實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用

毛文捷，鄒盛華，張麗水，黃明翔，戴臘梅（福建省福州市肺科醫(yī)院 350008）

實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（FQ－PCR）技術(shù)于1996年由美國應(yīng)用生物（Applied Biosystems）公司推出，較常規(guī)PCR（end－point PCR）不同，可在PCR指數(shù)擴增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強弱的變化來即時測定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量，不需要取出PCR產(chǎn)物進行分離。本院于2007年從美國Applied Biosystems公司引進該技術(shù)，應(yīng)用于結(jié)核病的臨床診斷。本研究對189例臨床診斷肺結(jié)核患者的痰液進行FQ－PCR檢測、BACTEC 960培養(yǎng)和涂片抗酸染色，并對結(jié)果進行對比分析，探討FQ－PCR在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2010年1月至2010年3月住院的經(jīng)細菌學確診的肺結(jié)核患者189例，其中男102例，女87例，年齡18～75歲，平均33.8歲。其他肺部疾病患者94例，其中肺炎19例，非結(jié)核分枝桿菌肺病20例，支氣管擴張24例，肺癌31例。另取門診健康體檢者20例作為對照組，其中男女各10例，年齡20～55歲。

1.2 儀器與試劑 美國應(yīng)用生物（Applied Biosystems）公司生產(chǎn)的ABI7300熒光定量擴增儀，結(jié)核分枝桿菌核酸擴增PCR熒光檢測試劑盒為中山大學達安基因股份有限公司生產(chǎn)，美國BD公司BACTEC 960全自動分枝桿菌檢測儀及配套試劑，奧林巴斯顯微鏡，抗酸染色液（自制）。質(zhì)控菌株：結(jié)核分枝桿菌（ATCC27294）。

1.3 方法 189例肺結(jié)核患者采集早晨痰液標本3份，分別進行FQ－PCR檢測、涂片抗酸染色鏡檢及BACTEC 960培養(yǎng)。其他肺部疾病患者94例及健康體檢者20例采集晨痰標本1份進行A組實驗。

1.3.1 PCR檢測 （1）痰液中加入4倍體積的4%NaOH，搖勻，室溫下放置30min左右液化，取1.0 mL至離心管中，再加入0.5 mL 4%NaOH，室溫放置10min后15 000 r／min離心5min。去上清液，沉淀加無菌生理鹽水1 mL打勻，15 000 r／min離心5min，再重復一次，沉淀加50μL DNA提取液，置沸水浴10min。10 000 r／min離心5min，取上清液2μL做PCR。取單管單人份PCR反應(yīng)管若干，加入處理后樣品2μL，8 000 r／min離心5 s。將各反應(yīng)管放入PCR儀，按下列條件擴增：93℃2min；93℃45 s，55℃120 s，10個循環(huán)；置33℃保溫，迅速逐個將反應(yīng)管放入熒光檢測儀，讀取并記錄讀數(shù)A0。熒光激發(fā)波長為487 nm，檢測波長為525 nm。最后按93℃45 s，55℃120 s，30個循環(huán)；置33℃保溫。（2）反應(yīng)結(jié)束后保存檢測數(shù)據(jù)文件。根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)baseline的start值（2～4）、stop值（7～9）以及Threshold值，最后到reporter窗口下記錄儀器自動分析計算出的Ct值。（3）結(jié)果判定。在實驗有效的前提下根據(jù)Ct值判定陰陽性，Ct值大于或等于30為陰性，Ct值小于30為陽性。

1.3.2 涂片抗酸染色 所有送檢的痰標本嚴格按照《結(jié)核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》操作［1］，每份標本涂片3張，其中只要有1片為陽性即統(tǒng)計為陽性。

1.3.2 BACTEC 960培養(yǎng) 所有送檢的痰標本嚴格按照BACTEC 960操作規(guī)程，陰性報告時間設(shè)定為42 d。

1.4 統(tǒng)計學處理 使用SPSS13.0進行統(tǒng)計計算，采用χ2檢驗方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

189例肺結(jié)核患者的痰液FQ－PCR檢測陽性者123例，BACTEC 960培養(yǎng)陽性者120例，兩者同時陽性的為107例，F(xiàn)Q－PCR檢測陽性而BACTEC 960培養(yǎng)陰性為16例，PCR檢測陰性而BACTEC 960培養(yǎng)陽性為13例。涂片抗酸染色陽性76例，F(xiàn)Q－PCR和BACTEC 960培養(yǎng)均為陽性（表1）。94例其他肺部疾病患者及20例健康對照FQ－PCR檢測均為陰性，特異度為100.0%。

表1 3種方法檢測結(jié)果對比

3 討 論

PCR技術(shù)是一種先進的基因診斷方法，在肺結(jié)核的臨床診斷中也得到了廣泛應(yīng)用。但是因為PCR污染問題而導致假陽性率高，一度引起人們的懷疑。自從1996年美國應(yīng)用生物（Applied Biosystems）公司推出FQ－PCR技術(shù)，該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR（end－point PCR）相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點［2］。

本研究采用FQ－PCR技術(shù)，利用一對結(jié)核分枝桿菌特異性引物和一條結(jié)核分枝桿菌特異性熒光探針，配以PCR反應(yīng)液、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）、4種核苷酸單體（d NTPs）等成分，用PCR體外擴增法檢測結(jié)核分枝桿菌DNA，做定量檢測，定性報告，使結(jié)果更準確。肺結(jié)核患者FQ－PCR檢測敏感度為65.1%（123／189），94例其他肺部疾病患者及20例健康對照FQ－PCR檢測均為陰性，提示特異度為100.0%。

結(jié)核病診斷的金標準是檢出痰液中的結(jié)核分枝桿菌，傳統(tǒng)的方法是痰培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌或痰涂片抗酸染色發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌，F(xiàn)Q－PCR技術(shù)則是檢測痰液標本中結(jié)核分枝桿菌DNA的含量。FQ－PCR 敏感度最高為 65.1%（123／189），BACTEC 960培養(yǎng)法、涂片抗酸染色分別為63.5%（120／189）和40.2%（76／189）。FQ－PCR與抗酸染色比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝23.44，P＜0.01），而與BACTEC960培養(yǎng)比較無統(tǒng)計學意義（χ2＝0.10，P＞0.05）。

FQ－PCR直接檢測痰液標本中結(jié)核分枝桿菌DNA的含量，敏感度和特異度均高，整個過程僅需4～5 h，出報告時間短，可以送檢當天出報告，在患者就診的當天就能確診，有利于患者的及時診斷和治療。BACTEC 960培養(yǎng)法敏感度高，但是培養(yǎng)周期較長，不利于結(jié)核病的早期發(fā)現(xiàn)和早期治療。李洪敏等［3］報道BACTEC 960培養(yǎng)法初代分離標本陽性報告平均時間為7.2 d，本實驗室略長，為8.9 d，陰性報告時間均設(shè)定為42 d。痰涂片抗酸染色簡單易行，出報告快，費用低廉，可以起到篩查的作用，缺點是陽性率低，易漏診。

3種方法均要求患者留取合格的痰液標本，以早晨痰液為最佳。操作者應(yīng)取材恰當，挑取膿液或帶血部分，以避免選擇唾液部分。BACTEC 960培養(yǎng)要求及時送檢，不能及時處理的標本應(yīng)低溫保存。由于BACTEC 960培養(yǎng)前處理的設(shè)計缺陷，不可避免導致一定的污染率。穆成等［4］報道BACTEC 960培養(yǎng)污染率為4.95%，高于改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)的2.12%。痰涂片抗酸染色也要求及時送檢，以避免痰液液化，影響陽性檢出率。而FQ－PCR直接檢測痰液標本中結(jié)核分枝桿菌DNA的含量，關(guān)鍵是DNA的提取過程，尤其是痰液或病理組織樣本均質(zhì)化處理，對于標本送檢時間要求不高，不存在污染重送的問題。在結(jié)核分枝桿菌DNA提取過程中，為提高陽性檢出率，可在加入DNA提取液，置沸水浴10min后，轉(zhuǎn)至4℃靜置6～8 h，以保證充分裂解。

FQ－PCR技術(shù)因其極為有效可靠，而廣泛應(yīng)用于分子生物學研究各領(lǐng)域。目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于結(jié)核病的臨床診斷中。適用于各種臨床標本中結(jié)核分枝桿菌DNA的直接檢測，包含血液標本。而BACTEC 960培養(yǎng)和涂片抗酸染色則不適用于血液標本。黃瑋和張永樂［5］報道應(yīng)用熒光定量PCR檢測結(jié)核分枝桿菌在支氣管灌洗液中檢出率最高，其次為痰液，檢出率最低為血液。有條件的醫(yī)院最好在支氣管鏡下直接從病變的病灶部位取得標本，可以提高檢出率。此外，還可用于分枝桿菌菌種快速鑒定及抗結(jié)核藥耐藥基因的快速檢測等［6］。

綜上所述，作者認為FQ－PCR技術(shù)具有快速、準確、特異性強、陽性率高、需時短、縮短了結(jié)核菌的檢測時間等獨特的優(yōu)點，為結(jié)核病的快速診斷提供了更有效的手段，為早期治療提供有效支持。

［1］中國防癆協(xié)會.結(jié)核病診斷細菌學檢驗規(guī)程［J］.中國防癆雜志，1996，118（1－3）：30－33，80－85，127－134.

［2］李加平.熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)在淋巴結(jié)結(jié)核鑒別診斷中的應(yīng)用［J］.檢驗醫(yī)學與臨床，2011，8（1）：67－68.

［3］李洪敏，吳雪瓊，王巍，等.新型BACTEC MGIT 960全自動快速分枝桿菌培養(yǎng)鑒定藥敏儀及其應(yīng)用［J］.現(xiàn)代科學儀器，2000，16（2）：61－62.

［4］穆成，趙德福，趙慧，等.應(yīng)用BACTEC 960系統(tǒng)與改良羅氏培養(yǎng)基從肺外標本分離培養(yǎng)分枝桿菌的效果比較［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2009，19（11）：2579－2580.

［5］黃瑋，張永樂.肺結(jié)核分枝桿菌在不同標本類型中的分布［J］.醫(yī)學研究雜志，2009，38（3）：75－76.

［6］白廣紅，梁雅萍，朱蕾.BACTEC MGIT 960 system快速分離結(jié)核桿菌的效果評價［J］.實用醫(yī)技雜志，2006，13（18）：3187－3188.