葛根素注射液對大鼠急性視網(wǎng)膜光損傷Cyt-c,Caspase-3表達的影響

黃秀蓉 鄧小紅 李楠 陳莉平 劉小紅 余蓉

近30年來,隨著眼科光學診療器械應用的日益增多,人們對各種眼科光學診療器械光源導致的視網(wǎng)膜損傷等問題進行了較深入的研究?，F(xiàn)代研究表明[2],眼科常用的診療器械如裂隙燈、間接檢眼鏡、手術顯微鏡等均可造成視網(wǎng)膜光損傷。研究表明視網(wǎng)膜光損傷的病理過程主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜光感受器細胞的凋亡[3],是一種退行性病變過程。 有學者報道,葛根素可減輕氧化損傷,抑制細胞凋亡[4]。本實驗采用顯微鏡所致大鼠急性視網(wǎng)膜光損傷模型作為對象,通過視網(wǎng)膜病理形態(tài)學觀察、組織生化學檢查等手段,從形態(tài)學、生化學等方面研究葛根素注射液對視網(wǎng)膜急性光損傷修復的影響,并探討其對視網(wǎng)膜的保護作用。

1 實驗方法

1.1分組方法 48只SD大鼠購回馴養(yǎng)1周后,隨機選取12只大鼠24眼為正常對照組(簡稱正常組),另36只大鼠72眼進行急性光損傷造模,造模成功后隨機分為模型對照組(簡稱模型組)、高劑量治療組(簡稱高劑量組)、低劑量治療組(低劑量組),每組12只動物,24只眼。

1.2造模方法 光照前充分暗適應24小時,大鼠按30mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射全麻,雙眼愛爾凱因表麻,阿托品眼液充分散瞳,置于手術顯微平臺上,分別照射左右眼。光照強度為22000±1000lux(用ST-III型光度計測定),距角膜距離為150±3mm,垂直照射大鼠瞳孔,照射時間為30 分鐘,光照過程中角膜完全暴露,間斷角膜滴水濕潤眼球表面;室溫控制在21～24℃左右;全部照射完后再次暗適應24小時。

1.3給藥方法 高劑量組:葛根素成人日用量20倍,兌生理鹽水尾靜脈注射(168mg/kg);低劑量組:葛根素成人日用量5倍,兌生理鹽水尾靜脈注射(42mg/kg);正常組:等容量生理鹽水,尾靜脈注射;模型對照組:給等容量生理鹽水,尾靜脈注射。每日1次,連續(xù)給藥1周。

1.4觀察指標及測試方法：給藥1周后處死動物,速取右眼,進行視網(wǎng)膜光鏡及免疫組化檢查。

1.4.1HE染色 動物處死后摘除眼球,并在手術顯微鏡下去除角膜、晶體及玻璃體后,立即放入10%中性福爾馬林溶液中固定48小時,經(jīng)逐級酒精脫水,二甲苯透明、浸臘,石蠟包埋。經(jīng)視乳頭矢狀面縱向做4～5μm厚的切片,HE染色;在Mias-2000圖形分析系統(tǒng)下觀察,記錄200倍鏡下視網(wǎng)膜外核層連續(xù)5個視野的面積和外核層細胞核的含量。

1.4.2Cyt-c、Caspase-3表達 首先將SP法染色切片在10×10低倍視野下進行全面觀察,尋找視網(wǎng)膜內(nèi)Cyt-c、Caspase-3陽性物質(zhì)最豐富區(qū)域然后在10×20中倍視野下選擇5個熱點區(qū),采用MIAS-2000型圖像分析系統(tǒng)測量各個指標陽性物質(zhì)的面積、平均光密度、積分光密度和平均黑度,表示它們的含量。鏡下觀察Cyt-c、Caspase-3陽性物質(zhì)棕褐色至淡黃色,呈細絲狀或者細顆粒狀,主要表達部位在視網(wǎng)膜細胞胞漿內(nèi)。

2 結果

2.1對大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學影響

(1)正常組 視網(wǎng)膜結構層次分明,光感受器細胞視桿內(nèi)、外節(jié)排列整齊規(guī)則,分界清晰,內(nèi)、外核層排列緊密,染色均勻,細胞形態(tài)規(guī)整。

(2)模型組 視網(wǎng)膜外核層變薄,細胞排列較正常組稀疏,出現(xiàn)較多染色不規(guī)則或破碎的細胞核。內(nèi)外節(jié)排列紊亂,分界欠清,出現(xiàn)不規(guī)則淡染區(qū)。

(3)治療組 高劑量組:同模型組相比,無明顯改變,外核層變薄,細胞排列稀疏,內(nèi)外節(jié)排列紊亂,分界不清。低劑量組:視網(wǎng)膜外核層較模型組增厚,細胞排列致密。

各組間視網(wǎng)膜外核層HE染色結果比較

△與正常組比較:P<0.05;*與模型組比較:P<0.05

上表提示:模型組、高劑量組的積分光密度、面積與正常組比較,均明顯低于正常組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);低劑量組與模型組比較,面積、積分光密度增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2葛根素注射液對大鼠視網(wǎng)膜Cyt-c表達的影響

正常組視網(wǎng)膜外核層細胞漿中Cyt-c陽性物質(zhì)含量較少。模型組視網(wǎng)膜外核層細胞漿中Cyt-c陽性物質(zhì)含量較多。用藥各組視網(wǎng)膜外核層細胞漿中Cyt-c陽性物質(zhì)有不同程度減少,檢測結果見下表:

葛根素注射液對大鼠視網(wǎng)膜Cyt-c表達的影響比較

與正常組比較:△P<0.05;△△P<0.01與模型對照組比較:*P<0.05;**P<0.01

上表提示:模型對照組與治療組的Cyt-c面積、積分光密度、平均黑度及平均光密度均高于正常組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);高劑量組與模型對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);低劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示低劑量組葛根素注射液具有使光損傷后大鼠視網(wǎng)膜Cyt-c含量降低的作用。

2.3葛根素注射液對大鼠視網(wǎng)膜Caspase-3表達的影響

正常組視網(wǎng)膜外核層細胞漿中Caspase-3陽性物質(zhì)含量較少。模型組視網(wǎng)膜外核層細胞漿中Caspase-3陽性物質(zhì)含量較多。用藥各組視網(wǎng)膜外核層細胞漿中Caspase-3陽性物質(zhì)有不同程度減少,檢測結果見下表:

葛根素注射液對大鼠視網(wǎng)膜Caspase-3表達的影響的比較

與正常組比較:△P<0.05;△△P<0.01與模型組比較:*P<0.05;**P<0.01

上表提示:模型組與治療組的Caspase-3蛋白酶表達的面積、積分光密度、平均黑度及平均光密度均明顯高于正常組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);高劑量與模型組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);低劑量與模型組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示:低劑量組葛根素注射液 具有使光損傷后大鼠視網(wǎng)膜Caspase-3的表達降低的作用。

3 討論

葛根素成品制劑主要有葛根素注射液,葛根黃酮片等。近年來國內(nèi)學者對葛根素的藥理作用和臨床應用做了大量的研究:葛根素具有降壓、擴張冠狀動脈和腦血管抗血小板凝聚等作用,主要用于治療冠心病、高血壓病、糖尿病[5,6]等。同時,葛根素治療眼科疾病的驗案也屢有報道,主要用于治療視網(wǎng)膜動脈阻塞、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、糖尿病視網(wǎng)膜病變以及青光眼[7]等。視網(wǎng)膜光損傷及視網(wǎng)膜變性疾病如視網(wǎng)膜色素變性都是一種退行性病變過程,表現(xiàn)為視網(wǎng)膜感光細胞的凋亡。有研究表明:葛根素對氧自由基有清除作用,可減輕氧化損傷,抑制細胞凋亡,并能預防性對抗過氧化氫引起的氧化性損傷[4,8]。

本實驗結果顯示①葛根素注射液可降低急性視網(wǎng)膜光損傷視細胞Cyt-c的表達水平,提示葛根素注射液對視細胞損傷的保護作用很可能通過抑制細胞表達Cyt-c而實現(xiàn)的,但具體機制還有待以后進一步研究。② 葛根素注射液低劑量組Caspase-3呈較明顯下降趨勢,與模型組比較有顯著性差異,提示葛根素注射液可能通過降低凋亡因子Caspase-3的表達,最終達到有效拮抗光刺激誘發(fā)的光感受器細胞的凋亡。

綜上所述,葛根素注射液可減輕視網(wǎng)膜光損傷。其機制主要為:通過調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜細胞凋亡相關基因減少視網(wǎng)膜中Cyt-c、Caspase-3的表達,從而抑制視網(wǎng)膜細胞凋亡,起到了保護視網(wǎng)膜光感受器細胞的作用。

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