reported. The morphological characteristics and microscopic observation of the pathogen were conducted. The specimen’s ?TS rDNA sequence was submitted to Genbank and acquired a gene number JN182923. Through blast comparison we got the relative sequences and made homology analysis by constructed the phylogenetic tree.Сombining traditional morphological identification and molecular identification,the ?TS rDNA sequence were determined, and ?TS rDNA system development was analyzed. The parasite was identif i ed as Abortiporus biennis and the phylogenetic tree indicates that Abortiporus biennis is probably polyphyletic．

Abortiporus biennis；morphological characteristics；?TS rDNA；phylogeny

S718.81

A

1673-923X (2012)05-0073-03

2011-11-24

西南科技大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項目（11ycjj41）

鄭俊娟（1987-）,女,江蘇丹陽人,碩士研究生,研究方向:野生蕈菌資源；E-mail:junjuan_zheng@126.com

賀新生（1965-）,男,四川金堂人,教授,主要從事食用藥用蕈菌資源研究；E-mail:hexinsheng@swust.edu.cn

[本文編校：吳 毅]