微波輔助脫鈣技術(shù)在豬脫鈣骨基質(zhì)制備中的應(yīng)用研究

任智超 王 欣 劉寶林

（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

REN Zhi-Chao WANG Xin* LIU Bao-Lin

（School of Medical Instrument and Food Engineering，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai200093，China）

引言

我國生豬產(chǎn)業(yè)發(fā)達(dá)，據(jù)統(tǒng)計我國每年消耗生豬4 000萬噸以上，其中，大量豬的后腿骨干骺端沒有被充分利用，僅在煲湯后被當(dāng)作垃圾丟棄。已有研究表明，豬后腿骨干骺端主要由松質(zhì)骨組成，而松質(zhì)骨是制備脫鈣骨基質(zhì)的優(yōu)良材料，因此利用豬后腿骨干骺端制備脫鈣骨基質(zhì)可以加大對其的利用，變廢為寶，有著廣闊的發(fā)展前景。

脫鈣骨是一種自體可降解的抗原滅活的異種或同種異體骨質(zhì)，是骨組織工程常用的一種生物衍生材料。1965年，Urist證實(shí)脫鈣骨具有誘導(dǎo)成骨作用［1］。隨后，脫鈣骨的成骨誘導(dǎo)活性被大量的試驗(yàn)研究和臨床實(shí)踐所證實(shí)［2－5］。脫鈣骨具有良好的生物相容性、生物活性以及生物降解性。目前脫鈣骨的制備方法主要采用傳統(tǒng)的Urist法，該方法操作簡單，制備成本低，但需耗費(fèi)大量的時間（一般為12 h以上）。微波輻射可加劇分子運(yùn)動，提高分子平均能量、降低反應(yīng)活化能，從而提高化學(xué)反應(yīng)速度，甚至改變化學(xué)反應(yīng)機(jī)理，啟動新的反應(yīng)渠道［6］。近年來有學(xué)者采用微波技術(shù)對人牙齒脫鈣效果進(jìn)行研究，結(jié)果顯示微波技術(shù)能縮短人牙齒脫鈣的時間，并且牙齒表面脫鈣均勻［7］。亦有學(xué)者研究了微波技術(shù)在骨組織病理技術(shù)中的應(yīng)用，結(jié)果表明，微波技術(shù)不但可以加快骨組織的脫鈣速度，同時有利于骨組織在免疫染色和免疫抗原修復(fù)中的應(yīng)用［8］。因此，本研究擬將微波技術(shù)引入到脫鈣骨的制備過程中，以傳統(tǒng)制備方法為對照，考察微波技術(shù)對脫鈣骨的鈣含量、孔隙率、孔徑大小、壓縮模量等多個理化指標(biāo)的影響，對微波法制備脫鈣骨的可行性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料：當(dāng)天宰殺的同一批次豬的后腿骨，購于上海復(fù)新屠宰場，豬齡6個月。

試劑：碳酸鈣、乙二胺四乙酸鈉（EDTA）、氨水、氯化銨、三乙醇胺、鉻黑 T指示劑、鹽酸羥胺、無水乙醇、無水乙醚、Triton X-100、濃鹽酸等均購于中國醫(yī)藥集團(tuán)（上海）化學(xué)試劑公司，均為分析純。

儀器：分析天平（AB204-N，梅特勒-托利多儀器有限公司）、微波合成儀（XH-MC-1，北京祥鵠科技有限公司）、物性測試儀（EZ-TEST，日本SHIMADZU公司）、Micro-CT（1074HR，比利時 Skyscan公司）、電熱恒溫水浴鍋（HHS，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、Nikon顯微鏡（55I，日本尼康公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 脫鈣骨的傳統(tǒng)制備法

預(yù)處理：購得樣品并清洗后，先將干骺端按照5mm×5 mm×3 mm的尺寸切片，然后再用高壓水槍沖洗除去骨片孔隙中的骨髓，使切片呈乳黃色孔隙結(jié)構(gòu)。

脫鈣骨的制備流程如圖1所示。預(yù)處理后的豬后腿骨干骺端首先放在5％的Triton X-100溶液中脫細(xì)胞48 h（每12 h換液一次），后用蒸餾水沖洗0.5 h；之后置于無水乙醚中脫脂48 h（每12 h換液一次），后蒸餾水沖洗0.5 h；接著置于0.6 mol/L鹽酸溶液中進(jìn)行脫鈣12 h，然后蒸餾水沖洗0.5 h；最后脫鈣后的脫鈣骨置于恒溫干燥箱中30℃干燥12h，最終得到脫鈣骨成品。

圖1 脫鈣骨制備流程示意圖Fig.1 Flow diagram of the preparation of demineralized bone matrix

1.2.2 微波輔助脫鈣

根據(jù)脫鈣骨制備的工藝，在脫鈣處理環(huán)節(jié)中采用微波技術(shù)進(jìn)行輔助脫鈣。微波脫鈣的試驗(yàn)條件為：微波功率300 W，微波處理時間：0～2 h。處理豬骨切片數(shù)量為60片，采用微波輔助脫鈣技術(shù)制備60片脫鈣骨基質(zhì)用于對其理化性質(zhì)的研究。

1.3 檢測指標(biāo)與方法

1.3.1 脫鈣率

采用EDTA滴定法，在參考文獻(xiàn)［9］的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)。具體過程如下：稱取一定量的脫鈣骨樣品（ms），至燒杯中加入1∶1濃鹽酸（6 mol/L）10 mL；蓋上玻片，電爐加熱至沸騰，反復(fù)三次至樣品全部溶解，用去離子水沖洗玻片，沖洗液滴加入燒杯中；將燒杯中的溶液倒入100 mL容量瓶中，沖洗燒杯三次，加去離子水至刻度，搖勻。移液管從容量瓶中吸取體積為V1的溶液分別置于三個錐形瓶中。再向三個錐形瓶中分別加入5％的三乙醇胺3 mL，氨性緩沖溶液15 mL，檸檬酸鈉3 mL，鉻黑 T指示劑5滴，然后用0.02 mol/L的 EDTA進(jìn)行滴定，當(dāng)錐形瓶中溶液的顏色由酒紅色變?yōu)榱了{(lán)色即為滴定終點(diǎn)，EDTA消耗的體積記為V0。

脫鈣骨鈣含量計算公式為

式中，X?為脫鈣骨鈣含量（mg/g），V0為滴定鈣離子所消耗EDTA的體積的平均值（3個樣品的平均值，mL），T為 EDTA的標(biāo)定的濃度，ms為樣品的質(zhì)量（g），V1為所取樣液的體積（mL）。

脫鈣骨脫鈣率的計算公式為

式中，K為脫鈣骨脫鈣率，X0為樣品原有的鈣含量（mg/g），X為脫鈣骨鈣含量（mg/g）。

1.3.2 孔隙率

采用Skyscan 1074HR型Micro-CT對脫鈣骨樣品進(jìn)行掃描，每轉(zhuǎn)動3.6°進(jìn)行掃描拍照，每個樣品掃描360°。掃描后利用Micro-CT的系統(tǒng)軟件對脫鈣骨進(jìn)行三維重構(gòu)，再利用Micro-CT的CTAN軟件對三維重構(gòu)后脫鈣骨的孔隙率進(jìn)行測量分析。

1.3.3 孔徑

將脫鈣骨樣品進(jìn)行切片，厚度在0.5 mm左右。置于載玻片上利用Nikon 55i型顯微鏡進(jìn)行拍照，顯微鏡目鏡為 10倍鏡，物鏡為 4倍鏡。利用Digimizer3.1圖片分析軟件對孔徑大小進(jìn)行測量，隨機(jī)選取5個區(qū)域?qū)γ撯}骨孔徑大小進(jìn)行測量。

1.3.4 壓縮模量

采用壓縮法，物性測試儀壓頭直徑2 cm，壓縮速率為0.5 mm/s。選取脫鈣骨中心部位，進(jìn)行壓縮測量。單位MPa，以脫鈣骨彈性變形區(qū)的曲線的斜率表示其壓縮模量，此斜率即為應(yīng)力與應(yīng)變的比值。每種處理方式選3個樣品進(jìn)行測量，最后取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

應(yīng)用 SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用ANOVA進(jìn)行 Duncan多重檢驗(yàn)分析，并用 Excel軟件進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫鈣方法對脫鈣率的影響

脫鈣骨的脫鈣率代表了脫鈣骨的脫鈣程度，是判斷脫鈣骨制備效果的一項(xiàng)重要指標(biāo)，當(dāng)脫鈣率達(dá)到100％時表示完全脫鈣。傳統(tǒng)制備法及微波制備法對脫鈣率的影響如圖2所示。

圖2 脫鈣方法對脫鈣骨的脫鈣率的影響Fig.2 The influence of decalcification methods on decalcification rate of demineralized bone matrix

由圖2可見，隨脫鈣時間延長，兩種方法所制備的脫鈣骨的脫鈣率均不斷提高。傳統(tǒng)制備法脫除樣品中100％的鈣所需的時間為11 h，而微波制備法僅需2 h就可完成此過程，脫鈣時間相對縮短了82％。微波制備法顯著提高了脫鈣骨的制備效率，這是因?yàn)楣穷^中的鈣元素主要以羥基磷酸鈣（Ca10（PO4）6（OH）2）的形式存在，樣品的脫鈣過程實(shí)際上是骨頭中的羥基磷酸鈣與鹽酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)：Ca10（PO4）6（OH）2+20HCl→10CaCl2+6H3PO4+2H2O，生成氯化鈣從而使鈣元素從骨組織中分離出來，達(dá)到了脫鈣的目的。在這個反應(yīng)中微波將能量以電磁波的形式傳遞給反應(yīng)物質(zhì)，使樣品由內(nèi)到外均能發(fā)生反應(yīng)，并使分子激烈的運(yùn)動，增加了分子間有效碰撞的頻率，從而提高了化學(xué)反應(yīng)速率，加快了羥基磷酸鈣與鹽酸的反應(yīng)速率從而提高了脫鈣效率；而傳統(tǒng)制備法的反應(yīng)則是由樣品外部向內(nèi)部逐漸進(jìn)行，從而脫鈣速度相對較慢。

2.2 脫鈣方法對孔隙率的影響

作為支架材料，脫鈣骨應(yīng)具有較高的孔隙率，以利于細(xì)胞和生長因子在脫鈣骨支架內(nèi)均勻分布及生長［10］。本研究采用Micro-CT對脫鈣骨進(jìn)行360°二維掃描的典型結(jié)果如圖3所示，之后利用Micro-CT的系統(tǒng)軟件對掃描結(jié)果進(jìn)行三維重構(gòu)分析，重構(gòu)出脫鈣骨的截面圖，結(jié)果如圖4所示。利用Micro-CT掃描分析的結(jié)果，應(yīng)用Micro-CT的CTAN測量軟件獲得了脫鈣骨的孔隙率。傳統(tǒng)方法和微波法制備的脫鈣骨的孔隙率隨脫鈣時間的變化情況如圖5所示。

圖3和圖4表明，微波法制備的脫鈣骨具備良好的三維網(wǎng)狀孔隙結(jié)構(gòu)，且孔隙間彼此相通。脫鈣骨作為支架材料孔隙率應(yīng)在75％以上，才能有利于細(xì)胞的黏附及細(xì)胞外基質(zhì)的生長，國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)關(guān)于脫鈣骨孔隙率的報道一般在80％以上［11］，本研究中，兩種方法所得到的脫鈣骨的孔隙率均在85％以上，無顯著差異（P＞0.05），具有良好的孔隙率。

圖3 脫鈣骨（微波制備法）的Micro-CT二維掃描圖Fig.3 The 2-D scanning picture of demineralized bone matrix（Microwave Preparation）by Micro-CT

圖4 脫鈣骨（微波制備法）的Micro-CT三維重構(gòu)截面圖Fig.4 The 3-D reconstruction picture of demineralized bone matrix（Microwave Preparation）by Micro-CT

另一方面，由圖5可見，隨脫鈣時間延長，兩種制備方法對脫鈣骨的孔隙率的影響也有所區(qū)別。微波法制備的脫鈣骨的孔隙率在前15 min內(nèi)迅速增大，由未脫鈣時的80.06％迅速增大到86.75％，之后孔隙率隨脫鈣時間的延長而緩慢增加，到第2 h時脫鈣完成，此時孔隙率為88.23％。而傳統(tǒng)方法制備的脫鈣骨的孔隙率在脫鈣1 h內(nèi)的增大較快，由未脫鈣時的80.06％迅速增大到85.36％，但顯著低于微波法的孔隙率變化速度，兩者孔隙率變化速度差異性顯著（P＜0.05）。隨后，孔隙率隨脫鈣時間延長而緩慢增加，到脫鈣完成時（11 h）孔隙率達(dá)到87.87％。

圖5 脫鈣方法對脫鈣骨孔隙率的影響Fig.5 The influence of decalcification methods on porosity of demineralized bone matrix

脫鈣骨孔隙率的增大是由于脫鈣骨的鈣元素被脫除后，骨中鈣成分流失而造成脫鈣骨表觀密度減小從而孔隙率增大。與傳統(tǒng)制備方法相比，得到相同的孔隙率時，微波法可比傳統(tǒng)方法節(jié)省90％的時間，顯著提高了脫鈣骨的制備效率，且微波法與傳統(tǒng)方法制備的脫鈣骨在脫鈣完成時孔隙率僅相差0.36％，無顯著差異（P＞0.05），可見脫鈣骨并未因微波效應(yīng)造成的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而影響脫鈣骨的制備效果，這對微波技術(shù)在脫鈣骨制備中的應(yīng)用具有重要的意義。

2.3 脫鈣方法對孔徑的影響

作為支架材料，脫鈣骨的孔徑大小是一個重要的指標(biāo)，孔徑大小影響支架材料的成骨作用。有研究證實(shí)，支架材料的孔徑大小至少為100 μm才有可能使新骨長入。本研究中應(yīng)用兩種方法得到的脫鈣骨的孔徑如圖6和圖7所示，圖6為傳統(tǒng)方法制備得到的脫鈣骨，其脫鈣率為 100％，孔隙率為87.8％；圖7為微波法制備得到的脫鈣骨，其脫鈣率為100％，孔隙率為88.2％。由圖6和圖7可見，兩種方法制備得到的脫鈣骨具有良好的孔徑結(jié)構(gòu)，孔徑之間彼此相連，適合細(xì)胞及細(xì)胞生長因子的附著。

在脫鈣過程中，由于骨中的鈣元素不斷的被脫離出來，使骨小梁中的鈣鹽下降而造成剛度不斷減小，使骨小梁中膠原膨脹拉伸而導(dǎo)致孔徑增大。由圖8可見，制備方法不同，脫鈣骨的孔徑隨脫鈣時間的變化也有一定區(qū)別。微波法制備的脫鈣骨的孔徑在0～15 min內(nèi)呈顯著增大趨勢，孔徑由最初的308.03 μm 增大至 341.03 μm，隨后孔徑隨脫鈣時間的變化趨緩，脫鈣完成后孔徑為348.41 μm。而傳統(tǒng)制備法制備的脫鈣骨孔徑由最初的308.03 μm增大至340.37 μm則需要2 h，用時相對較長，脫鈣終點(diǎn)樣品的孔徑大小為348.98 μm，與微波法制得的樣品的孔徑無顯著差異（P＞0.05）。與相關(guān)報道的脫鈣骨的孔徑相似，本研究中應(yīng)用傳統(tǒng)方法或微波法制備的脫鈣骨的孔徑均在300μm之上，符合組織工程對支架材料的要求，微波法可大幅提高制備效率，同時未對脫鈣骨的孔徑產(chǎn)生負(fù)面影響。

圖6 傳統(tǒng)制備方法脫鈣骨孔徑觀察（圖中的標(biāo)尺為 200 μm）Fig.6 The aperture of demineralized bone matrix with traditional preparation（The black graduated scale is 200 μm）

圖7 微波制備方法脫鈣骨孔徑觀察（圖中的黑色標(biāo)尺為200 μm）Fig.7 The aperture of demineralized bone matrix with microwave preparation（The black graduated scale is 200 μm）

圖8 脫鈣方法對脫鈣骨孔徑大小的影響Fig.8 The influence of decalcification methods on pore size of demineralized bone matrix

2.4 脫鈣方法對壓縮模量的影響

脫鈣骨作為支架材料不僅要為細(xì)胞提供理想的生存環(huán)境，還要滿足一定的力學(xué)性能，這樣脫鈣骨才能在植入人體內(nèi)后起到一定支撐作用，幫助人體承擔(dān)壓力有助于缺損組織的愈合［10］。壓縮模量是脫鈣骨力學(xué)性能的一個重要指標(biāo)，代表脫鈣骨抵抗壓力變形的能力。圖9為微波法制備的脫鈣骨的壓縮試驗(yàn)曲線圖，兩方法對脫鈣骨壓縮模量影響的結(jié)果如圖10所示。

圖9 微波法制備的脫鈣骨的壓縮試驗(yàn)曲線圖Fig.9 The transformation diagram of compression test for demineralized bone matrix prepared by microwave method

如圖9所示，圖中 A-B段為彈性變形區(qū)，脫鈣骨在受到壓縮時發(fā)生彈性形變，當(dāng)外力取消時脫鈣骨可恢復(fù)原來形狀。B-C段為蠕變區(qū)，隨著壓力的增大脫鈣骨的結(jié)構(gòu)開始發(fā)生變化，結(jié)構(gòu)逐漸受到破壞。C-D段為塑性變形區(qū)，脫鈣骨的結(jié)構(gòu)完全遭到破壞，隨著壓力的增大開始發(fā)生不可恢復(fù)的形變。脫鈣骨的壓縮模量就是在彈性形變區(qū)域（A-B段）內(nèi)應(yīng)力和應(yīng)變的比值。

圖10表明，兩種方法制備的脫鈣骨的壓縮模量均隨脫鈣時間的延長不斷降低。這是由于脫鈣骨的支撐強(qiáng)度是由骨小梁來承擔(dān)的，而骨小梁的主要成分是鈣鹽和膠原，當(dāng)鈣鹽不斷以離子形式脫離骨小梁時，骨小梁的支撐作用便會降低，從而使抵抗變形的能力下降，壓縮模量降低。樣品中的含鈣量越少，則樣品的壓縮模量就會越低。

圖10 脫鈣方法對脫鈣骨壓縮模量的影響Fig.10 The influence of decalcification methods on the modulus of compressibility of demineralized bone matrix

在臨床醫(yī)學(xué)中，脫鈣骨壓縮模量并沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，有研究將壓縮模量在2 MPa左右的支架材料應(yīng)用于試驗(yàn)研究中并取得了不錯的效果［12］。本研究中，采用微波制備法，脫鈣骨在脫除90％的鈣后壓縮模量仍為7.11 MPa，大于2 MPa具有更好的力學(xué)性能。同時微波法制備的脫鈣骨壓縮模量達(dá)到7.11 MPa僅需要20 min，而傳統(tǒng)制備法則需要2 h以上的時間，制備時間相對縮短了83％，兩者差異性顯著（P＜0.05）。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)考察了微波技術(shù)脫鈣骨制備過程中的應(yīng)用可行性。通過與傳統(tǒng)脫鈣制備方法的比較發(fā)現(xiàn)，微波制備法可顯著縮短脫鈣時間，僅需2 h就可完全脫鈣，相對縮短了82％的時間；微波法制備的脫鈣骨具備良好的三維網(wǎng)狀孔隙結(jié)構(gòu)，且孔隙間彼此相通，脫鈣終點(diǎn)時，脫鈣骨的孔隙率均在85％以上，孔徑為348.41 μm，與傳統(tǒng)方法制備的脫鈣骨孔隙率、孔徑無顯著差異，適合細(xì)胞及生長因子附著生長，同時符合臨床應(yīng)用的力學(xué)性能要求，采用微波制備法，脫鈣骨的壓縮模量達(dá)到7.11 MPa僅需要20 min，有效提高了脫鈣骨的制備效率。本研究證明了微波技術(shù)在脫鈣骨制備中應(yīng)用的可行性，對微波技術(shù)在脫鈣骨制備中的應(yīng)用具有重要的意義。

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