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    IgA腎病患者腎組織內(nèi)synaptopodin的表達(dá)及意義*

    2012-01-03 05:27:58陳道軍林書典符克英
    重慶醫(yī)學(xué) 2012年30期
    關(guān)鍵詞:光密度腎小球硬化

    陳道軍,吳 明,詹 鋒,林書典,符克英,韓 輝

    (海南省人民醫(yī)院,???570311)

    IgA腎病(IgAN)是一種多病因引起的以腎小球系膜區(qū)IgA沉積為主的系膜增生性腎小球腎炎,已成為全球最常見的原發(fā)性腎小球疾病[1]。臨床和病理表現(xiàn)多樣化,個(gè)體預(yù)后差異懸殊,10%~20%的成年患者在10年內(nèi)可進(jìn)展為終末期腎臟病[2]。迄今為止尚無(wú)一種分型能準(zhǔn)確地反映患者的臨床實(shí)際情況,各個(gè)分型之間也很難達(dá)成一致。尋找腎臟病理組織中新的生物標(biāo)志物以期預(yù)測(cè)IgAN病情的進(jìn)展和預(yù)后,指導(dǎo)臨床治療將成為此研究的目的。作者選取在本院經(jīng)腎活檢明確診斷為IgAN患者的腎活檢組織標(biāo)本作為研究對(duì)象,應(yīng)用間接免疫熒光技術(shù),觀察synaptopodin在IgAN患者腎組織中的表達(dá),并探討其在腎組織分布特征、進(jìn)行相關(guān)分析,推測(cè)病情預(yù)后。

    1 資料與方法

    1.1一般資料 回顧分析2003年6月至2009年9月在本院經(jīng)腎活檢明確診斷為IgAN患者的202例腎活檢組織標(biāo)本,所有病例由一位高級(jí)職稱病理醫(yī)師獨(dú)立閱片。所有標(biāo)本已經(jīng)過(guò)苦味酸液固定、石蠟包埋,2 μm厚度切片,均行蘇木素伊紅染色(HE)、過(guò)碘酸雪夫反應(yīng)(PAS)、六胺銀染色(PASM)和馬松三色染色(Masson),結(jié)合IgA等免疫熒光檢測(cè)后已確診為IgAN,所有染色標(biāo)本均在冰箱中存放。復(fù)習(xí)病歷,排除狼瘡性腎炎、紫癜性腎炎及慢性肝病等繼發(fā)性IgAN病例。所有病例在當(dāng)初確診時(shí)已按Lee分級(jí)系統(tǒng)[3-5]分為Ⅰ~Ⅴ級(jí)(分類),按分層抽樣的原則,用隨機(jī)號(hào)碼表抽取樣本,從各級(jí)中分別隨機(jī)選取10例標(biāo)本。分5組,總共標(biāo)本為50例。

    1.2方法

    1.2.1資料分析 對(duì)選取50例樣本,從冰箱中調(diào)出已染色的病理標(biāo)本,重新通過(guò)光鏡觀察,參照Katafuchi積分方法[6],依據(jù)病變程度進(jìn)行積分。

    1.2.2間接免疫熒光染色 從冰箱中調(diào)取出已選定的石蠟包塊,脫蠟、水洗、熱修復(fù)抗原、加一抗(Mouse Anti-IgG Synaptopodin)4 ℃ 過(guò)夜。PBS(pH7.2~7.6)洗滌2 min×3次。滴加二抗(1∶40稀釋),F(xiàn)ITC標(biāo)記的兔抗小鼠IgG,37 ℃30 min。PBS(pH7.2~7.6)洗滌2 min×3次。

    1.2.3每份腎臟病理組織同時(shí)行陰性對(duì)照。

    1.2.4熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

    1.2.5分析

    1.2.5.1熒光圖片拍照 用免疫熒光顯微鏡觀察(×200)。把樣品放到載物臺(tái)上,快速選擇視野,每視野有一個(gè)完整的腎小球,選擇5個(gè)視野,立即拍照,在拍攝熒光照片時(shí),確保每張照片的拍攝條件完全一致。

    1.2.5.2圖片分析 對(duì)所得的照片用Imagerpro6.0圖像分析軟件進(jìn)行定量分析腎組織中synaptopodin的表達(dá)情況,測(cè)量每個(gè)腎小球截面總的積分光密度值(IOD SUM)及所測(cè)腎小球截面的面積(area SUM),計(jì)算出平均光密度值[mean density=(IOD SUM)/(area sum)][7-8]。每例腎組織mean density由5個(gè)視野的相片經(jīng)圖像分析后取平均值。

    1.3主要試劑及來(lái)源 synaptopodin 一抗(Mouse Anti-IgG Synaptopodin)購(gòu)自美國(guó)Fitzgerald Industries International公司。二抗(1∶40稀釋),F(xiàn)ITC標(biāo)記的兔抗小鼠IgG 購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

    1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)結(jié)果計(jì)量資料列表來(lái)顯示,因所有的病例按Lee分級(jí)分為Ⅰ~Ⅴ級(jí)為多個(gè)獨(dú)立樣本的等級(jí)計(jì)量資料,所以,5組腎組織中Synaptopodin所表達(dá)的平均光密度值、Katafuchi積分進(jìn)行組間比較將采取Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn),通過(guò)觀察平均秩次(mean rank)來(lái)判斷組間數(shù)據(jù)變化。對(duì)synaptopodin所表達(dá)的平均光密度值與Katafuchi積分進(jìn)行相關(guān)分析。采用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1腎組織中synaptopodin所表達(dá)的平均光密度值、Katafuchi積分進(jìn)行組間比較 各組的平均光密度值見表1,經(jīng)Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn),從Ⅰ~Ⅴ級(jí)的平均秩次分別為44.30、35.30、26.15、16.25、5.50,H值為44.026,P<0.01;可認(rèn)為5組的平均光密度值有差異,可看出隨著病情的加重,synaptopodin的表達(dá)逐漸減少,見表2。

    表1 各組間synaptopodin所表達(dá)的平均光密度值

    5組樣本通過(guò)光鏡觀察,參照Katafuchi積分方法,依據(jù)病變程度進(jìn)行積分,經(jīng)Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)結(jié)果:從Ⅰ~Ⅴ級(jí)的平均秩次分別為7.00、16.60、23.80、34.60、45.50,H值為42.983,P<0.01;可認(rèn)為5組的Katafuchi積分值有差異,可看出隨著病情的加重,Katafuchi積分值遂漸增大,見表2。

    表2 平均光密度及Katafuchi積分的各組平均秩次

    2.2所有選取病例的腎臟組織中平均光密度值與Katafuchi 病理評(píng)分值間的相關(guān)性分析 通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)的Spearman相關(guān)分析,r=-0.992,P<0.01,故認(rèn)為所有選取的病例,腎臟組織中synaptopodin蛋白所表達(dá)的平均光密度值與Katafuchi 病理評(píng)分值之間呈負(fù)的直線相關(guān)。

    圖1 所有病例的平均光密度與Katafuchi積分

    3 討 論

    Barisoni等[9]報(bào)道了synaptopodin在局灶性節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)和HIV相關(guān)性腎病表達(dá)下調(diào),而在正常兒童與MCD患者間無(wú)差別。Kemeny等[10]觀察到在原發(fā)性FSGS早期階段synaptopodin即消失。楊琪等[8]研究發(fā)現(xiàn),synaptopodin表達(dá)從健康人、微小病變腎病(MCD)、IgAN、系膜增殖性腎炎(MsPGN)到局灶節(jié)段性FSGS依次下降,由此推斷它的變化影響足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能,對(duì)腎小球疾病的進(jìn)展有重要作用。但是,對(duì)于synaptopodin的表達(dá),目前,尚無(wú)關(guān)于IgAN病程的研究,synaptopodin能否作為反應(yīng)IgAN病理程度的一項(xiàng)指標(biāo),本實(shí)驗(yàn)給予了解答。

    本研究發(fā)現(xiàn),synaptopodin沿腎小球毛細(xì)血管袢呈顆粒狀、線狀表達(dá),在硬化區(qū)無(wú)表達(dá);從表1經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后可見從Ⅰ~Ⅴ級(jí)5組的IgAN患者,腎組織中synaptopodin所表達(dá)的平均光密度逐漸減少,也提示了IgAN患者腎組織中synaptopodin所表達(dá)的平均光密度值與Lee分級(jí)一樣可以反應(yīng)病情的嚴(yán)重程度,隨著病情的加重,synaptopodin的表達(dá)逐漸減少。Katafuchi積分法[6]也可以反應(yīng)出IgAN病情的變化,從表2經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后可見,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也符合此變化,隨著病情的加重,Katafuchi積分的分值也逐漸增加。從圖1中可見,IgAN病程中腎組織內(nèi)synaptopodin所表達(dá)的平均光密度與Katafuchi積分呈反向相關(guān)。

    足細(xì)胞是維持腎小球?yàn)V過(guò)膜結(jié)構(gòu)和功能正常的主要細(xì)胞之一。而足細(xì)胞特殊結(jié)構(gòu)的維持主要依賴于以肌動(dòng)蛋白為主的細(xì)胞骨架系統(tǒng)和足細(xì)胞中表達(dá)的特異性蛋白分子。足細(xì)胞減少是疾病活動(dòng)性的重要標(biāo)志[11]。Mundel和Stuart[12]總結(jié)了各種因素引起足細(xì)胞損傷的原因:(1)裂孔隔膜復(fù)合物及脂筏的異常;(2)GBM或足細(xì)胞-GBM相互作用的影響;(3)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架及其與α-actinin-4的聯(lián)系破壞;(4)足細(xì)胞喪失其表面的電荷屏障。而在actin細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白中有一種由YNPO基因編碼synaptopodin,該基因含3個(gè)外顯子。synaptopodin是一種與肌動(dòng)蛋白微絲緊密相連的富含脯氨酸的線狀蛋白。足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能之間有著密切的因果聯(lián)系,足細(xì)胞具有對(duì)抗腎小囊內(nèi)張力的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。synaptopodin和α-actinin-4可以與足細(xì)胞表達(dá)的緊密連接蛋白MAGI-1相互作用而與肌動(dòng)蛋白骨架連接[13],其基因的突變或缺失可以導(dǎo)致足細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變,引起蛋白尿和腎小球硬化的發(fā)生。足細(xì)胞的再生能力有限,當(dāng)足細(xì)胞損傷時(shí),足細(xì)胞只能通過(guò)有限的增生能力代償缺失的足細(xì)胞。當(dāng)損傷進(jìn)一步加重時(shí),足細(xì)胞從腎小球基底膜上剝脫的速度超出了足細(xì)胞的代償能力,使腎小球基底膜部分區(qū)域裸露,腎小球?yàn)V過(guò)膜的完整性遭到破壞。足細(xì)胞損傷后數(shù)量減少將導(dǎo)致腎小球硬化[14]。

    在IgAN腎小球固有細(xì)胞的研究方面,以往人們重點(diǎn)關(guān)注在系膜細(xì)胞的病變,目前,越來(lái)越多的腎臟病學(xué)者對(duì)腎小球足細(xì)胞在腎病中的變化及意義進(jìn)行深入研究。Gagliardini和Benigni[15]發(fā)現(xiàn)IgAN的nephrin、podocin、podoplaninm表達(dá)減少。IgAN是一組臨床綜合征,臨床表現(xiàn)為腎病綜合征樣改變,病理上也可表現(xiàn)有新月體腎炎或硬化性腎炎,臨床表現(xiàn)多樣性。Habib等[16]研究顯示,IgAN時(shí)蛋白尿多少是影響預(yù)后的重要因素,無(wú)蛋白尿的患者預(yù)后良好。由于發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,目前,缺乏病因性治療手段,IgAN治療現(xiàn)狀并不令人滿意。很多研究都致力于尋找與預(yù)后或治療相關(guān)的組織學(xué)危險(xiǎn)因素。腎臟病理表現(xiàn)則能夠提供更多的信息。除了較為公認(rèn)的Haas和Lee分級(jí)系統(tǒng),Katafuchi積分法[6]及其他多種半定量評(píng)分系統(tǒng)也得到了越來(lái)越多的應(yīng)用。然而,迄今為止尚無(wú)一種分型能準(zhǔn)確地反映患者的臨床實(shí)際情況,各個(gè)分型之間也很難達(dá)成一致。傳統(tǒng)的Lee分級(jí)或Katafuchi積分存在有較大的人為主觀因素,不利于病情精確的評(píng)估及預(yù)測(cè),特別是對(duì)于個(gè)體患者更不利于療效的觀察。

    對(duì)于一些局灶節(jié)段性增生硬化型IgAN,其非硬化腎小球的病理形態(tài)呈輕微病理改變,傳統(tǒng)的Lee分級(jí)或Katafuchi積分更不能反映病情的嚴(yán)重程度,診斷時(shí)可能均被列為Ⅰ級(jí)IgAN或Katafuchi積分較低,但局灶節(jié)段性增生硬化型IgAN預(yù)后并不樂(lè)觀,甚至臨床上可表現(xiàn)為大量蛋白尿。Yang等[17]對(duì)MCD患兒18例,DMH患兒7例,F(xiàn)SGS患者13例和正常兒童7例的腎組織進(jìn)行免疫組化分析,并且用計(jì)算機(jī)圖像分析法作定量研究,得出以下結(jié)論:從MCD到FSGS,snaptopodin的表達(dá)依次減少,尤其在MCD和FSGS之間synaptopodin的表達(dá)存在顯著差異??梢?,腎組織中synaptopodin的定量分析可對(duì)局灶節(jié)段性增生硬化型IgAN進(jìn)行區(qū)分,synaptopodin所表達(dá)的平均光密度值的變化,可反應(yīng)出IgAN病情。

    通過(guò)熒光顯微鏡對(duì)腎組織中synaptopodin的觀察并采用圖像分析軟件對(duì)其進(jìn)行具體的量化評(píng)估。synaptopodin所表達(dá)的平均光密度值更能具體及客觀地判斷IgAN病情的變化及評(píng)估預(yù)后,同時(shí)可以觀察療效。也為IgAN的研究提供一種新的指標(biāo)。

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