酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測水產(chǎn)品中孔雀石綠的應(yīng)用研究

沈 麗張麗君譚 攀葛 虹谷雪平

（1深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院，深圳 518055） （2深圳市三方園生物科技有限公司，深圳 518055）（3深圳市水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測中心，深圳 518172）

酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測水產(chǎn)品中孔雀石綠的應(yīng)用研究

沈 麗1*張麗君1譚 攀2葛 虹3谷雪平1

（1深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院，深圳 518055） （2深圳市三方園生物科技有限公司，深圳 518055）（3深圳市水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測中心，深圳 518172）

利用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量，研究了國產(chǎn)試劑盒檢測性能，并與高效液相色譜法進行了比較。結(jié)果表明：孔雀石綠含量在0.5 μg/kg～8 μg/kg范圍時，試劑盒具有良好線性，最低檢出限為0.16 μg/kg；試劑盒測得孔雀石綠總量的加標(biāo)回收率在71%～120%，批內(nèi)變異系數(shù)介于5.61%～18.6%；檢測鱖魚實際樣品時，試劑盒和高效液相色譜法定性判定結(jié)果一致，定量結(jié)果有所差異，試劑盒測得鱖魚樣品中孔雀石綠殘留量為37.75 μg/kg，高效液相色譜法測得結(jié)果為46.29 μg/kg，但準(zhǔn)確度偏差范圍尚符合國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局《殘留分析質(zhì)量控制》的要求。綜上所述，國產(chǎn)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒操作方便快速，靈敏度較高，重現(xiàn)性較好，適用于大量樣品的快速檢測。

水產(chǎn)品；孔雀石綠；酶聯(lián)免疫；鱖魚

孔雀石綠（MG） 是一種三苯甲烷類工業(yè)染料，曾因其價廉、高效而被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的真菌、細菌性疾病的防治，后隨其在魚體的高殘留、對人體的高致癌性作用被逐步發(fā)現(xiàn)，孔雀石綠在許多國家被嚴禁使用：歐盟及美國FDA不允許其做為獸藥用于水產(chǎn)業(yè)中，我國也將孔雀石綠列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》中。目前檢測孔雀石綠的方法主要有液/質(zhì)聯(lián)用分析法（LC-MS）、高效液相色譜法（HPLC） 和免疫學(xué)方法等。LC-MS和HPLC法具有準(zhǔn)確、重復(fù)性好、適用于定量檢測等優(yōu)點，是檢測孔雀石綠的最終確認方法，但由于其成本高，操作繁瑣，設(shè)備昂貴及操作人員需專業(yè)培訓(xùn)，實驗周期長等原因，難以滿足基層進行現(xiàn)場快速篩查的要求。國外已有高靈敏、商品化的孔雀石綠ELISA檢測試劑盒出售，但總體價格昂貴，導(dǎo)致單次檢測成本居高不下。近幾年，國內(nèi)也相繼開發(fā)了相關(guān)的孔雀石綠酶聯(lián)免疫快速試劑盒。本研究采用國產(chǎn)孔雀石綠酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測了水產(chǎn)品中殘留孔雀石綠，并與HPLC法進行比較，旨在為適合于現(xiàn)場檢測的酶聯(lián)免疫試劑盒在大規(guī)模水產(chǎn)品檢測中的實際應(yīng)用，降低快速檢測孔雀石綠的成本奠定基礎(chǔ)，這對更好地開展水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管具有十分重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司；二氯甲烷，色譜純；乙腈，色譜純；乙酸，分析純；無水硫酸鈉，分析純；正己烷，分析純?？兹甘G酶聯(lián)免疫測定試劑盒由深圳市三方圓科技有限公司提供。

微孔板酶標(biāo)儀（450 nm Thermo Multi skan spectrum）；Agitent1100高效液相色譜，美國Agitent公司；BUCHI R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；Evppendor5810R離心機；其他為國產(chǎn)常規(guī)儀器。

1.2 方法

以鱖魚為檢測對象，將鱖魚去皮，沿脊背切下肌肉塊，放入高速組織勻漿機20 000 r/min絞碎混勻。將魚樣分別進行酶聯(lián)免疫檢測和高效液相色譜測定。

1.2.1 酶聯(lián)免疫試劑盒檢測方法

樣品前處理、ELISA測定程序均參照試劑盒中提供的產(chǎn)品說明書進行：2 g樣品加提取液作用，離心得上清液，加氧化劑、正己烷萃取，離心取下層，吹干或蒸干溶劑，乙腈溶解沉淀，取適量溶解液進行酶聯(lián)免疫檢測，酶標(biāo)儀測定OD值。以標(biāo)準(zhǔn)品為對照，每個樣重復(fù)3次，所得吸光值的平均值再乘以100，得百分吸光度。

1.2.2 高效液相測定

樣品前處理、色譜柱條件、操作步驟及計算依據(jù)國標(biāo)GB/T20361-2006《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定高效液相色譜熒光檢測法》。

1.2.3 ELISA工作曲線建立方法

取 0 μg/kg、0.5 μg/kg、1 μg/kg、2 μg/kg、4 μg/kg、8 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液分別稀釋 10 倍至終質(zhì)量分數(shù)為 0 μg/kg、0.05 μg/kg、0.1 μg/kg、0.2 μg/kg、0.4 μg/kg、0.8 μg/kg，按照試劑盒說明書中酶聯(lián)免疫測定程序，測得各濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值，所得吸光值的平均值再乘以100，計算得各濃度標(biāo)準(zhǔn)品的百分吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量分數(shù)的以10為底的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，百分吸光值為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。

1.2.4 ELISA加標(biāo)回收率測定方法

稱取2.0 g陰性樣品各6份，加入50 mL聚四氟乙烯離心管中，依次加入不同體積的孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品，使得魚樣中標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量分數(shù)分別為0 μg/kg、0.5 μg/kg、1 μg/kg、2 μg/kg、4 μg/kg、8 μg/kg，按照測定各樣品百分吸光度。通過外標(biāo)法工作曲線計算回收率。

2 結(jié) 果

2.1 工作曲線相關(guān)性比較

2.1.1 ELISA檢測法工作曲線

下圖1為ELISA檢測法工作曲線。曲線方程為y=-76.002x-10.708，相關(guān)系數(shù)為 0.9 466。標(biāo)準(zhǔn)曲線中各標(biāo)準(zhǔn)品濃度對應(yīng)的百分吸光值的標(biāo)準(zhǔn)誤差（RSD） 為1.54%～16.4%。結(jié)果表明孔雀石綠在 0.5 μg/kg ～8 μg/kg 范圍具有良好線性，最低檢出限為 0.16 μg/kg。

2.1.2 高效液相-熒光法工作曲線

在高效液相色譜法測定中，配制質(zhì)量分數(shù)在分別為 0.5μg/kg、1.0μg/kg、5.0μg/kg、10.0μg/kg、20.0 μg/kg、50.0 μg/kg、100.0 μg/kg、200.0 μg/kg的孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積（y） 為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量分數(shù)（x） 為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。曲線方程為y=307.116 02x-1.99e-1，相關(guān)系數(shù)為 0.999 87。孔雀石綠在 0.5 μg/kg ～ 200 μg/kg范圍具有良好線性，檢出限為0.5 μg/kg。

圖1 ELISA測定孔雀石綠的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 高效液相色譜-熒光檢測法測定孔雀石綠的工作曲線

2.2 ELISA檢測回收率、檢出限和重現(xiàn)性

通過樣品加標(biāo)測定回收率試驗，將樣本的百分吸光值代入工作曲線，從工作曲線上讀出樣本所對應(yīng)的值，作為10的冪，乘以稀釋倍數(shù)，則為樣品中所含孔雀石綠的量。測得孔雀石綠總量的加標(biāo)回收率在71%～120%，批內(nèi)變異系數(shù)介于5.61%～18.6%，重現(xiàn)性基本能滿足要求，見表1。

表1 孔雀石綠及其代謝物加標(biāo)回收率測定結(jié)果

2.3 鱖魚樣品測定結(jié)果

鱖魚樣品經(jīng)前處理后，同時進行ELISA和高效液相熒光法檢測，檢測結(jié)果見表2。檢測結(jié)果顯示，高效液相熒光檢測法和ELISA法對鱖魚中陰性樣品的判斷一致，同為未檢出；陽性樣品的檢測結(jié)果在數(shù)值上有一定的差距，但準(zhǔn)確度偏差范圍尚符合國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局《殘留分析質(zhì)量控制》的要求，因此可適用于大量樣品的快速初檢。

表2 鱖魚樣品中孔雀石綠測定結(jié)果

3 討論

酶聯(lián)免疫檢測試劑盒是以免疫學(xué)方法為基礎(chǔ)的快速檢測方法，具有快速、靈敏、價格低廉、適合現(xiàn)場大規(guī)模檢測等優(yōu)點，是目前公認的最適合作為藥物殘留檢測的方法之一。目前市面上所售孔雀石綠快速測定試劑盒種類很多，國內(nèi)外的都有。大致原理基本相似。部分試劑盒分測顯、隱性孔雀綠，但多數(shù)測總孔雀石綠。本研究中所用試劑盒采用競爭酶標(biāo)免疫法，同時把隱性孔雀石綠氧化成孔雀石綠，測得總的孔雀石綠殘留。

通過酶聯(lián)免疫試劑盒法和HPLC法檢測樣品中孔雀石綠殘留量比較發(fā)現(xiàn)，試劑盒法操作步驟簡單，用時較短，易于高通量檢測，但工作曲線和實際樣品檢測結(jié)果表明，試劑盒法的準(zhǔn)確度與HPLC相比略低，試劑盒法工作曲線的相關(guān)系數(shù)為0.9 466，HPLC法相關(guān)系數(shù)為0.99 987；陽性樣品兩者所測得的結(jié)果有一定的差距，可見儀器檢測法的準(zhǔn)確度比試劑盒法高，主要原因是目前酶聯(lián)免疫檢測過程中以人工加樣、洗板為主，相比儀器而言，操作過程的不穩(wěn)定性較大，若能采用全自動加樣洗板，應(yīng)會增加此方法的準(zhǔn)確度。本試劑盒的檢測限雖然同國外檢測試劑盒0.082 g/kg還不能相比，但與HPLC的檢測限比較，已經(jīng)能夠滿足GB/T19857-2005規(guī)定孔雀石綠的測定方法檢測限的要求。測得孔雀石綠總量的加標(biāo)回收率在71%～120%，批內(nèi)變異系數(shù)介于5.61%～18.6%，因此試劑盒法的重現(xiàn)性能夠滿足要求。另外研究中通過10次空白測定，計算3倍標(biāo)準(zhǔn)差，得到最低檢出限為0.16 g/kg，檢測靈敏度為0.05 g/kg，基本能滿足簡單判斷水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留陰、陽性樣品的需求。檢測實際樣品時，試劑盒與HPLC法對陰性樣品檢出結(jié)果一致。

綜上所述，本次應(yīng)用的國產(chǎn)試劑盒能夠滿足目前國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定檢測孔雀石綠的基本要求，由于其操作簡單、快速、低成本，適于目前水產(chǎn)品快速檢測迫切需要。但是，同高效色譜-熒光檢測方法一樣，在樣品前處理步驟如均質(zhì)程度、計算方法上還需要進一步試驗研究，優(yōu)化條件。加標(biāo)回收率結(jié)果也提示在均質(zhì)程度、酶標(biāo)板的處理、樣品的保存、加樣操作等環(huán)節(jié)都需要更多的探討。與國標(biāo)測定結(jié)果相比，還需要在操作程序等方面進行細致的研究改進，降低標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)的不確定度，以提高檢測的精準(zhǔn)度。

［1］ 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.國家標(biāo)準(zhǔn)和管理委員會.GB/T20361-2006水產(chǎn)品種孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定高效液相色譜熒光檢測法［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2006.

［2］ 楊金蘭，陳培基，黎智廣,等.高效液相色譜法測定水產(chǎn)品孔雀石綠殘留量的優(yōu)化研究［J］.南方水產(chǎn)，2010，6（4）：43-48.

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Application on enzyme-linked immunosorbent assay for determination of malachite green in aquatic products

SHENLi1*ZHANGLi-jun1TANPan2GE Hong3GUXue-ping1
1（Shenzhen polytechnic，Shenzhen 518055，China）2（Shenzhen triphil biotechnologyCo.，Ltd，Shenzhen 518055，China）3（Shenzhen aquatic products qualitysupervision and testingcenter，Shenzhen 518030，China）

Malachite green（MG）residues in aquatic products were determined by using ELISA kit.The performance of domestic reagent kit was studied and compared with high performance liquid chromatography method.The results showed that：this kit has good linearity while the content of the malachite green was in the range of 0.5 μg/kg～ 8 μg/kg，the minimum detectable limit was 0.16 μg/kg.The total recovery rate was 71% ～120%measured by malachite green kit，and the batch coefficient of variation was between 5.61% ～ 18.6%.On detecting of actual samples of mandarin fish，this kit has the same result with high-performance liquid chromatography method,while the quantitative has a varied result.The malachite green residue measured bysample kit was 37.75 μg/kg，while that measured by high performance liquid chromatography was 46.29 μg/kg.The accuracy deviation range was in line with the State Quality Supervision，Inspection and Quarantine Administration of the“quality control”requirements for residue analysis.To sum up，homemade enzyme-linked immunity detection reagent box is convenient，fast operation，high sensitivity，and good repeatability.It is suitable for the rapid detection of a large number of samples.

aquatic products；malachite green（MG）；enzyme-linked immunosorbent assay；mandarin fish

TS207.4

A

1673-6004（2012）02-0058-04

* 沈麗，女，1972年出生，1995年畢業(yè)于華南師范大學(xué)，碩士，講師

2012-03-20