單細(xì)胞分析技術(shù)的應(yīng)用與展望

　　摘 要：介紹了近幾年來(lái)單細(xì)胞分析應(yīng)用發(fā)展，總結(jié)了單細(xì)胞分析技術(shù)的進(jìn)樣、溶膜、衍生及檢測(cè)。并對(duì)以后的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。
　　關(guān)鍵詞：?jiǎn)渭?xì)胞分析 細(xì)胞溶膜 檢測(cè)技術(shù)
　　中圖分類號(hào)：Q2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791(2011)06(a)-0004-01
　　細(xì)胞作為生命體結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)的基本單元，要了解生命體中一些生命活動(dòng)規(guī)律，就必須要以細(xì)胞為研究基礎(chǔ)。在對(duì)于細(xì)胞內(nèi)組分的分析研究中，由于對(duì)單細(xì)胞分析的難度比較大，所以往往采取對(duì)細(xì)胞群體的分析手段來(lái)獲得細(xì)胞中的化學(xué)信息，但是這樣就會(huì)帶來(lái)很多的局限性和弊端。在生物體內(nèi)的組織具有不均勻性，對(duì)于單個(gè)細(xì)胞間更是具有較大的差異。在對(duì)細(xì)胞群體的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果中，掩蓋了單細(xì)胞間的差異，造成了醫(yī)學(xué)、生物學(xué)及其它學(xué)科在深一步研究中受到限制。對(duì)于單個(gè)細(xì)胞的研究，能夠掌握更準(zhǔn)確更全面的細(xì)胞信息，可以深入探討以往群體分析中平均結(jié)果對(duì)個(gè)別信息掩蓋的局限性，單細(xì)胞分析的引入對(duì)與疾病的早期預(yù)防和診斷有重要的意義。
　　
　　1 單細(xì)胞分析技術(shù)
　　單細(xì)胞的分析能夠準(zhǔn)確的提供出細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)及細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)的準(zhǔn)確信息，能夠反應(yīng)出細(xì)胞的功能與化學(xué)組分間的特定關(guān)系，以及某些細(xì)胞在生命體內(nèi)的特殊作用。在對(duì)單細(xì)胞分析研究中，主要涉及單細(xì)胞進(jìn)樣、溶膜、衍生及檢測(cè)技術(shù)。
　　1.1 單細(xì)胞進(jìn)樣
　　單細(xì)胞分析中如何取樣是該方法研究的關(guān)鍵之一。單個(gè)全細(xì)胞進(jìn)樣可以用電遷移或流體動(dòng)力學(xué)進(jìn)樣。由于以上方法需要對(duì)毛細(xì)管的進(jìn)樣端口進(jìn)樣腐蝕，并且需要一些精密微操縱系統(tǒng)，所以操作比較復(fù)雜。Walt等[1]通過(guò)芯片技術(shù)，設(shè)計(jì)了一種單細(xì)胞定位芯片，高密度芯片上有陣列微室，可以使細(xì)胞隨機(jī)分散到各個(gè)微室中，從而實(shí)現(xiàn)了多個(gè)細(xì)胞的快速同步檢測(cè)。Schmidt等[2]基于微陣列芯片設(shè)計(jì)的單細(xì)胞進(jìn)樣及定位分析檢測(cè)系統(tǒng)，可同時(shí)測(cè)定多個(gè)細(xì)胞及單細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過(guò)程，使單細(xì)胞的分析效率得到顯著提高。
　　1.2 細(xì)胞溶膜
　　細(xì)胞在進(jìn)入毛細(xì)管通道后，一般需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行溶膜以便進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的分析分離檢測(cè)。通常使用表面活性劑或者用低滲溶液達(dá)到細(xì)胞膜破裂的目的。這種方法操作簡(jiǎn)單并且效率較高，細(xì)胞溶膜過(guò)程一般為幾秒鐘。在對(duì)于細(xì)胞內(nèi)一些反應(yīng)速度很快(秒級(jí)或更短的時(shí)間)的生化反應(yīng)，例如細(xì)胞內(nèi)的酶活性，若能準(zhǔn)確分析檢測(cè)這些物質(zhì)，就需要實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞能在亞秒(subsecond)時(shí)間內(nèi)溶膜，終止其生化反應(yīng)?；陔姶┛自硭麄冇盅兄屏艘环N新型的快速電溶膜方法[3]，利用脈沖電壓超過(guò)一定值將細(xì)胞膜擊破。該方法溶膜時(shí)間與激光溶膜法相當(dāng)，并且不需要脈沖激光器，操作也十分簡(jiǎn)便，在應(yīng)用中將十分廣泛。
　　1.3 細(xì)胞衍生
　　單細(xì)胞內(nèi)很多物質(zhì)沒有天然的熒光特性或電化學(xué)活性，因此要對(duì)這些物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)分析就需要經(jīng)過(guò)衍生化。單細(xì)胞衍生有柱前、柱后、柱上與細(xì)胞內(nèi)衍生。
　　柱前衍生是指先將單細(xì)胞溶膜，使組分經(jīng)過(guò)衍生后再注入毛細(xì)管進(jìn)行電泳分離的分析方法。柱前衍生具有較大的自由性。柱上衍生的方法就是先把衍生試劑溶入到流動(dòng)相中，再注入樣品，使分析物和衍生試劑在流動(dòng)相中完成反應(yīng)。柱前和柱后衍生主要面對(duì)分析物的多重標(biāo)記，導(dǎo)致電泳峰的分析及定量難以分辨。雖然柱后衍生能夠克服這一弊端，但是需要衍生的反應(yīng)速度必須很快，要在幾秒內(nèi)完成。細(xì)胞內(nèi)衍生是將細(xì)胞移到含有衍生試劑的培養(yǎng)液中，使衍生試劑透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，把待分析物進(jìn)行衍生。衍生產(chǎn)物不能滲出細(xì)胞外并且保持細(xì)胞完整。董謙等設(shè)計(jì)了一種新型的細(xì)胞內(nèi)衍生方法，他們用電穿孔的方法把衍生試劑導(dǎo)入到血紅細(xì)胞內(nèi)，使衍生劑與氨基酸在細(xì)胞內(nèi)完成反應(yīng)。細(xì)胞在受到電穿孔作用引入衍生劑后，體積略增大，胞內(nèi)分析物稀釋小于二倍。將衍生后血紅細(xì)胞電遷移進(jìn)樣，在毛細(xì)管中溶膜后柱端安培法完成單個(gè)血紅細(xì)胞內(nèi)的氨基酸含量的測(cè)定。
　　1.4 單細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)
　　檢測(cè)分析是單細(xì)胞研究在毛細(xì)管電泳中的核心問題。由于細(xì)胞體積很小，胞內(nèi)組分含量一般都在fmol-zmol范圍內(nèi)，所以在單細(xì)胞分析中應(yīng)用的檢測(cè)器應(yīng)至少能檢測(cè)到fmol級(jí)。所以目前應(yīng)用比較多的有紫外可見檢測(cè)，電化學(xué)檢測(cè)、熒光檢測(cè)、質(zhì)譜檢測(cè)和免疫分析法等。
　　電化學(xué)分析可以不因毛細(xì)管內(nèi)徑極細(xì)而造成靈敏度的損失，并且進(jìn)樣量極小，所以很適合單細(xì)胞分析檢測(cè)。其中毛細(xì)管電泳安培法在生物分析領(lǐng)域已成為很有前景的新技術(shù)。熒光檢測(cè)器以其選擇性好、靈敏度高的特點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)分析領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。特別是激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器可完成單分子和單原子的檢測(cè)，在微柱分離組分檢測(cè)與DNA快速序列分析等方面有重要用途。目前商品儀器多數(shù)采用紫外可見檢測(cè)器，由于毛細(xì)管內(nèi)徑小，進(jìn)樣量低(nL)，使光度檢測(cè)的靈敏度降低。Cruz等對(duì)單個(gè)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的NO2-和NO3-采用毛細(xì)管電泳紫外吸收法檢測(cè)，檢測(cè)限均低于200fmol。質(zhì)譜法可以對(duì)未知物在無(wú)內(nèi)標(biāo)物的情況下進(jìn)行定性分析，該法在研究生物分子方面具有很大意義。Theodore等對(duì)細(xì)胞和亞細(xì)胞內(nèi)代謝物質(zhì)使用毛細(xì)管電泳耦合電噴霧質(zhì)譜檢測(cè)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)乙酰膽堿、組胺、多巴胺及血清素等具有信號(hào)響應(yīng)的物質(zhì)檢測(cè)限＜50nM，該法能夠快速簡(jiǎn)便的確定單細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物。免疫法是采用抗原與抗體能夠?qū)Ｒ恍越Y(jié)合進(jìn)行檢測(cè)分析的方法，具備高靈敏度與高特異性的特點(diǎn)。
　　
　　2 展望
　　隨著單細(xì)胞分析的不斷發(fā)展，現(xiàn)實(shí)中快速、簡(jiǎn)捷、高效的分析成為當(dāng)前的一個(gè)要求，從每次進(jìn)樣都是單個(gè)細(xì)胞慢慢發(fā)展到要對(duì)單個(gè)細(xì)胞連續(xù)進(jìn)樣，對(duì)于多個(gè)連續(xù)進(jìn)樣的單細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)測(cè)定。對(duì)于單細(xì)胞分析中的操縱、進(jìn)樣、溶膜及檢測(cè)涉及許多交叉相關(guān)的學(xué)科，結(jié)合相關(guān)各學(xué)科的發(fā)展優(yōu)勢(shì)，在物理、微加工及電子學(xué)等先進(jìn)技術(shù)的幫助下，從而達(dá)到簡(jiǎn)單快速的完成對(duì)單細(xì)胞的分析研究。當(dāng)前需要改善單細(xì)胞進(jìn)樣自動(dòng)化，提高溶膜的有效化及合理化，增強(qiáng)檢測(cè)的自動(dòng)化，使單細(xì)胞分析的整個(gè)過(guò)程更加自動(dòng)化、智能化，為當(dāng)前的醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、病理學(xué)以及臨床學(xué)等方面的研究和應(yīng)用能提供更多幫助。
　　
　　參考文獻(xiàn)
　　[1] Biran