急性毒性評價試驗和體外預測方法

　　急性毒性是化妝品安全性評價最基礎的試驗，通常包括經口和經皮途徑，必要時對某些極端的暴露途徑(如吸入)也應給予考慮。急性毒性的主要目的是觀察化學物急性毒性效應、劑量－反應關系、靶器官病變及其可逆性等。自從1927年Trevan第一次引入了半數致死量(LD50)的概念以來，LD50成為急性毒性的主要指標，但是，從上世紀70年代開始，LD50試驗受到科學界和動物福利主義者的廣泛批評，此后，經典急性毒性試驗方案經過了多次改進。2002年，經典的經口LD50試驗被廢除，取而代之以3項優(yōu)化方法。之后，急性吸入毒性的試驗方法也進行了修訂，并于2009年被法規(guī)認可。
　　
　　一、急性毒性試驗
　　
　　化妝品急性毒性是指經口或經皮膚途徑一次接觸或24小時內多次接觸某一化學物質，或4小時內吸入暴露化學物所引起的不良效應?！耙淮巍苯佑|，在經口途徑染毒時，是指瞬間給予實驗動物染毒，在經呼吸道與皮膚染毒時，是指在一個規(guī)定的時間段內使實驗動物持續(xù)接觸化學物的過程。而“多次”接觸是指當外源化學物毒性很低時，即使一次給予實驗動物最大染毒劑量仍不能觀察到毒性作用，從而需要在24小時內對實驗動物進行多次染毒，以達到規(guī)定的限制劑量。急性毒性試驗可以分為兩類。一類是以死亡為毒性終點的經典試驗，主要是求得LD50。另一類實驗不以死亡為觀察終點，這類試驗可得到受試物靶器官毒性和非致死性不良反應的數據。傳統(tǒng)的急性毒性試驗屬于第一類。1984年，英國毒理學會首先提出不應使用大量動物來獲得看似精確的LD50值，1987年經典LD50試驗法最先被歐洲委員會廢除，2002年，被OECD指南廢除。
　　對于“急性吸入毒性試驗”，經典的動物試驗于2009年得到了修訂，增加了3R的內容和非LD50的程序。2008年，OECD認可了德國提出的“急性吸入毒性一急性毒性分類(ATC)方法”，其原理類似于經口毒性試驗的ATC法。2009年，重復劑量吸入毒性(28天或14天試驗)和亞慢性吸入物毒性(90天試驗)也按照3R的原則進行了更新。急性皮膚毒性仍沿用動物試驗，它是指受試物應用于實驗動物不超過體表皮膚面積的10％，經過14天觀察，病理學檢查毒性變化主測定LD50值，急性皮膚毒性試驗對于皮膚吸收和其它亞慢性皮膚毒性試驗的劑量確定是有用的。
　　化妝品急性毒性試驗一般選用成年健康哺乳動物，首選大鼠，其次是小鼠，特別必要時才選擇非嚙齒類動物(犬或猴)。試驗前首先要了解受試物的化學結構和理化性質，根據受試物的用途和有關測試規(guī)范設計實驗方案。對于新化學物，還應檢索與其化學結構和理化性質相似的化學物的毒性文獻資料，這樣既能提高動物實驗結果的有效性和準確性，對于減少和優(yōu)化實驗動物的使用也是必需的。急性毒性的內涵是很豐富的，不能簡單地理解為只是LD50的測定。試驗結果的觀察記錄內容主要包括4個方面，即臨床癥狀及發(fā)生過程、死亡情況和時間分布、體重和病理形態(tài)變化。觀察時間一般要求14天。
　　
　　二、急性毒性試驗的替代方法
　　
　　從法規(guī)的角度講，化妝品急性毒性試驗的主要目的是按照有關管理規(guī)定對其組份的固有毒性進行基本了解和分類，目的是保護公眾健康。目前急性經口毒性試驗的優(yōu)化方法共有3項，即是固定劑量程序法(OECD TG 420)，急性毒性分類方法(OECD TG 423)和上下程序法(OECD TG 425)。每種方法均需預設劑量，開始劑量的確定可基于小范圍內的預試驗研究、細胞毒性篩選或已有資料進行分析。染毒后，觀察動物明顯的毒性癥狀，包括死亡(ATC或UDP)，或毒性癥狀(如FDP)。在歐美等國家以死亡為終點的試驗已被所有法規(guī)廢除，因此急性毒性試驗中替代方法的使用已成為強制性的方法。三種替代方法中，ATC法最常用(在歐洲約50％的經口毒性試驗采用此方法)。
　　
　　1　固定劑量法
　　于1984年由英國毒理學會(BTS)最早提出。該試驗不以動物死亡為觀察終點，而是利用預先選定的或固定的一系列劑量染毒，從觀察化學物的毒性反應體征作為終點來對化學物的毒性進行分級。該方法的價值在于使估計化學品急性經口毒性所需要的動物量達到最小。試驗各組選用同一性別(通常選用雌性)動物，以5、50、300和2000mg／kg四個固定劑量(特殊需要可考慮增加5000mg／kg)順次進行經口染毒。根據預試驗結果確定的能夠產生毒性反應但又不至于引起死亡的劑量作為起始劑量。根據毒性反應和死亡的有無來確定是否在更高劑量或更低劑量繼續(xù)進行試驗。出現下列情況情況結束試驗：1)當出現明顯的毒性反應或已確認不多于一只動物死亡；2)最高劑量未出現毒性反應；3)最低劑量動物出現死亡。以初始劑量為50mg／kg為例，5只實驗動物(包括預試驗1只)，如果死亡數≥2只，則再選擇一組動物給予5mg／kg的受試物；如果≥1只動物具有明顯毒性，或1只死亡，則將該受試物按GHS分類為3類物質；如表現為無毒性，則再選擇一組動物給予300mg／kg的受試物。FDP法估計LD50在一個限定的劑量間隔內，結果可按照GHS分級系統(tǒng)對化合物進行正確分類。
　　
　　2　急性毒性分類法
　　由Sumiey于1990年提出，該試驗是以死亡為終點的分階段試驗法，試驗分步進行，每一步使用單一性別(通常為雌性)的3只動物，確定動物的死活情況后再決定下一步試驗。有3種可能的結局：(1)無需進一步試驗即可分級；(2)同一劑量水平再做3只動物；(3)在高一級或低一級劑量水平另做3只動物。以開始劑量300mg／kg為例，給予3只動物染毒，如出現2～3只動物死亡，則下一步試驗降低一級劑量，以50mg／kg劑量染毒；如出現0～1只動物死亡，則下一步試驗再用同一劑量水平進行另外3只動物的染毒。與經典急性毒性試驗法相比，采用ATC法僅需2～4步即可判定急性毒性分類，所用大鼠不超過12只，有效地減少了動物的使用量。
　　
　　3　上下增減劑量法
　　又稱階梯法，序貫法。由Dixon和Mood于1948年首次提出，1985年Bruce進行了改進。1987年該方法被美國材料學會(ASTM)采納，2001年被OECD采納。該方法最大的特點是大大減少實驗動物的使用，不但可以進行毒性表現的觀察，還可以估算LD50及其可信限，適合于能引起動物快速死亡的受試物。UDP由限度試驗和主試驗組成，限度試驗分為2000mg／kg和5000mg／kg兩個劑量水平，用于受試物毒性較小的情況。主試驗是一個預先設計的染毒程序，每次染毒1只動物，由第1只動物染毒后的反應決定第2個動物接受化學物的劑量，若動物存活，第2只動物給予高一級劑量，若第1只動物死亡或出現瀕死狀態(tài)，第2只動物給予低一級劑量。在對每只染毒動物仔細觀察48h后，可以決定是否對下1只動物染毒以及確定染毒劑量。當滿足停止試驗的標準時可以結束試驗。根據終止時所有動物的狀態(tài)，用最大可能性法計算LD50值。采用上下增減劑量法確定LD50只需要6～9只動物。
　　
　　4　急性吸入毒性－急性毒性分類法
　　是將急性經口途徑的分類法應用于吸入途徑，原理與試驗過程與經口的ATC相同，OECD列為TG436。該試驗能滿足大多數法規(guī)監(jiān)管的需要，提供一個對LG50和GHS分類的范圍估計。與傳統(tǒng)的急性吸入毒性相比，替代方法使用了更少的動物。當然，新方法無法滿足所有監(jiān)管和科學研究的需要，必要時可執(zhí)行修訂后的動物試驗(即TG403)。
　　
　　三、急性毒性的體外篩選方法
　　
　　早在上世紀50年代，利用體外細胞系統(tǒng)預測體內急性毒性效應的研究就開始了，人們發(fā)現體外細胞毒性與動物急性毒性死亡劑量之間具有相關高度性，還有研究表明誘發(fā)體外細胞毒性的化學物濃度與人血液該物質的致死濃度之間存在相關性。體外細胞毒性的用途，首先是代替LD50試驗中的劑量確定試驗用于預測急性經口毒性的開始劑量，其次作為系列組合試驗的一部分，做為新化學物質分類和標識的依據，以減少或替代現行的動物實驗，此外，還可用于毒性機制的研究中。
　　
　　1　預測體內毒性的開始劑量
　　最早由替代方法驗證中心(ZEBET)提出了利用體外細胞毒性預測急性經口毒性試驗的策略，在細胞毒性的IC50和急性經口毒性的LD50數據之間建立標準回歸方程，用細胞毒性估計體內經口毒性的LD50的值，作為體內試驗的開始劑量。目前經過驗證的兩項細胞試驗方法分別BABL／c 3T3成纖維細胞中性紅攝取試驗和正常人角質細胞(NHK)中性紅攝取試驗。經過大量已有體內和體外毒理學數據的分析，目前公認的預測模型是公式：log(LD50)=0.435×log(IC50x)+0.625。
　　對于改良后的經口毒性試驗，如果都能從細胞毒性試驗資料獲得最佳開始劑量的合理預測，則可以減少1～3個劑量的試驗步驟。對于一個實驗室，如何將細胞毒性試驗數據用于ATC、UDP等動物實驗方法開始劑量的計算呢?Spielman提出4步建議：第一步，從細胞毒性數據庫中選擇10－20種參考化學物質，用標準細胞毒性試驗方法進行測試，最好用BABL／c 3T3中性紅攝取法；第二步，用細胞實驗中得到的IC50值與細胞毒性數據庫中的LD50值進行線性回歸分析，計算出本實驗室的回歸方程；第三步，將本實驗室得到的回歸方程與公認的回歸方程比較，判斷是否與之一致，并處于確定的預測區(qū)間內；第四步，如果符合上述條件，則可能用于體內毒性試驗的預測，否則，建議改進細胞種類或試驗方法以調整試驗方法的敏感性。
　　
　　2　預測急性毒性的組合試驗
　　細胞毒性試驗可作為組合試驗的一部分，用于急性毒性的預測。這幾項細胞試驗采用的是3種人類細胞系，由以下4個實驗組合而成：
　　①HepG2細胞蛋白容量試驗：肝細胞瘤細胞系Hep G2暴露于測試物中，通過Lowry法測定蛋白容量的改變，檢測細胞毒性。作為序列試驗的一部分，與②、③和④組合，或僅與試驗②組合，可減少經口急性毒性的動物數量。
　　②HL-60細胞ATP含量試驗：HL-60細胞(人類急性前髓細胞淋巴瘤細胞)暴露于測試物質中，采用(Lucifer-LU試劑盒)熒光素－熒光素酶反應產生的生物發(fā)光強度檢測ATP含量(Kangas，1984)。作為序列試驗的一部分，與①、③和④組合，或僅與試驗①組合，可減少經口急性毒性的動物數量。
　?、蹚埵细渭毎螒B(tài)學試驗：該方法最早由Paul于1975提出。Chang肝細胞培養(yǎng)于石蠟封固的96-孔微孔板中，細胞形態(tài)變?yōu)榧従E狀表明生長存在缺陷，以此作為生長抑制的判斷依據。再培養(yǎng)7天收獲培養(yǎng)物，可用于試驗④。作為序列試驗的一部分，與①、②和④組合，可減少經口急性毒性的動物數量。
　?、軓埵霞毎鹥H改變試驗：試驗③的培養(yǎng)物經168h后記錄培養(yǎng)基(酚紅指示劑的)pH顏色變化，正常為黃色，紫色可判斷為完全受抑制，介于紅色和黃色之間判斷為部分受抑制。用于序列試驗的一部分，與①、②和③組合，可減少經口急性毒性的動物數量。
　　
　　3、QSAR模型
　　有許多軟件包用于預測人類健康的影響和相關的毒性，這些系統(tǒng)能夠直接從化學物質的結構預測其毒性。由于其使用方便和快速的特點，已經在實踐中得到應用，如TOPKAT系統(tǒng)。
　　
　　四、化妝品急性毒性預測的決策程序
　　
　　在目前急性毒性動物實驗仍不可避免的情況下，建立科學合理的預測模型十分必要。目前已經開發(fā)出多種決策樹(decision-tree)的方法，可避免大量急性毒性測試，通過最大化的利用現有的信息以預測其它化學物的可能效應。當現有信息的收集不能滿足于危害評估所需資料的要求時，決策樹的作用特別重要。由于化學物質的毒性效應主要受其化學結構的影響，因此，可按照大多數基于結構或廣泛已知的理化特性的數據，將每種結構明確的化學物分類建立決策樹分類系統(tǒng)。
　　決策樹的毒性評估評估可覆蓋與化學品危險性評估相關的全部毒性終點，運用的方法包括體外試驗和計算機方法。對于急性毒性的決策樹評估策略，特別應強調最高閾值濃度——階層向下的方法(簡稱UTC)，體內試驗只是最后的選擇。具體決策步驟如下：
　?、偈欠裼幸阎娜祟惢騽游飻祿盹@示該物質是急性毒素?(數據包括以往體內外急性毒性測試、流行病學研究結果、毒物單位數據、藥物不良反應等)；如果數據質量與數量足以達到分類標識或風險評估的要求，則不要求做測試；若否，進入第2步。
　?、谠u估理化性質：理化性質數據有助于確定生物活性及在第7步PBPK研究中劃分的，進入第3步；
　?、劭煞裼糜嬎銠C方法預測急性毒性?例如應用局部QSAR或適宜專家系統(tǒng)(如TOPKAT、MultiCASE、OASIS、ToxBoxes、DEREK)。如可成功應用一種以上的預測方法，則預測可被接納與否?受試物急性毒性預測可應用于第7步的PBPK研究的，進入第4步。
　?、芸煞裼糜嬎銠C及體外方法預測可能的代謝產物及其毒性?代謝產物及其毒性預測可應用于第7步的PBPK研究的，進入第5步。
　?、葸M行一般細胞毒性試驗(見前文)，測試結果可應用于第7步的PBPK研究的，以及要求確立體內研究初始劑量的，進入第6步。
　?、抟泽w外細胞試驗預測化學物的代謝能力。例如，腸吸收模型、血腦屏障模型。結果可應用于第7步PBPK研究的，進入第7步。
　?、哌M行PBPK及生物動力學模擬以預測主要靶器官毒性代謝作用、體內吸收。以PBPK模擬研究結果確定靶器官及第8步進一步體外試驗的體內劑量濃度。
　?、噙M行體外靶器官毒性測試，例如，包括肝、腎、神經、心、肺細胞毒性試驗。靶器官研究結果可用于證據權重評估的，進入第9步。
　?、釋⑵駷橹顾袛祿M行證據權重評估。如證據足以顯示物質是否具急性毒性，進行分類和標識或風險評估，不再要求做其它試驗，否則進入第10步。
　?、膺M行優(yōu)化的急性毒性試驗，以中性紅攝取法及其它相關研究預測初始劑量，再進行優(yōu)化的動物試驗(經口和吸入)或傳統(tǒng)的動物實驗(經皮膚)。
　　急性毒性實驗的主要目的是為了預測化學物質對人體的作用，目前的研究結論認為基于人類細胞進行的檢測與體內試驗具有較好的相關性，因此，可以把體外細胞試驗方法用于監(jiān)管目的，以評價化合物的危害水平。首先需要正確了解急性暴露化學物質后引起的致死效應，其次才是對特定器官的損害。因此，科學可行的方法是采用分步驟的方案代替目前的急性經口毒性試驗，即通過建立組合試驗或階梯試驗預測化合物對人體的作用，具體包括簡單的細胞毒性試驗、生物動力學(代謝)試驗和器官特異性實